林世團(tuán), 王曉雪, 陳冉

1. 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria), 也被稱為藍(lán)藻或藍(lán)綠藻, 屬于革蘭氏陰性菌(Sinha et al, 2008)。藍(lán)細(xì)菌能利用葉綠素、胡蘿卜素等光合色素進(jìn)行光合作用,是地球上一類能進(jìn)行放氧光合作用的原核生物(Aguilera et al, 2021)。藍(lán)細(xì)菌種類豐富, 分布廣泛且形態(tài)多樣, 包含6 個(gè)目2000 多個(gè)種(Stanier et al,1977)。浮游藍(lán)細(xì)菌是海洋食物網(wǎng)的主要生產(chǎn)者, 是全球碳循環(huán)和氮循環(huán)中不可或缺的角色(Bullerjahn et al, 2014; Tang et al, 2019)。此外, 藍(lán)細(xì)菌具有生長(zhǎng)速度快、遺傳操作簡(jiǎn)單和生理功能多樣等特性, 是研究生物基因型(Do Carmo Bittencourt-Oliveira et al,2012; G?ga?a et al, 2014; Belykh et al, 2015; Song et al, 2015)、表型(Berrendero et al, 2011; Dojani et al,2014)和生態(tài)型(D’Agostino et al, 2014; Chandler et al,2016; Marston et al, 2016; Sohm et al, 2016)之間關(guān)系的重要模式生物。

集胞藻PCC6803(Synechocystissp. PCC6803)和聚球藻WH7803(Synechococcussp. WH7803)分別是研究淡水和海水藍(lán)細(xì)菌的模式菌株。單細(xì)胞淡水集胞藻PCC6803 是首個(gè)完成基因組序列測(cè)定的藍(lán)細(xì)菌(Kaneko et al, 1995, 1996)?；蚪M大小為3573471bp(base pair), 每個(gè)細(xì)胞具有12 個(gè)基因組拷貝(Labarre et al, 1989), 編碼3317 個(gè)基因。集胞藻PCC6803 還具有7 個(gè)環(huán)形質(zhì)粒, 大小在2.3～119kb 之間(Chauvat et al, 1986; Prindle, 2015)。海水藍(lán)細(xì)菌與淡水藍(lán)細(xì)菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 主要成員為原綠球藻(Prochlorococcus)和聚球藻兩個(gè)屬。原綠球藻主要分布營(yíng)養(yǎng)貧乏的溫暖海域, 而聚球藻的生態(tài)分布更為廣泛, 從赤道的溫暖海域到次極地低溫水域, 從富營(yíng)養(yǎng)的河口到寡營(yíng)養(yǎng)的海洋水域。聚球藻是一種超微型單細(xì)胞原核藻類, 大小僅為1～2μm(Partensky et al, 1999), 因而直到1979 年才得以在海洋中被發(fā)現(xiàn)。目前研究的海洋聚球藻的大多數(shù)為單倍體, 僅含有單個(gè)染色體。然而海洋聚球藻WH7803 的染色體具有多個(gè)拷貝,一般含有4 個(gè)染色體拷貝, 基因組大小為2366980bp。

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系統(tǒng)是原核系統(tǒng)中由相鄰的2 個(gè)或3 個(gè)基因組成的基因元件。其中毒素基因編碼毒素蛋白, 起到抑菌或殺菌功能,而抗毒素基因編碼蛋白或RNA, 通過(guò)直接或間接作用拮抗毒素的毒性(Dorman et al, 2001)。毒素-抗毒素系統(tǒng)具有多種功能, 包括能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝水平對(duì)抗外界的生長(zhǎng)壓力、參與細(xì)胞程序性死亡、參與“持留菌”形成、參與生物被膜形成以及抵御噬菌體侵染等生物過(guò)程(Wang et al, 2011)。目前依據(jù)抗毒素與毒素作用方式的不同, 將毒素-抗毒素系統(tǒng)分為7 種類型 (Ⅰ型至Ⅶ型)(Wang et al, 2021)。Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)中毒素和抗毒素皆為蛋白質(zhì), 通過(guò)毒素和抗毒素間的蛋白-蛋白的互作抑制毒素的毒性作用。

毒素-抗毒素系統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明, 藍(lán)細(xì)菌基因組分布著大量的毒素-抗毒素系統(tǒng)(Akarsu et al,2019)。然而目前只有極少數(shù)藍(lán)細(xì)菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)被研究?；谒{(lán)細(xì)菌生態(tài)位置的重要性和毒素-抗毒素功能的多樣性, 我們以淡水藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803 和海水藍(lán)細(xì)菌聚球藻WH7803 作為研究對(duì)象, 對(duì)其基因組進(jìn)行了毒素-抗毒素系統(tǒng)預(yù)測(cè)。并且選取集胞藻PCC6803 的5 對(duì)和聚球藻WH7803 的2 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)進(jìn)行毒性驗(yàn)證并對(duì)其蛋白進(jìn)行異源表達(dá)純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 的兩對(duì)毒素- 抗毒素系統(tǒng) BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 的毒素具有明顯的細(xì)胞毒性,且抗毒素能中和毒素毒性, 與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。本文的研究結(jié)果將有助于后續(xù)對(duì)藍(lán)細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)及其生態(tài)和生物學(xué)功能的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用的克隆模板集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803 基因組DNA 分別由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所張承才教授和香港科技大學(xué)曾慶璐教授饋贈(zèng)?；蚩寺『偷鞍妆磉_(dá)所用的菌株大腸桿菌(Escherichia coli) K12 BW25113, ER2738 和BL21(DE3) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存, 培養(yǎng)條件為37℃條件下Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)。菌株培養(yǎng)使用的抗生素為羧芐青霉素和硫酸卡那霉素, 工作濃度分別為100μg·mL-1和50μg·mL-1。

1.1.2 主要試劑

DNA 限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于NEB 公司(伊普斯威奇, 美國(guó)); 基因片段和載體同源重組使用的非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit)購(gòu)自諾唯贊公司(南京, 中國(guó)); DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)買自 OMEGA 公司(諾克羅斯, 美國(guó)); DNA 提取試劑盒購(gòu)于天根公司(北京, 中國(guó))。PCR 引物由天一輝遠(yuǎn)公司(廣州, 中國(guó))合成。蛋白純化過(guò)程中所使用的Ni-NTA 親和柱料購(gòu)自 Qiagen 公司(杜塞爾多夫,德國(guó))。

1.2 集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803 基因組TA系統(tǒng)預(yù)測(cè)分析

集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803 菌株中TA的預(yù)測(cè)主要結(jié)合以下兩種策略: (1)下載TADB 數(shù)據(jù)庫(kù) (Altschul, 1997)(https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB2/index.php)中已知的TA 蛋白序列, 通過(guò)本地 BLASTP 檢索這兩種菌株中和已知 TA 相似的蛋白序列(參數(shù): -evalue 1e-5); (2)兩種菌株的全部蛋白序列用InterProScan(version 5.35-74.0)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam domain)進(jìn)行注釋, 根據(jù)已知 TA 的結(jié)構(gòu)域初步篩選潛在TA。上述兩種TA 預(yù)測(cè)的結(jié)果再進(jìn)一步根據(jù)基因上下游“關(guān)聯(lián)犯罪”原則(guilt-byassociation)(Leplae et al, 2011)進(jìn)行篩選, 對(duì)于明確具有毒素或者抗毒素結(jié)構(gòu)域的但是上下游又沒(méi)有符合條件的基因, 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)在線工具ORF finder 對(duì)其上下游進(jìn)行預(yù)測(cè)分析潛在的新的開(kāi)放閱讀框(open reading frames, ORFs), 再結(jié)合結(jié)構(gòu)域注釋確定菌株中未注釋的新TA。所有備選基因通過(guò)Xtalpred 網(wǎng)站(https://xtalpred.godziklab.org/XtalPredcgi/xtal.pl)進(jìn)行已解析結(jié)構(gòu)的同類型蛋白的檢索和比對(duì)分析, 根據(jù)檢索結(jié)果確定備選基因類型。

1.3 分子生物學(xué)操作

分別選取預(yù)測(cè)結(jié)果中集胞藻PCC6803 的5 對(duì)和聚球藻WH7803 的2 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。將這7 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)的毒素(BAA17887, New ORF7, BAD01872, BAD01932, BAD01997,SynWH7803_1121, SynWH7803_1701) 和抗毒素(BAA17887, BAA18559, BAD01871, BAD01933,BAD01998, SynWH7803_1122, SynWH7803_1700)以及相對(duì)應(yīng)毒素-抗毒素合體的編碼區(qū)采用附表1 中的引物進(jìn)行擴(kuò)增, 使用one-step 方法連接至 pBAD質(zhì)粒。再將連接產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌 BW25113 中, 并使用含羧芐青霉素的 LB 平板進(jìn)行重組菌株篩選。使用 pBAD-f(5′-ATGCCATAGCATTTTTATCCA-3′) 和 pBAD-r(5′-TCT GATTTAATCTGTATCAGG-3′)進(jìn)行PCR 驗(yàn)證, 選取大小正確的克隆測(cè)序確認(rèn)。用于蛋白表達(dá)的重組菌株BL21(DE3)/pET28b(+)的構(gòu)建過(guò)程與上述相同。采用附表1 中的引物pUC19- pro-BAD1932-1933-f(5′-GAAAAAGAAGAATTGATGATGT-3′) 和pUC19-pro-BAD1932-1933-r(5′-CTAAAAGAGTC TTTCCACCGAT-3′)擴(kuò)增毒素-抗毒素系統(tǒng) BAD 1932-1933 及其啟動(dòng)子區(qū), 使用one-step 方法連接至pUC19 質(zhì)粒上。再將連接產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法,轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌ER2738 中, 并使用含羧芐青霉素的LB 平板進(jìn)行重組菌株篩選, 隨后使用M13-f和M13-r 通用引物PCR 驗(yàn)證并測(cè)序。最后將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BW25113 中,使用M13-f 和M13-r 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。

附表1 本文所用引物Tab. S1 Primers used in this study

1.4 重組菌株毒性的檢測(cè)

將過(guò)夜培養(yǎng)的重組菌株菌液用接種環(huán)分別劃線于含羧芐青霉素和0.3% L-阿拉伯糖的LB 平板, 并同時(shí)劃線于不含0.3% L-阿拉伯糖, 僅含羧芐青霉素的LB 平板作為對(duì)照, 于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,拍照記錄結(jié)果。

1.5 重組菌株生長(zhǎng)曲線及菌落形成單位的測(cè)定

pBAD 質(zhì)粒連接的重組菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜, 以初始濃度OD600≈0.1 轉(zhuǎn)接到裝有25mL 含有羧芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶,并加入 0.3% L-阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別取誘導(dǎo) 0、2、4、6 和8h 的菌液作梯度稀釋, 并取各梯度10μL 稀釋液點(diǎn)至LB 平板, 在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜, 拍照記錄并計(jì)算菌落形成單位(colony-forming units, CFU)。同時(shí)分別取誘導(dǎo)后0、2、4、6 和8h 的菌液測(cè)定 OD600, 并使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制。

1.6 質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定

將攜帶 pUC19-BAD01932-33 重組質(zhì)粒和pUC19 空質(zhì)粒的BW25113 菌株于含羧芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng), 以初始濃度OD600≈0.1轉(zhuǎn)接到3mL 含羧芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)12h 后, 取菌液進(jìn)行梯度稀釋, 并分別取10μL各梯度的稀釋液點(diǎn)在含羧芐青霉素和不含羧芐青霉素的LB 平板上, 該時(shí)間點(diǎn)記為0h。以0h 的菌液作為母液, 以1‰的體積比轉(zhuǎn)接至3mL LB 液體培養(yǎng)基中, 每隔12h 取菌液進(jìn)行梯度稀釋, 并分別取10μL各梯度的稀釋液點(diǎn)在含羧芐青霉素和不含羧芐青霉素的LB 平板上。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜, 拍照記錄并計(jì)算CFU。并使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性曲線的繪制。

1.7 蛋白序列的比對(duì)分析

從NCBI 網(wǎng)站下載所需蛋白序列, 采用Clustal X2 軟件進(jìn)行序列比對(duì), 再將比對(duì)生成的文件上傳至EsPript3.0 網(wǎng)站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi) 進(jìn)行比對(duì)結(jié)果的展示。

1.8 目的蛋白的原核表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化板置于37℃恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng), 第二天挑單菌落到20mL LB 培養(yǎng)基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取出過(guò)夜培養(yǎng)的20mL LB 培養(yǎng)基, 以1:100 的接種量接到500mL 培養(yǎng)基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒溫震蕩培養(yǎng)至 OD600達(dá)到 0.6～0.8, 加入終濃度為0.3mmol·L-1的異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG), 放入37℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 培養(yǎng)5h, 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。

蛋白純化步驟由菌液離心及菌體重懸、超聲破碎、高速離心、Ni-NTA 填料平衡、上清與填料結(jié)合、蛋白鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)等步驟組成。具體純化步驟如下:

1) 菌體重懸: 誘導(dǎo)5h 后的菌液離心去上清,沉淀用30mL Ni-NTA 緩沖液A 緩沖液重懸菌體到50mL 離心管中, 渦旋震蕩充分混勻后加入終濃度為1mmol·L-1的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)和 5mmol·L-1的β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol, β-Me);

2) 超聲破碎: 超聲強(qiáng)度為75%, 破碎10s, 間隔5s, 冰上破碎120s。取4μL菌液加入到400mL Bradford中, 如果Bradford 變藍(lán), 則說(shuō)明菌體已破碎好;

3) 高速離心: 將超聲破碎過(guò)后的菌液 4℃,23500×g, 離心1h, 分離上清與沉淀;

4) Ni-NTA 填料平衡: 取1mL 柱料, 3434 ×g 離心60s 后去除上清。管底柱料先用2 倍柱體積的Ni-NTA 緩沖液B 平衡Ni-NTA 填料。接著再用2倍柱體積的Ni-NTA 緩沖液A 平衡填料;

5) 上清與填料結(jié)合: 蛋白高速離心結(jié)束后, 將上清倒入50mL 離心管, 用吸管吸取2mL 上清重懸平衡好的填料, 再一起轉(zhuǎn)移到50mL 離心管; 4℃,低速旋轉(zhuǎn)結(jié)合1h。先使用低濃度咪唑的緩沖液對(duì)結(jié)合到Ni-NTA 填料上的雜蛋白進(jìn)行洗脫, 然后采用不同濃度的高濃度咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。收集的樣品使用Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋白的表達(dá)和洗脫情況。

2 結(jié)果

2.1 兩種藍(lán)細(xì)菌存在大量TA 系統(tǒng)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和本地比對(duì), 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,集胞藻 PCC6803 含有 51 對(duì)潛在的 TA, 聚球藻WH7803 只有潛在的10 對(duì)TA(見(jiàn)附表2、3)。并且根據(jù)集胞藻 PCC6803 的預(yù)測(cè)結(jié)果, 在不成對(duì)的毒素基因或者抗毒素基因上下游分析尋找配對(duì)的抗毒素和毒素基因, 得到了9 個(gè)未注釋的開(kāi)放閱讀框,命名為New ORF1-9?；陬A(yù)測(cè)結(jié)果, 我們進(jìn)行了不同類型 TA 的數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 質(zhì)粒分布有23 對(duì), 基因組分布有 28對(duì) TA(圖 1a)。VapBC(23 對(duì))、HicAB(9 對(duì))和HigAB(4 對(duì))系統(tǒng)是集胞藻PCC6803 基因預(yù)測(cè)的TA系統(tǒng)分布最多的三種類型(圖 1b)。相比于集胞藻PCC6803, 聚球藻WH7803 基因組上的毒素-抗毒素系統(tǒng)分布較少, 僅有10 對(duì)(見(jiàn)附表3)。

附表2 集胞藻. PCC6803 毒素-抗毒素系統(tǒng)預(yù)測(cè)信息Tab. S2 Prediction information of toxin-antitoxin systems in Synechocystis sp. PCC6803

續(xù)表

依據(jù)編碼基因的大小和方向, 兩個(gè)基因位置是否存在重疊以及與典型TA 結(jié)構(gòu)域和與同類型成員的序列相似度分析結(jié)果, 我們分別選取了集胞藻 PCC6803 預(yù)測(cè)結(jié)果中的 5 對(duì) TA 和聚球藻WH7803 預(yù)測(cè)結(jié)果中的2 對(duì) TA 進(jìn)行進(jìn)一步的分析和毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(表1)。選取的集胞藻PCC6803 的5 對(duì) TA 分別是: 位于質(zhì)粒 pSYSM 中的BAD01871-72、BAD01932-93、BAD01997-98和位于基因組中的BAA17887、BAA18559-New ORF7。BAA17887基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)為HicAB 融合蛋白,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其N 端1～58 個(gè)氨基酸殘基為HicA毒素蛋白, C 端 59～136 個(gè)氨基酸為HicB 抗毒素蛋白。另外,BAA18559-New ORF7中的毒素基因New ORF7在之前的報(bào)道中并沒(méi)有得到注釋, 為本文新注釋的開(kāi)放閱讀框。選取的聚球藻 SynWH7803_1121-22 和SynWH7803_1700-01 兩對(duì)TA 系統(tǒng)均位于基因組上。其余預(yù)測(cè)得到的TA 系統(tǒng)信息見(jiàn)附表2、3。

表1 本文選取的7 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)預(yù)測(cè)信息。Tab. 1 Prediction information of seven TA systems selected in this paper

2.2 BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 系統(tǒng)的毒素具有抑菌活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 過(guò)表達(dá)集胞藻PCC6803 毒素-抗毒素系統(tǒng)BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7的毒素BAD01932 和New ORF7 時(shí)會(huì)對(duì)大腸桿菌BW25113 造成明顯的生長(zhǎng)抑制。而誘導(dǎo)表達(dá)合體BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 可以解除毒素BAD01932 和New ORF7 的生長(zhǎng)抑制毒性(圖2a、b)。因此, BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 與預(yù)測(cè)結(jié)果相符, 組成毒素-抗毒素系統(tǒng)。而選取的其余5 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)在含有50μg·mL-1卡那霉素和0.3%L-阿拉伯糖LB 平板均未表現(xiàn)出明顯的毒性(圖2c—g)。

進(jìn)行毒性鑒定的 7 對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng)中,BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 能夠在大腸桿菌BW25113 中表現(xiàn)出毒性, 說(shuō)明大腸桿菌中存在這兩個(gè)系統(tǒng)與原宿主中毒素蛋白相同或相近的底物。另外5 對(duì)系統(tǒng)沒(méi)有表現(xiàn)出異源宿主的毒性, 可能的原因是大腸桿菌中不存在這幾個(gè)系統(tǒng)的底物,也有可能是這幾個(gè)系統(tǒng)在大腸桿菌中不能表達(dá), 所以仍需要在藍(lán)細(xì)菌宿主中進(jìn)一步確認(rèn)。

2.3 BAD01932-33 具有維持質(zhì)粒穩(wěn)定性的生理功能

毒素-抗毒素系統(tǒng)具有維持質(zhì)粒穩(wěn)定性的生理功能在 1986 年被揭示(Gerdes et al, 1986)。BAD01932-33 分布于集胞藻 PCC6803 的質(zhì)粒上,推測(cè)可能與質(zhì)粒穩(wěn)定性的維持有關(guān)。為了驗(yàn)證該設(shè)想, 我們將 BAD01932-33 構(gòu)建至pUC19 質(zhì)粒上,在E.coli進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果表明, 傳代48h后pUC19 質(zhì)粒丟失95%, 而帶有BAD01932-333 的pUC19 質(zhì)粒在傳代72h 后仍有 80% 細(xì)菌宿主攜帶pUC19 質(zhì)粒(圖3)。這說(shuō)明BAD01932-33 能夠明顯增加pUC19 在E. coli中的穩(wěn)定性。

2.4 BAD01932 和New ORF7 與同家族蛋白具有相似催化機(jī)制

鑒于選取的 7 對(duì) TA 中 BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 毒素蛋白具有細(xì)胞毒性, 我們對(duì)其蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和功能分析。BAD01932 的分析結(jié)果為GNAT 家族毒素蛋白。該蛋白家族目前研究得較為透徹的成員包括: 沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的TacAT 系統(tǒng)(Cheverton et al, 2016),福氏志賀菌(Shigella flexneri)的 GmvAT 系統(tǒng)(McVicker et al, 2017), 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC) O157: H7 的AtaRT 系統(tǒng)(Jur?nas et al, 2017), 肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumonia)的 KacAT 系統(tǒng)(Qian et al,2019)和大腸桿菌的ItaRT 系統(tǒng)(Wilcox et al, 2018)。我們將 BAD01932 與AtaRT、TacAT、KacAT、ItaRT和GmvAT 系統(tǒng)中毒素蛋白的序列比對(duì), 結(jié)果表明BAD01932 與其他同類型的毒素成員具有一定的序列相似度, 較為保守, 其中與AtaT 的相似度最高(33%)。該家族中發(fā)揮重要的底物識(shí)別和催化功能的氨基酸殘基為Tyr82、Arg92、Gly105 和Tyr141, 保守性高, 說(shuō)明可能具有類似的催化機(jī)制(圖4a)。

New ORF7 預(yù)測(cè)為HicAB 家族的毒素蛋白, 該蛋白家族研究得較為透徹的成員包括鼠疫桿菌(Yersinia Pestis)(Goulard et al, 2010)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)(Butt et al, 2014)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(Kim et al,2018)和大腸桿菌的 HicAB 系統(tǒng)(J?rgensen et al,2009)。這四個(gè)物種的抗毒素蛋白HicB 單體以及HicAB 復(fù)合物的蛋白結(jié)構(gòu)都已被解析, 但僅有類鼻疽伯克霍爾德菌的毒素蛋白HicA 的蛋白結(jié)構(gòu)得到解析, 因此毒素蛋白HicA 的催化機(jī)制并不明確。鼠疫桿菌、類鼻疽伯克霍爾德菌、肺炎鏈球菌和大腸桿菌的HicAB 系統(tǒng)HicA 蛋白都屬于同一個(gè)蛋白家族(PF07927)全長(zhǎng)約為60 個(gè)氨基酸殘基。本文新注釋的New ORF7 所編碼的HicA 蛋白與類鼻疽伯克霍爾德菌的HicA 蛋白相似度最高(20%), 較為特殊的是New ORF7 所編碼的HicA 蛋白的N 端多出約50 個(gè)氨基酸。盡管如此Gly78 和His80 這兩個(gè)在同家族成員的催化過(guò)程起重要作用的殘基仍然較為保守, 這也說(shuō)明它們可能具有相似的催化機(jī)制(圖4b)。

2.5 BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 系統(tǒng)蛋白的表達(dá)與純化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 這兩對(duì)TA 系統(tǒng)中毒素和抗毒素蛋白的相互作用情況, 我們采用pET28b(+)載體進(jìn)行兩對(duì)系統(tǒng)的毒素、抗毒素單獨(dú)以及合體的異源表達(dá)和純化。由于這兩個(gè)系統(tǒng)的毒素蛋白對(duì)宿主菌株有較強(qiáng)的毒性作用, 我們進(jìn)行了大量嘗試, 均未成功構(gòu)建野生型的表達(dá)載體。因此實(shí)驗(yàn)中只嘗試了抗毒素單獨(dú)以及與毒素共表達(dá)的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BAD01932-33 的抗毒素蛋白BAD01933 單獨(dú)表達(dá)以及毒素-抗毒素共表達(dá)菌株在加入IPTG 誘導(dǎo)之后都有目的蛋白分子量對(duì)應(yīng)大小的過(guò)表達(dá)條帶產(chǎn)生(圖5a 泳道2 和圖4b 泳道2), 高濃度咪唑洗脫樣品中,只有單獨(dú)表達(dá)抗毒素蛋白的載體有極少量可溶性蛋白能夠被洗脫(圖5a 泳道6 和7)。而絕大部分的抗毒素蛋白以及毒素和抗毒素共表達(dá)蛋白幾乎全部在包涵體中(圖5a 泳道4 和圖5b 泳道4)。對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)和誘導(dǎo)溫度的改變以及進(jìn)行毒素和抗毒素的密碼子優(yōu)化都未能提高可溶性蛋白量。

BAA18559-New ORF7 TA 系統(tǒng)中抗毒素蛋白BAA18559 單獨(dú)表達(dá)菌株在加入誘導(dǎo)劑IPTG 后有過(guò)表達(dá)條帶(圖5c 泳道2), 但是仍以包涵體的形式存在(圖5c 泳道4), 以高濃度咪唑進(jìn)行洗脫時(shí)仍沒(méi)有得到抗毒素蛋白BAA18559(圖5c 泳道6 和7)。而毒素蛋白New ORF7 和抗毒素蛋白BAA18559 共表達(dá)的菌株在加入誘導(dǎo)劑 IPTG 后都沒(méi)有出現(xiàn)明顯的過(guò)表達(dá)條帶(圖5d 泳道2)。這種情況的出現(xiàn)的原因可能是BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7這兩對(duì)TA 系統(tǒng)的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)不能正確折疊, 或者是這些蛋白的溶解度本身偏低。

3 討論

本文采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了淡水藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803 和海水藍(lán)細(xì)菌聚球藻WH7803 的毒素-抗毒素系統(tǒng)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 具有51 對(duì)潛在的TA, 而聚球藻WH7803 具有10 對(duì)TA。出現(xiàn)這種差別的原因可能與兩種細(xì)菌所生存的環(huán)境的復(fù)雜性有關(guān), 集胞藻PCC6803 所生活的淡水中的微生物種類和數(shù)量較多, 水體隨季節(jié)變化存在較大溫差, 營(yíng)養(yǎng)成分和種類受人類活動(dòng)影響大, 而聚球藻WH7803 所生活的海洋環(huán)境的溫度和營(yíng)養(yǎng)波動(dòng)較小。而TA 系統(tǒng)的存在有利于菌體抵抗逆境和復(fù)雜生存環(huán)境, 因此更有利于集胞藻PCC6803 適應(yīng)復(fù)雜多變的生態(tài)環(huán)境。由于本文僅分別預(yù)測(cè)分析了一種淡水藍(lán)細(xì)菌和海水藍(lán)細(xì)菌, 因此TA 系統(tǒng)在淡水和海水藍(lán)細(xì)菌基因組上的分布差異性還需要后續(xù)的研究分析。

VapBC (Vap: virulence associated protein, 毒力相關(guān)蛋白)類型的TA 系統(tǒng)在集胞藻PCC6803 所預(yù)測(cè)的51 對(duì)TA 系統(tǒng)分布最高, 為23 對(duì)。在原核生物中,VapC 家族成員大多數(shù)具有PIN 結(jié)構(gòu)域, 并在許多原核生物的基因組中大量存在, 如結(jié)核桿菌目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)48 對(duì)(Pandey et al, 2005; Ramage et al, 2009)。VapC 家族成員眾多, 但很多成員的底物目前并不清楚。已有的研究表明, 沙門氏菌、志賀氏菌和鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)中的VapC 蛋白能切割起始tRNAfMet, 并且均從特定的位點(diǎn)切割反密碼子環(huán)。所以VapC 能夠抑制細(xì)胞蛋白翻譯功能的起始(Winther et al, 2011; Lopes et al, 2014)。然而VapC 家族成員并非所有成員都通過(guò)切割tRNA 抑制蛋白的翻譯, 例如結(jié)核桿菌的VapC20 能通過(guò)切割23S rRNA 中保守的Sarcin-Ricin 環(huán)(SRL)抑制蛋白的翻譯(Winther et al, 2013)。

本文選取的毒素蛋白 BAD01932 和 New ORF7 在大腸桿菌BW25113 異源表達(dá)時(shí)具有細(xì)胞毒性。其中 BAD01932-33 位于集胞藻 PCC6803的質(zhì)粒上, 屬于一類新型Ⅱ型TA 系統(tǒng)。本文研究發(fā)現(xiàn), BAD01932-33 能夠明顯增加pUC19 在E.coli中的穩(wěn)定性。其毒素蛋白具有 GNAT 折疊,抗毒素蛋白具有Ribbon-Helix-Helix (RHH)折疊。GCN5-related N-acetyl-transferase (GNAT)來(lái)源于酵母菌GCN5 (general control non-depressible 5),是一種組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。在乙?；磻?yīng)中, 這類酶將乙酰-CoA 作為乙酰基供體。GNAT 超家族能夠?qū)Πǖ鞍踪|(zhì)、小分子代謝物和抗生素在內(nèi)的一系列底物進(jìn)行乙?；揎? 例如賦予細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物產(chǎn)生抗性的氨基糖苷 N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶就是第一個(gè)被鑒定的GNAT 超家族成員。腸出血性大腸桿菌O157: H7 的AtaT(Jur?nas et al,2017)和沙門氏菌的TacT(Cheverton et al, 2016)這兩種 GNAT 毒素的分子機(jī)理研究較為透徹,AtaT 通過(guò)將乙酰-CoA 的乙?；D(zhuǎn)移到Met-tRNAfMet從而抑制翻譯的進(jìn)行。其他GNAT家族的毒素成員作用機(jī)制類似, 不同的是作用的tRNA 種類存在區(qū)別。

BAA18559-New ORF7 屬于HicAB 類, 也是一種Ⅱ型 T A 系統(tǒng)。最早發(fā)現(xiàn)于流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) 的菌毛基因簇(hif)當(dāng)中,因此被命名為 HicAB (Haemophilus influenza contiguous)。hicAB 基因排列有一個(gè)顯著的特點(diǎn): 毒素基因hicA 位于抗毒素基因hicB 的前面, 這與大多數(shù)TA 系統(tǒng)的基因排列順序相反。hicAB 基因在細(xì)菌中分布廣泛, 常常多對(duì)存在, 具有多樣性?？苟舅氐鞍譎icB 通常含有RNase H 樣折疊(典型特征包含β1β2β3α1β4α2 模塊), 而HicA 蛋白通常包含結(jié)合雙鏈RNA 的結(jié)構(gòu)域。第一對(duì)由實(shí)驗(yàn)證實(shí)的HicAB 成員位于大腸桿菌 K-12 基因組中(J?rgensen et al,2009)。其HicA 蛋白是核糖體不依賴型的RNA 切割酶, 能夠?qū)Π麅?nèi)的mRNA 和tmRNA 酶切, 進(jìn)而阻斷翻譯過(guò)程的進(jìn)行, 具有抑菌功能。而HicB 并沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性, 反而可以完全抑制HicA 的毒性。對(duì)HicAB 家族的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn), 其主要的生理功能包括維持菌株毒力(Goulard et al, 2010), 介導(dǎo)“持留菌”的形成(Butt et al, 2014)和協(xié)助菌體適應(yīng)細(xì)胞外應(yīng)激(J?rgensen et al, 2009)。

Ⅱ型 TA 的毒素蛋白和抗毒素蛋白之間存在緊密的相互作用?？苟舅氐鞍滓c毒素蛋白的結(jié)合底物競(jìng)爭(zhēng), 所以毒素-抗毒素之間的相互作用一般強(qiáng)于毒素-底物之間的相互作用。毒素蛋白一般具有以下特點(diǎn): 比抗毒素蛋白穩(wěn)定、水溶性不高和對(duì)宿主菌有毒性作用。而抗毒素分子的特點(diǎn)為:較不穩(wěn)定、極易降解、水溶性較毒素好以及能夠抑制毒素分子對(duì)宿主菌的毒性作用。因此在體外進(jìn)行功能研究的時(shí)候要充分考慮毒素和抗毒素兩種分子的特性。本文采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)的BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 兩個(gè)系統(tǒng)的蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn), BAD01932-33 系統(tǒng)單獨(dú)表達(dá)抗毒素時(shí)僅有少量可溶性蛋白, 表達(dá)合體時(shí)兩種蛋白均在包涵體中, 說(shuō)明蛋白的水溶性較低是該系統(tǒng)異源表達(dá)純化的制約因素。而B(niǎo)AA18559-NewORF7 單獨(dú)表達(dá)抗毒素時(shí)蛋白全部在包涵體中, 表達(dá)合體時(shí)也只有抗毒素有誘導(dǎo)帶出現(xiàn), 毒素蛋白甚至沒(méi)有誘導(dǎo)帶產(chǎn)生, 可能是因?yàn)镠icA 蛋白的毒性太強(qiáng), 導(dǎo)致加入誘導(dǎo)劑之后出現(xiàn)基因突變而不能正常表達(dá)。

本文分別以集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803為研究對(duì)象, 通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了二者基因組和質(zhì)粒上的毒素-抗毒素系統(tǒng), 并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中7 對(duì)潛在的系統(tǒng)。本文的研究結(jié)果為后續(xù)藍(lán)細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)功能和應(yīng)用研究的開(kāi)展提供了理論依據(jù)。