應(yīng)漢超，李 輝，陳 丹，熊姍姍，江心白，李健生，孫秀云，韓衛(wèi)清，劉曉東，沈錦優(yōu)

(1.南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094；2.安徽紅星機(jī)電科技股份有限公司，安徽 合肥 231635)

N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)是一種無色透明油狀液體，微有胺的氣味，屬于含氮雜環(huán)化合物，分子式為C5H9NO。NMP是一種典型的有機(jī)極性溶劑，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、高極性和低揮發(fā)性，能與水或其他許多有機(jī)溶劑無限混溶，近年來作為有機(jī)化工溶劑應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域[1]。NMP在化學(xué)工業(yè)中的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致其通過各種途徑排放到自然環(huán)境中。據(jù)估計(jì)，每年大約有2 400多噸NMP通過廢水排放或轉(zhuǎn)移進(jìn)入到自然環(huán)境中[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，NMP對(duì)人體健康顯示出某些毒性，例如它會(huì)引起頭痛，對(duì)呼吸系統(tǒng)和眼睛會(huì)產(chǎn)生刺激等[3]。因此，需要盡快找到一種有效的處理方法來解決NMP污染對(duì)環(huán)境的威脅問題?，F(xiàn)有的含NMP廢水的處理方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物法，如表1所示。其中物理法和化學(xué)法，比如精餾法[4]、光催化氧化法[5]和芬頓氧化法[6]等，處理NMP廢水會(huì)消耗大量的化學(xué)藥品，而且可能會(huì)造成二次污染，這些方法在實(shí)際應(yīng)用中常常受到限制。生物法因其耗費(fèi)少和環(huán)境友好性，是一種處理含各種難降解污染物廢水的有前途的主流技術(shù)[7-9]。其中好氧生物處理法曝氣的能源成本較高，并且常產(chǎn)生大量的剩余污泥需要處理處置。由于NMP具有生物毒性，常規(guī)的生物處理方法中生物活性受到抑制，導(dǎo)致處理效果不佳[10，11]。傳統(tǒng)的厭氧生物處理技術(shù)雖然工藝簡(jiǎn)單、運(yùn)行費(fèi)用低、產(chǎn)生的污泥量少，但面臨著處理效率低、產(chǎn)物處理不徹底、系統(tǒng)穩(wěn)定性差等問題。因此，針對(duì)含NMP等雜環(huán)化合物的廢水，開發(fā)一種高效、低耗的處理技術(shù)，具有重要意義。

表1 各種NMP廢水處理方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

近年來，將厭氧生物處理技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的生物電化學(xué)技術(shù)是廢水處理及能源回收領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。生物電化學(xué)系統(tǒng)的陰陽(yáng)極，往往具有理想的氧化還原電位，使得電化學(xué)活性微生物具有高效的電子轉(zhuǎn)移能力。電化學(xué)活性微生物是一類能夠進(jìn)行胞外電子傳遞的微生物，在環(huán)境污染物尤其是難降解污染物的生物降解轉(zhuǎn)化過程中起到了重要作用。作為生物電化學(xué)系統(tǒng)的一個(gè)分支，電刺激厭氧微生物系統(tǒng)(Electricitystimulated anaerobic system，ESAS)是一種以厭氧過程為中心的生物系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)這一系統(tǒng)的外加電壓，以實(shí)現(xiàn)污染物的生物強(qiáng)化降解過程。與以產(chǎn)電為主要目標(biāo)的微生物燃料電池(Microbial fuel cell，MFC)不同，ESAS主要是通過外加電壓來調(diào)節(jié)生物催化的難降解污染物氧化還原過程，其核心是活性微生物與電極之間的相互作用，其中電子通過兩種最基本的機(jī)制在微生物與電極之間交換，即直接胞外電子轉(zhuǎn)移和介導(dǎo)的胞外電子轉(zhuǎn)移[14-16]。在ESAS中，通過控制外加電壓，使具有電化學(xué)活性的微生物附著在電極上形成生物膜電極，通過系統(tǒng)中電子的轉(zhuǎn)移過程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)污染物在陰極還原、陽(yáng)極氧化，從而達(dá)到去除污染物的目的。Zhang等[12]采用電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)含2-氟苯胺的廢水進(jìn)行處理，相比于傳統(tǒng)的生物處理，電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)2-氟苯胺的脫氟速率和礦化速率分別提高了116%和43%。曹占平[13]等采用電刺激微生物系統(tǒng)還原降解五氯酚，降解率可以達(dá)到97%。

因此，本研究將包裹石墨氈的鈦網(wǎng)電極作為上流式厭氧污泥床反應(yīng)器的陰陽(yáng)極，外加電壓組成單室電刺激微生物反應(yīng)器。選取NMP為處理對(duì)象，研究電刺激厭氧微生物反應(yīng)器對(duì)NMP的去除可行性，探究影響NMP去除速率的關(guān)鍵因素，推測(cè)可能的NMP降解途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

本試驗(yàn)所使用的電刺激微生物系統(tǒng)反應(yīng)器示意圖如圖1所示。

圖1 電刺激微生物系統(tǒng)反應(yīng)器示意圖

此反應(yīng)器由內(nèi)徑為12 cm、高度為20 cm的圓柱形亞克力有機(jī)玻璃所制，有效體積約為2.3 L。反應(yīng)器下部為陰極區(qū)，上部為陽(yáng)極區(qū)，外層由水浴層包裹，水浴水下進(jìn)上出。由石墨氈包裹的鈦網(wǎng)作為陰陽(yáng)兩個(gè)電極，鈦網(wǎng)的直徑為11.5 cm。在陰陽(yáng)兩極中間設(shè)置一個(gè)Ag/AgCl參比電極，陰極和陽(yáng)極用直徑為1 mm的鈦絲牽出，以測(cè)量?jī)蓸O的電位。模擬廢水由反應(yīng)器底部進(jìn)入，先流經(jīng)下部的陰極區(qū)，再流經(jīng)上部的陽(yáng)極區(qū)，陰極區(qū)和陽(yáng)極區(qū)的間距為2.5 cm。設(shè)置一個(gè)完全相同的反應(yīng)器裝置(開路)作為厭氧生物對(duì)照平行試驗(yàn)，兩個(gè)反應(yīng)器同時(shí)運(yùn)行。

1.2 接種污泥與模擬廢水

接種污泥采用試驗(yàn)室先期培養(yǎng)的處理含NMP廢水的厭氧污泥，初始混合液懸浮固體濃度約為15 g/L。本研究所使用的試驗(yàn)用水為人工配制的NMP模擬廢水，模擬廢水的組成如下:Na2HPO4·12H2O為1.45 g/L，NaH2PO4·2H2O為0.46 g/L，MgSO4·7H2O為0.2 g/L，CaCl2為0.05 g/L。NMP和乙酸鈉濃度根據(jù)不同的試驗(yàn)階段確定。模擬廢水在使用前先在120℃的壓力蒸汽滅菌鍋中滅菌40 min，隨后再曝氮?dú)?0 min以去除水中的溶解氧。添加乙酸鈉主要是為了在NMP的還原過程中提供電子，厭氧微生物可以利用乙酸鈉作為生長(zhǎng)所需碳源，代謝產(chǎn)生的電子通過胞外電子傳遞實(shí)現(xiàn)NMP的還原。外加電壓根據(jù)各參考文獻(xiàn)中記錄的電刺激微生物系統(tǒng)的外加電壓，綜合考慮外加電壓從0開始以0.1 V的增量增加。進(jìn)水NMP根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)排放廢水中可能達(dá)到的濃度進(jìn)行設(shè)置。

1.3 分析方法

混合液懸浮物(Mixed liquor suspended solids，MLSS)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。NMP的濃度通過高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)進(jìn)行鑒定和定量，HPLC條件:水樣經(jīng)0.22μm濾頭過濾，10μL過濾液注入HPLC。使用C18柱在30℃柱溫和214 nm紫外-可見波長(zhǎng)下進(jìn)行HPLC分析，流動(dòng)相為20%甲醇和80%超純水(v/v)，以1.0 mL·min-1的流速泵送?？傆袡C(jī)碳(Total organic carbon，TOC)在TOC分析儀上測(cè)量。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)對(duì)NMP降解的中間產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，HPLC-MS條件:正離子檢測(cè)；離子源噴射電壓:5 kV；毛細(xì)管溫度:320℃；毛細(xì)管電壓:15 V；鞘氣:氮?dú)?；鞘氣流?45 arb、輔助氣流速:15 arb；碰撞氣:氦氣；液相色譜儀進(jìn)樣，溶液流速0.2 mL·min-1。采用16S rRNA Ilumina基因測(cè)序方法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同體系下NMP降解效果對(duì)比

試驗(yàn)對(duì)比了電化學(xué)系統(tǒng)、厭氧生物系統(tǒng)以及電刺激微生物系統(tǒng)3種體系對(duì)NMP的降解，去除效果比較如圖2所示。電化學(xué)系統(tǒng)試驗(yàn)條件:外加電壓0.4 V，進(jìn)水NMP負(fù)荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸鈉濃度800 mg/L，不添加活性污泥；厭氧生物系統(tǒng)試驗(yàn)條件:進(jìn)水NMP負(fù)荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸鈉濃度800 mg/L，無外加電壓；電刺激微生物系統(tǒng)試驗(yàn)條件:外加電壓0.4 V，進(jìn)水NMP負(fù)荷10.10 mol·m-3·d-1，乙酸鈉濃度800 mg/L。

圖2 不同體系下進(jìn)出水負(fù)荷以及NMP去除效果對(duì)比

電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)NMP的去除率(約80%)比單純的電化學(xué)系統(tǒng)(約13%)和厭氧生物系統(tǒng)(約55%)都要好，并且比電化學(xué)系統(tǒng)和厭氧生物系統(tǒng)兩者去除率之和還要高約12%，說明電刺激和微生物在對(duì)NMP的降解過程中存在協(xié)同作用，大大地增強(qiáng)了NMP的去除效果。在電刺激微生物系統(tǒng)中，微生物的降解起到主導(dǎo)作用，外加電壓起到輔助的作用，促進(jìn)微生物對(duì)NMP的降解。微生物降解NMP時(shí)，NMP還原降解所需要的電子主要來自于微生物代謝乙酸鈉，有限的電子供體外加量和微生物的活性限制了NMP的還原速率。當(dāng)提供電刺激后，電輔助陰極在較低的電位下可以提供更多NMP還原所需電子的同時(shí)，可能促進(jìn)了某些功能微生物的生長(zhǎng)和活性，從而實(shí)現(xiàn)NMP的強(qiáng)化降解。在電化學(xué)系統(tǒng)中，較低的電壓不能達(dá)到較好的去除效果，若提供較高的電壓，又會(huì)消耗大量的能源，造成高額的處理成本，不利于實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，綜合各方面條件來說，電刺激微生物系統(tǒng)不僅對(duì)NMP有著不錯(cuò)的去除效果，而且還降低了污染廢水的處理成本，為NMP的處理提供了一條新思路。

2.2 關(guān)鍵因素對(duì)系統(tǒng)去除NMP效果的影響

2.2.1 外加電壓

在這一階段試驗(yàn)中，進(jìn)水NMP負(fù)荷為10.10 mol·m-3·d-1，乙酸鈉濃度為800 mg/L，外加電壓分別為0 V、0.1 V、0.2 V、0.3 V、0.4 V，比較外加電壓對(duì)厭氧生物系統(tǒng)和電刺激微生物系統(tǒng)NMP去除效果的影響。

圖3 外加電壓對(duì)系統(tǒng)的影響

如圖3(a)所示，隨著外加電壓從0 V到0.4 V逐步增加，NMP的去除率也逐漸增加，在外加電壓為0.4 V時(shí)，NMP的去除率接近80%。外加電壓增加后，陽(yáng)極電位基本維持不變，陰極電位則逐步降低，這也能說明在外加電壓后，生物陰極具有更強(qiáng)的還原能力，提升了NMP的去除效果。在更負(fù)的陰極電位下，可以形成陰極的還原性微環(huán)境和陽(yáng)極的氧化性微環(huán)境，對(duì)NMP的降解更加有利。外加電壓是加速污染物快速降解的重要條件，為電刺激微生物系統(tǒng)提供了還原所必需的電子。提高外加電壓加速了電子傳遞效應(yīng)，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行，加快了污染物的降解。在厭氧生物系統(tǒng)中，NMP去除率有少許的提高，這可能是因?yàn)閰捬跎锵到y(tǒng)的啟動(dòng)時(shí)間比較長(zhǎng)，在此過程中微生物逐漸適應(yīng)環(huán)境，提升了去除效果。圖3(b)中，隨著外加電壓的增加TOC去除率有所提升。TOC去除率的提高說明了外加電壓的增大加強(qiáng)了NMP的降解礦化。

由這一階段試驗(yàn)數(shù)據(jù)得，在外加電壓為0～0.4 V的范圍內(nèi)，當(dāng)電壓為0.4 V時(shí)，電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)NMP的去除率最高。0.4 V的外加電壓相對(duì)較低，在試驗(yàn)中電量的消耗較低，這對(duì)于電刺激微生物系統(tǒng)的推廣應(yīng)用至關(guān)重要。為了探討電刺激厭氧微生物系統(tǒng)降解NMP的可行性及其涉及的內(nèi)在機(jī)理，后續(xù)試驗(yàn)將外加電壓控制在0.4 V，以進(jìn)一步探究其他參數(shù)對(duì)NMP降解過程的影響。

2.2.2 進(jìn)水NMP負(fù)荷

此階段試驗(yàn)在外加電壓為0.4 V，乙酸鈉濃度為800 mg/L的條件下進(jìn)行，在進(jìn)水NMP負(fù)荷分別為6.06 mol·m-3·d-1、8.08 mol·m-3·d-1、10.10 mol·m-3·d-1、12.12 mol·m-3·d-1的條件下比較NMP的去除效果以及TOC去除率的變化，結(jié)果如圖4所示。圖4中，fin表示進(jìn)水負(fù)荷。

圖4 進(jìn)水NMP負(fù)荷對(duì)系統(tǒng)的影響

當(dāng)進(jìn)水NMP負(fù)荷為6.06 mol·m-3·d-1時(shí)，電刺激微生物系統(tǒng)和厭氧生物系統(tǒng)中的去除效果較好，分別達(dá)到約93%和82%，隨著進(jìn)水NMP負(fù)荷的增加，兩個(gè)系統(tǒng)對(duì)NMP的去除效果都有所下降。當(dāng)進(jìn)水NMP負(fù)荷提升至12.12 mol·m-3·d-1時(shí)，兩個(gè)系統(tǒng)中NMP的去除率分別約為64%和42%。由于厭氧生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性較差，容易受到外界因素的干擾，所以厭氧生物系統(tǒng)的去除效果下降更加明顯，同時(shí)說明電刺激微生物系統(tǒng)具有更強(qiáng)的耐沖擊負(fù)荷能力，穩(wěn)定性更強(qiáng)。陰陽(yáng)兩極的電位隨著進(jìn)水NMP負(fù)荷的提升都有了一定的升高，說明系統(tǒng)的氧化還原能力有所下降。進(jìn)水NMP負(fù)荷的增加，導(dǎo)致兩個(gè)系統(tǒng)中NMP的去除率下降，所以TOC去除率也都呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

2.2.3 電子供體用量

這個(gè)階段試驗(yàn)在外加電壓為0.4 V，進(jìn)水NMP負(fù)荷為10.10 mol·m-3·d-1的條件下進(jìn)行，在乙酸鈉濃度分別為400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的條件下運(yùn)行反應(yīng)器，觀察NMP降解效果以及TOC去除率的變化，結(jié)果如圖5(a)、(b)所示。圖5中，CH3COONa表示乙酸納濃度。

圖5 乙酸納濃度對(duì)系統(tǒng)的影響

當(dāng)乙酸鈉的濃度為400 mg/L時(shí)，電刺激微生物系統(tǒng)和厭氧生物系統(tǒng)中NMP的去除率都比較低，分別約為59%和32%，隨著濃度上升到800 mg/L，兩個(gè)系統(tǒng)對(duì)NMP的去除效果都有提升，分別約為78%和55%，這可能是由于乙酸鈉作為電子供體，在加入乙酸鈉的濃度提升后，能夠提供更多的電子用于污染物的還原。乙酸鈉濃度的提升對(duì)厭氧生物系統(tǒng)的NMP去除效果有著更顯著的增強(qiáng)，說明厭氧生物系統(tǒng)還原降解NMP的過程中對(duì)乙酸鈉的依賴性更強(qiáng)。在電刺激微生物系統(tǒng)中，NMP一部分通過厭氧微生物代謝乙酸鈉提供的電子來降解，還有一部分是通過微生物用電極提供的電子來降解，所以此系統(tǒng)相比厭氧生物系統(tǒng)，對(duì)乙酸鈉濃度的變化具有更好的適應(yīng)性，更強(qiáng)的穩(wěn)定性。同時(shí)，TOC去除率呈上升趨勢(shì)，這也從側(cè)面驗(yàn)證了NMP的去除率隨著乙酸鈉濃度的提升而升高。

圖5(c)顯示的是乙酸鈉用量比(去除每摩爾NMP使用的乙酸鹽摩爾數(shù))。乙酸鈉的用量比與系統(tǒng)運(yùn)營(yíng)的成本有著直接關(guān)系。隨著乙酸鈉濃度從400 mg/L提升到800 mg/L，在電刺激微生物組中，乙酸鈉的添加量與NMP去除摩爾比從0.81上升到1.23，而厭氧生物組的乙酸鈉添加量與NMP去除摩爾比則從1.52上升到1.74，可以看出在不同乙酸鈉濃度下，電刺激微生物組的乙酸鈉用量比都明顯小于厭氧生物組，表明電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)電子供體的需求量較低。此外，降低乙酸鈉的用量可以很好地補(bǔ)償電刺激微生物系統(tǒng)中由于加電而產(chǎn)生的額外成本。

2.3 NMP降解產(chǎn)物分析及降解途徑推測(cè)

對(duì)電刺激微生物系統(tǒng)的出水先經(jīng)過預(yù)處理，然后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，得到如圖6(a)～(e)所示的液質(zhì)分析圖。在2.76～2.85 min時(shí)出現(xiàn)的99.85的峰為污染物NMP的峰，對(duì)其余譜圖計(jì)算分析后，猜測(cè)其中含有的物質(zhì)分別為琥珀酸半醛、琥珀酸、1-甲基吡咯烷-2-醇和N-甲基-4-氨基丁酸。

根據(jù)液質(zhì)分析得到的中間產(chǎn)物推測(cè)出NMP可能的降解途徑如圖6(f)所示。NMP首先在陰極區(qū)域被還原為1-甲基吡咯烷-2-醇，之后這一產(chǎn)物進(jìn)入陽(yáng)極區(qū)域開環(huán)并被氧化為N-甲基-4-氨基丁酸，然后N-甲基-4-氨基丁酸進(jìn)行下一步的脫氮過程，一部分通過氨化作用轉(zhuǎn)化產(chǎn)生氨氮，另一部分則被氧化為琥珀酸半醛、琥珀酸，最終被降解礦化，生成氫氣和二氧化碳。

圖6 NMP降解產(chǎn)物分析及降解途徑推測(cè)

2.4 微生物群落動(dòng)態(tài)變化分析

分別對(duì)接種污泥(Inoc)、厭氧對(duì)照組污泥(Rc)和電刺激試驗(yàn)組污泥(Re)進(jìn)行采樣收集，采用16S rRNA Ilumina基因測(cè)序方法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖7為3個(gè)樣品在細(xì)菌屬水平下的優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)豐度。

在Inoc樣品中占優(yōu)勢(shì)的菌屬主要是Bacteroidetes(10.04%)和Proteiniclasticum(8.96%)，Rc樣品與之相似，相對(duì)豐度分別為11.58%和14.42%。在Re樣品中，優(yōu)勢(shì)菌屬主要是Rhizobium(19.02%)、Bacteroidetes(6.88%)和Pseudomonas(8.86%)。有研究報(bào)道，Rhizobium和Pseudomonas具有降解含氮雜環(huán)化合物的功能[17，18]。同時(shí)，Rhizobium是已知的能夠產(chǎn)生胞外聚合物的菌種[19]。Pseudomonas廣泛存在于環(huán)境中，是已知的常見電化學(xué)活性菌，能夠利用各種電子供體進(jìn)行氮轉(zhuǎn)化[20]。另外有研究報(bào)道，Proteiniclasticum具有水解酸化的功能[21]，Bacteroidetes具有發(fā)酵的功能[22]。電刺激促進(jìn)了功能微生物的生長(zhǎng)和活性。

圖7 各樣品在細(xì)菌屬水平下的優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)豐度

3 結(jié)束語(yǔ)

針對(duì)傳統(tǒng)厭氧生物降解效率低下的問題，本文提出了一種電刺激厭氧微生物系統(tǒng)，強(qiáng)化了NMP的厭氧生物降解。在電刺激厭氧微生物系統(tǒng)中，微生物和電場(chǎng)之間存在著協(xié)同作用。電刺激提高了厭氧生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性，大大降低了電子供體需求量，促進(jìn)了NMP的去除。在外加電壓為0.4 V，進(jìn)水負(fù)荷為6.06 mol·m-3·d-1，乙酸鈉為800 mg/L的優(yōu)化條件下，電刺激微生物系統(tǒng)對(duì)NMP的去除率可達(dá)到93%，TOC去除率接近90%。最后結(jié)合鑒定出的中間產(chǎn)物提出了在電刺激微生物系統(tǒng)中促進(jìn)NMP厭氧生物降解的可能代謝機(jī)制。本研究為開發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)的有機(jī)污染物厭氧生物強(qiáng)化降解方法提供了新的思路。