王孝芳，梅新蘭，黃大鵬，徐大兵，楊天杰，韋 中?，徐陽(yáng)春，沈其榮

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/作物免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心/資源節(jié)約型肥料教育部工程研究中心/國(guó)家有機(jī)類肥料工程技術(shù)研究中心，南京 210095；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064）

在經(jīng)濟(jì)作物種植區(qū)，由于化肥農(nóng)藥的長(zhǎng)期過(guò)量投入和經(jīng)濟(jì)作物單一連作，導(dǎo)致土傳病害頻發(fā)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。土傳病害是高強(qiáng)度利用下土壤生物功能退化的重要表現(xiàn)之一。以土傳青枯病為例，全國(guó)大部分地區(qū)均能檢測(cè)到該病害的致病菌（，簡(jiǎn)稱青枯菌），且能夠侵害200 多種重要的作物，被視為最嚴(yán)重的細(xì)菌性土傳病害。根際是土傳病原菌入侵植物的關(guān)鍵位點(diǎn)，病原菌通常利用寄主植物根際豐富的資源大量增殖，進(jìn)而入侵作物根系。大量研究表明，土壤中豐富的微生物，如細(xì)菌、真菌、病毒以及一些小型的原生生物等能夠有效抑制病害的發(fā)生，它們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、寄生、捕食等多種方式構(gòu)筑了抵御病原菌入侵植物根系的防線。有益菌芽孢桿菌因其較強(qiáng)的拮抗能力被廣泛應(yīng)用于土傳青枯病的防治。但土壤環(huán)境復(fù)雜多變，溫度、濕度、養(yǎng)分等均能夠影響有益菌的生防效果，生產(chǎn)上施用單一有益菌的防控效果通常不穩(wěn)定。有益菌在植物根際穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮生防作用的關(guān)鍵，為提高有益菌的生防效率，本研究提出為有益菌提供載體，提高其在根際的定殖能力。

生物質(zhì)炭作為一種具有吸附性能的多孔性材料，在改善土壤結(jié)構(gòu)、肥力的同時(shí)，可為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，是有益菌載體的良好選擇。富含碳的生物質(zhì)在無(wú)氧或缺氧條件下經(jīng)過(guò)高溫裂解生產(chǎn)出一種高度芳香化、富含碳素的多孔固體顆粒物質(zhì)，其具有巨大的表面積和多孔結(jié)構(gòu)，能夠吸附根系分泌物。研究表明，生物質(zhì)炭能夠吸附或轉(zhuǎn)移植物根系分泌物中低分子量物質(zhì)，限制病原菌入侵。另一方面，生物質(zhì)炭多孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)菌的生長(zhǎng)和增殖提供合適的棲息地和資源，有利于微生物在生物質(zhì)炭孔徑表面形成生物膜，生物質(zhì)炭還能夠顯著改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。有研究表明，生物質(zhì)炭能夠一定程度上去除連作土壤中的化感物質(zhì)殘留，降低蘆葦根腐病的發(fā)生；桉樹樹木和溫室有機(jī)廢料制成的生物質(zhì)炭能夠有效降低黃瓜猝倒病的發(fā)生。但以生物質(zhì)炭作為有益菌載體的研究相對(duì)較少，其中的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)以番茄土傳青枯病為病理模型，研究玉米秸稈、木塊和稻殼3 種不同原料制備的生物質(zhì)炭為載體，對(duì)有益菌——解淀粉芽孢桿菌T-5防控土傳青枯病效果的影響，并從“空間”和“資源”轉(zhuǎn)移的角度，探究生物質(zhì)炭與有益菌聯(lián)合抑菌的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：青枯菌，分離自南京市麒麟鎮(zhèn)發(fā)病番茄根際強(qiáng)致病力的青枯菌QL-Rs1115（簡(jiǎn)稱RS），以及QL-Rs1115 的紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記菌株QL-RFP（簡(jiǎn)稱RS-RFP）。有益菌，分離自發(fā)病區(qū)的健康番茄根際，具有較強(qiáng)抑菌能力的解淀粉芽孢桿菌T-5。

供試生物質(zhì)炭：裂解溫度為400℃，分別為南京勤豐秸稈科技有限公司的玉米秸稈生物質(zhì)炭（maize straw）、南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院環(huán)境工程系的木塊（松木）生物質(zhì)炭（wood）和稻殼生物質(zhì)炭（rice husk）。

1.2 生物質(zhì)炭基礎(chǔ)特性檢測(cè)

利用pH 計(jì)（Sartorius PB-10，Goettingen，德國(guó)）對(duì)炭水比為1∶20（w∶v）的生物質(zhì)炭懸液測(cè)定pH。利用比表面積及孔徑分析儀（V-Sorb 2008P，金埃譜，北京）測(cè)定生物質(zhì)炭的比表面積。利用亞甲基藍(lán)吸附試驗(yàn)測(cè)定生物質(zhì)炭物理吸附能力。

1.3 盆栽試驗(yàn)方法

Micro-Tom 番茄種子經(jīng)表面消毒后，30 ℃催芽?jī)商旌蟛シN至育苗盤中。三至四葉期番茄苗移栽至6 孔大育苗盤中，每孔大約600 g 土，試驗(yàn)設(shè)置8 個(gè)處理：（1）僅接種青枯菌RS；（2）接種青枯菌和有益菌T-5；（3）～（5）接種青枯菌和三種生物質(zhì)炭；（6）～（8）接種青枯菌和有益菌及三種生物質(zhì)炭。青枯菌和有益菌接種懸液的制備方法：利用牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基活化青枯菌RS 和有益菌T-5，獲得單菌落轉(zhuǎn)接至 NA 液體培養(yǎng)基，30 ℃，170 r·min培養(yǎng)24 h。將新鮮菌液6 000 r·min常溫離心5 min，收集菌體，利用生理鹽水（9.5 g·kgNaCl）重懸并調(diào)節(jié)OD=1.0。有益菌與生物質(zhì)炭混合懸液的制備方法：生物質(zhì)炭與有益菌菌液混合，30 ℃、170 r·min震蕩2 h，使二者充分混勻吸附。移栽一周后，按照不同處理以灌根方式接種有益菌、生物質(zhì)炭及其混合懸液，其中有益菌的接種量為10CFU·g土，生物質(zhì)炭的接種量為10 g·kg（w∶w，生物質(zhì)炭：土壤）。接種有益菌和生物質(zhì)炭一周后接種青枯菌RS 菌液（10CFU·g土）。每個(gè)處理3 個(gè)6 孔育苗盤（3 個(gè)重復(fù)），共18 株番茄。所有的盆缽定期隨機(jī)移動(dòng)位置，減少誤差。溫室的溫度白天22～32 ℃，夜間20～25 ℃。5 周后番茄發(fā)病率趨于穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)植株的發(fā)病情況。從各處理的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取一株健康植株，保存根際土壤樣品，一部分用來(lái)提取土壤DNA，定量青枯菌的數(shù)量；一部分土壤樣品通過(guò)稀釋涂布檢測(cè)有益菌定殖的數(shù)量。

根際病原菌和拮抗菌數(shù)量的測(cè)定：利用 MO BIO 的強(qiáng)力土壤DNA 提取試劑盒（PowerSoilDNA Isolation Kit）提取根際土壤的DNA，檢測(cè)DNA 濃度和純度。病原菌數(shù)量的測(cè)定采用熒光定量PCR 的方法，使用SYBRPremix Ex Taq（Takara，寶生物工程有限公司）試劑盒。擴(kuò)增引物為青枯菌的特異性引物，F(xiàn)：5′-GAACGCCAACGGTGCGAA CT-3′，R：5′-GAACGCCAA CGGTGCGAACT-3′，濃度為10 pmol·μL；定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL：SYBRPremix Ex Taq（2×）10 μL，ROX reference Dye II（50×）0.4 μL，前端引物 0.8 μL，末端引物 0.8 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddHO 6 μL；反應(yīng)步驟為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，返回第二步，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性表現(xiàn)為單一的熔融峰，且2%凝膠電泳檢測(cè)僅為一條條帶。有益菌數(shù)量的測(cè)定采用選擇性平板稀釋涂布法：稱取根際土3 g，加27 mL 無(wú)菌ddHO，37 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，梯度稀釋涂布于通用的芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基（V8 培養(yǎng)基：V8 果蔬汁326 mL·L，氯化鈉 33.0 g·L，葡萄糖0.8 g·L，調(diào)節(jié)pH 至6.0。倒平板前加入放線菌酮 45 mg·L，多黏菌素22.5 mg·L）。37 ℃培養(yǎng)48 h 后，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)。以不接種有益菌T-5 的處理為對(duì)照，接種有益菌后根際增加的芽孢桿菌來(lái)表征有益菌的定殖數(shù)量。

1.4 室內(nèi)試驗(yàn)方法

生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的吸附試驗(yàn)： 采用Rivera-Utrilla 等報(bào)道的方法檢測(cè)生物質(zhì)炭對(duì)細(xì)菌吸附能力。將活化的RS 菌液用生理鹽水洗滌重懸，調(diào)節(jié)OD為0.5（～10CFU·mL）。將0.1 g 生物質(zhì)炭和 10 mL RS 菌液混合，放置于 30 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，取出靜置15 min，吸取上清液進(jìn)行稀釋，涂布于SMSA 培養(yǎng)基（semiselective medium for South Africa，半選擇性培養(yǎng)基），以未經(jīng)生物質(zhì)炭處理的菌液為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。與對(duì)照相比，生物質(zhì)炭處理后青枯菌的相對(duì)減少量用來(lái)表征生物質(zhì)炭吸附青枯菌的能力。

生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的固持作用試驗(yàn)：利用青枯菌對(duì)根系分泌物的趨化試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)青枯菌逃離生物質(zhì)炭的能力，從而評(píng)估生物質(zhì)炭固持青枯菌的能力。采用Rudrappa 等毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定青枯菌的趨化能力：將生物質(zhì)炭和青枯菌菌液按照1∶100（w∶v，g∶mL）比例混合，30 ℃、170 r·min震蕩2 h。1 mL 注射器吸取100 μL 模擬根系分泌物培養(yǎng)基（RE 培養(yǎng)基），排凈氣泡；用無(wú)菌槍頭吸取生物質(zhì)炭與青枯菌混合懸濁液100 μL，將裝有RE培養(yǎng)基的注射器針頭從槍頭尖端插入，使兩者中的液體形成連通，以未經(jīng)生物質(zhì)炭處理的青枯菌菌液處理為對(duì)照，30 ℃恒溫靜置2 h 后，對(duì)注射器內(nèi)的液體進(jìn)行稀釋涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物的吸附試驗(yàn)：將生物質(zhì)炭和根系分泌物（RE 培養(yǎng)基）按照1∶100（w∶v）混合，30 ℃、170 r·min搖床中震蕩2 h，懸液經(jīng)無(wú)菌的0.22 μm 水系濾膜過(guò)濾獲得無(wú)菌懸液，作為培養(yǎng)基接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（200 μL 體系）用于培養(yǎng)青枯菌RS（～10CFU·mL），以未經(jīng)生物質(zhì)炭處理的RE 培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定36 h 群落的OD值，以各處理中青枯菌的生長(zhǎng)間接表征生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物的吸附能力。

有益菌利用根系分泌物對(duì)青枯菌的抑制作用試驗(yàn)：含196 μL 根系分泌物（RE 培養(yǎng)基）的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種2 μL RS-RFP（～10CFU·mL），2 μL 有益菌T-5（～10CFU·mL），30 ℃，170 r·min震蕩培養(yǎng)，每隔6 h 用酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices，美國(guó)）測(cè)定群落的熒光值，表征青枯菌的生長(zhǎng)情況。30 μL 有益菌T-5 懸液（～10CFU·mL）接種至含3 mL RE 培養(yǎng)基中，30 ℃，170 r·min震蕩培養(yǎng)，分別在12、24、36 和48 h 取培養(yǎng)物，12 000 r·min常溫離心5 min，離心過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。利用平板對(duì)峙法檢測(cè)該發(fā)酵液的抑菌能力。具體做法如下：10 mL RS 懸液（～10CFU·mL）與100 mL 冷卻至50 ℃的NA 半固體培養(yǎng)基混合均勻，制備平板，待平板冷卻凝固后在中央打孔，添加50 μL 有益菌發(fā)酵物至孔中，30 ℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈的大小。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計(jì)分析，采用 SigmaPlot 12.5 作圖，并使用鄧肯（Duncan’s）新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性（＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 生物質(zhì)炭的基礎(chǔ)特性

3 種不同來(lái)源的生物質(zhì)炭的pH 均大于8，且差異顯著（＜0.001，表1），其中木塊生物質(zhì)炭（wood）的pH 最低，為8.69。比表面積是影響生物質(zhì)炭吸附能力的重要物理指標(biāo)之一。3 種生物質(zhì)炭的比表面積存在較大的差異（＜0.001，表1），其中木塊生物質(zhì)炭的比表面積顯著高于其他2 種生物質(zhì)炭，達(dá)到395.9 m·g，玉米秸稈生物質(zhì)炭的比表面積最低。不同生物質(zhì)炭對(duì)亞甲基藍(lán)溶液的吸附能力存在較大的差異，木塊生物質(zhì)炭在24 h 的吸附總量達(dá)到116.4 mg·g，顯著高于其他兩種原料的生物質(zhì)炭（＜0.001，表1）。

表1 不同生物質(zhì)炭的理化特性Table 1 Physiochemical properties of biochar relative to sources

2.2 生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合防控青枯病的效果

與對(duì)照相比，有益菌或生物質(zhì)炭單獨(dú)處理均能夠降低青枯病的病情指數(shù)（有益菌單獨(dú)：0.004；生物質(zhì)炭單獨(dú)：＜0.001，圖1a）。有益菌與生物質(zhì)炭配合能夠進(jìn)一步提高有益菌防控青枯病效果，與有益菌單獨(dú)處理相比平均提高了89.34%。不同生物質(zhì)炭單獨(dú)施用時(shí)對(duì)青枯病病情指數(shù)的影響差異顯著（= 0.047），但與有益菌聯(lián)合后處理間差異不顯著。木塊生物質(zhì)炭與有益菌組合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，顯著提高了青枯病的防控效率，與木塊生物質(zhì)炭單獨(dú)處理相比提升了18.61%。

進(jìn)一步檢測(cè)番茄根際青枯菌的數(shù)量，結(jié)果表明，與僅接種青枯菌的對(duì)照處理相比，添加有益菌或3種不同來(lái)源生物質(zhì)炭均能降低根際病原菌數(shù)量（有益菌單獨(dú)：0.001；生物質(zhì)炭單獨(dú)：＜0.001，圖1b）。不同生物質(zhì)炭與有益菌聯(lián)合時(shí)對(duì)根際病原菌數(shù)量的影響差異顯著（＜0.001，圖1b）。其中木塊生物質(zhì)炭與有益菌聯(lián)合效果最佳，降低了97.42%的病原菌入侵根際。

生物質(zhì)炭作為有益菌載體同時(shí)添加時(shí)，能夠顯著提高有益菌在根際的定殖（＜0.001，圖1c）。與直接接種有益菌的處理相比，玉米秸稈和木塊生物質(zhì)炭處理下有益菌定殖量分別提高了 5.73 倍和5.71 倍。

圖1 不同生物質(zhì)炭聯(lián)合有益菌處理對(duì)青枯病病情指數(shù)（a）、根際青枯菌（b）和有益菌（c）定殖的影響Fig. 1 Effect of combined application of biochar and probiotics on disease index (a) and population of pathogens (b) and probiotic colonization(c) in rhizosphere soil relative to kind of the biochar

2.3 生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合抑制青枯菌的機(jī)制

利用室內(nèi)模擬試驗(yàn)探究生物質(zhì)炭聯(lián)合有益菌防控青枯病的潛在機(jī)制。首先檢測(cè)不同生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的直接吸附作用，涂布計(jì)數(shù)結(jié)果表明，不同生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的吸附效率平均達(dá)到80.42%，處理之間差異顯著（0.001，圖2a）。其中，木塊生物質(zhì)炭的效果顯著優(yōu)于玉米秸稈和稻殼生物質(zhì)炭，對(duì)青枯菌的吸附效果最佳，能夠吸附88.45 %的青枯菌（圖2a）。

利用趨化試驗(yàn)檢測(cè)不同生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的固持作用。不同生物質(zhì)炭的固持效果差異明顯，由高到低依次為：木塊生物質(zhì)炭、玉米秸稈生物質(zhì)炭、稻殼生物質(zhì)炭（0.001，圖2b）。木塊生物質(zhì)炭的固持效果顯著高于其他兩種生物質(zhì)炭，阻止94.66%的青枯菌逃離生物質(zhì)炭。

圖2 不同生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的吸附（a）和固持（b）能力Fig. 2 Biochar’s R. solanacearum adsorption (a) and the retention (b) capacities relative to kind of the biochar

利用不同生物質(zhì)炭吸附根系分泌物，然后檢測(cè)青枯菌利用這些根系分泌物的能力，以青枯菌的生長(zhǎng)情況間接表征生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物的吸附能力。青枯菌在經(jīng)生物質(zhì)炭吸附后的根系分泌物中的生長(zhǎng)明顯受到抑制，說(shuō)明根系分泌物中部分有效營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被生物質(zhì)炭吸附，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致青枯菌生長(zhǎng)受阻。3 種生物質(zhì)炭中，木塊生物質(zhì)炭和玉米秸稈生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物的吸附顯著高于稻殼生物質(zhì)炭（0.001，圖3a）。

以上研究說(shuō)明生物質(zhì)炭能夠有效吸附根系分泌物，進(jìn)一步分別利用共培養(yǎng)體系和平板對(duì)峙的方法，評(píng)估有益菌利用根系分泌物對(duì)青枯菌的營(yíng)養(yǎng)和拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用。青枯菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)隨時(shí)間呈現(xiàn)“S”形，當(dāng)與有益菌T-5 共培養(yǎng)時(shí)，青枯菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖3b）且抑菌效果穩(wěn)定。拮抗競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果表明有益菌以根系分泌物為營(yíng)養(yǎng)時(shí)，能夠顯著抑制青枯菌的生長(zhǎng)，且抑菌效果隨著時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在36 h 有益菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性最高，抑菌圈最大（圖3c）。

圖3 不同生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物的吸附能力（a）及有益菌利用根系分泌物對(duì)青枯菌的抑制作用（b，c）Fig. 3 Biochar’s root exudate adsorption rate (a) and effect of probiotics utilizing root exudates and inhibiting R. solanacearum (b，c)

3 討 論

3.1 生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合能夠有效抑制病原青枯菌入侵

生物質(zhì)炭是集肥料、改良劑和吸附劑于一體的多孔性材料，在土傳病害的防控中表現(xiàn)出巨大的潛力。本研究提出以生物質(zhì)炭作為有益菌的載體，充分發(fā)揮生物質(zhì)炭的物理吸附作用和有益菌高效抑菌的優(yōu)勢(shì)，減少根際病原菌可利用的資源，增強(qiáng)有益菌根際定殖能力，最終提高有益菌的防控效果。以3 種不同原料制備的生物質(zhì)炭為載體，利用盆栽試驗(yàn)探究生物質(zhì)炭對(duì)有益菌防控番茄土傳青枯病效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合能有效降低青枯病的發(fā)病指數(shù)和根際病原菌數(shù)量（圖1a 和圖1b）。不同生物質(zhì)炭作為載體對(duì)有益菌生防效果的增強(qiáng)作用存在差異，其中木塊生物質(zhì)炭的效果最好。這可能與木塊生物質(zhì)炭具有較大的比表面積和物理吸附能力有關(guān)。三種生物質(zhì)炭中，木塊生物質(zhì)炭的比表面積達(dá)到396.9 mm，吸附能力達(dá)到了116.4 mg·g，顯著優(yōu)于其他兩種生物質(zhì)炭（表1）。研究表明，生物質(zhì)炭的物理性質(zhì)（表面面積和孔結(jié)構(gòu)）和化學(xué)性質(zhì)（表面化學(xué)性質(zhì)）共同決定生物質(zhì)炭的吸附能力，而生物質(zhì)炭的吸附能力是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。所以，木塊生物質(zhì)炭的大比表面積和強(qiáng)吸附性能一定程度解釋木塊生物質(zhì)炭載體聯(lián)合有益菌對(duì)土傳青枯病的防控效果最佳。與單獨(dú)接種有益菌相比，本研究發(fā)現(xiàn)，以不同生物質(zhì)炭為有益菌的接種載體，能夠顯著提高有益菌在根際的定殖能力（圖1c）。生物質(zhì)炭的施用可增加土壤的碳儲(chǔ)量、土壤的肥力和質(zhì)量。大量研究表明，生物質(zhì)炭能夠通過(guò)改變土壤微生物的生境或直接影響微生物的代謝調(diào)控根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。生物質(zhì)炭豐富的孔隙結(jié)構(gòu)和巨大的表面積能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁┍幼o(hù)所；生物質(zhì)炭顆粒上附著的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可為微生物的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分；生物質(zhì)炭通過(guò)改善微生物生長(zhǎng)的土壤特性（包括通氣條件、水含量和pH）來(lái)改變微生物棲息地等。

3.2 生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合抑制病原青枯菌可能的機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭能夠直接吸附青枯菌，吸附效率達(dá)到88.45%（圖2a）。但青枯菌處于動(dòng)態(tài)過(guò)程，一旦生物質(zhì)炭?jī)?nèi)部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡或外界出現(xiàn)信號(hào)物質(zhì)的誘導(dǎo)，青枯菌隨時(shí)會(huì)逃逸出生物質(zhì)炭。所以生物質(zhì)炭不僅需要有效吸附青枯菌，還需有較強(qiáng)的固持能力。前人研究很少同時(shí)評(píng)估生物質(zhì)炭的吸附和固持能力，本試驗(yàn)利用離體的趨化性試驗(yàn)，模擬了生物質(zhì)炭對(duì)青枯菌的固持作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭能夠有效阻止青枯菌的逃逸，其中生物質(zhì)炭的固持效果達(dá)到94.66%（圖2b）。生物質(zhì)炭對(duì)病原青枯菌的吸附作用除了與其強(qiáng)吸附能力有關(guān)，還可能與生物質(zhì)炭吸附根系分泌物資源、誘導(dǎo)青枯菌進(jìn)入生物質(zhì)炭有關(guān)。有研究表明，生物質(zhì)炭能夠通過(guò)吸附根系分泌物而驅(qū)動(dòng)病原菌的趨化作用。植物根系分泌的糖、氨基酸和有機(jī)酸等物質(zhì)是有益菌和病原青枯菌根際營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的核心。除了直接吸附、固持病原菌，本研究還發(fā)現(xiàn)3 種生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物也有一定的吸附作用（圖3a）。通常，青枯菌和有益菌之間爭(zhēng)奪資源的“戰(zhàn)場(chǎng)”在根際，但隨著生物質(zhì)炭對(duì)根系分泌物、青枯菌和有益菌的吸附作用，“主戰(zhàn)場(chǎng)”隨之轉(zhuǎn)移至生物質(zhì)炭?jī)?nèi)部。前期研究也發(fā)現(xiàn)多種不同資源存在時(shí)，能夠同時(shí)促進(jìn)有益菌T-5 的生長(zhǎng)和產(chǎn)拮抗物質(zhì)的能力。共培養(yǎng)和對(duì)峙試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，在模擬根系分泌物中，有益菌能夠有效利用根系分泌物，抑制青枯菌的生長(zhǎng)（圖3b，圖3c）。說(shuō)明有益菌以生物質(zhì)炭為載體，能夠高效利用根系分泌物資源，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)抑制病原青枯菌的生長(zhǎng)。

基于現(xiàn)有的結(jié)果，本研究提出生物質(zhì)炭作為有益菌載體，增強(qiáng)有益菌抵御病原青枯菌入侵番茄根際的潛在機(jī)制，如圖4 所示：首先，生物質(zhì)炭吸附根系分泌物和青枯菌，誘導(dǎo)青枯菌離開根表，進(jìn)入生物質(zhì)炭孔隙中（過(guò)程1）；然后，生物質(zhì)炭?jī)?nèi)部青枯菌因生物質(zhì)炭的強(qiáng)吸附能力，固持了青枯菌，降低其逃逸（過(guò)程2）；最后，生物質(zhì)炭吸附的有益菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)根系分泌物資源，減少病原菌資源的可利用性，同時(shí)產(chǎn)生大量的抑菌物質(zhì)，抑制病原菌的生長(zhǎng)（過(guò)程3）。因?yàn)榍嗫菥c有益菌的互作“戰(zhàn)場(chǎng)”轉(zhuǎn)移至生物質(zhì)炭?jī)?nèi)部，極大減少直接侵害植物的病原菌數(shù)量。本研究中生物質(zhì)炭雖然不能去除根際土壤中的病原青枯菌，但結(jié)合有益菌的抑菌作用，能夠有效降低青枯病的發(fā)生。下階段將會(huì)進(jìn)一步從植物根際原位探究生物質(zhì)炭載體與有益菌聯(lián)合抑制青枯菌的機(jī)制。

圖4 有益菌-生物質(zhì)炭復(fù)合抑制青枯菌入侵番茄根系的作用機(jī)制Fig. 4 Mechanism of probiotics- biochar on inhibiting R. solanacearum from invading tomato roots

4 結(jié) 論

不同原料制備的生物質(zhì)炭作為有益菌的載體，能夠有效提高有益菌對(duì)番茄土傳青枯病的防控效果，青枯病的發(fā)病率和根際病原菌數(shù)量均有不同程度的下降，其中比表面積大、吸附能力強(qiáng)的木塊生物質(zhì)炭的增效作用最強(qiáng)。進(jìn)一步研究其中的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭作為有益菌的載體能夠有效提高有益菌在根際的定殖，同時(shí)能夠有效吸附和固持病原菌，對(duì)根系分泌物也有一定的吸附作用。說(shuō)明生物質(zhì)炭可能通過(guò)“營(yíng)養(yǎng)”和“空間”轉(zhuǎn)移作用提高有益菌的生防效率。