孫寶箴 全龍萍 康慧 姚玉新 沈甜 陳衛(wèi)平 杜遠(yuǎn)鵬 高振

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院 山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 272018；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，銀川 750002）

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，在生物界中廣泛存在。長(zhǎng)期以來(lái)，它們被認(rèn)為是由于異常剪接而形成的副產(chǎn)品，功能潛力很?。?］。隨著研究的不斷深入，植物circRNA的特征和功能逐步被挖掘［2］。通過(guò)設(shè)計(jì)1對(duì)跨反向剪接位點(diǎn)兩側(cè)的背向引物進(jìn)行qRT-PCR已被廣泛用于檢測(cè)circRNA的表達(dá)水平，但使用常規(guī)背向引物無(wú)法特異地?cái)U(kuò)增發(fā)生可變剪接環(huán)化時(shí)被包含的circRNA，所以開(kāi)發(fā)一種適用于發(fā)生可變剪接環(huán)化的circRNA的定量分析方法至關(guān)重要。

逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是驗(yàn)證circRNA并分析其表達(dá)量簡(jiǎn)便、快速的方法，其關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)的位置。由于circRNA和線性RNA序列相同，為避免擴(kuò)增出線性序列，circRNA驗(yàn)證時(shí)需要跨反向剪接位點(diǎn)（backsplice site）兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，稱(chēng)為背向引物（divergent primer），擴(kuò)增產(chǎn)物包含反向剪接位點(diǎn)。背向引物僅可擴(kuò)增環(huán)化后首尾相接的circRNA，因此，通過(guò)背向引物RT-PCR結(jié)合Sanger測(cè)序檢驗(yàn)可變剪接位點(diǎn)是驗(yàn)證植物circRNA存在與否的標(biāo)準(zhǔn)。由于qRTPCR成本低且適于大規(guī)模試驗(yàn)，通過(guò)背向引物進(jìn)行qRT-PCR是目前檢測(cè)植物circRNA表達(dá)水平最常用的方法。使用背向引物通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR擴(kuò)增circRNA的方法在番茄［3］、水稻［4］、枸橘［5］和楊樹(shù)［6］中均得到應(yīng)用。將背向引物中的正向和反向引物設(shè)計(jì)得彼此接近或者重疊可以用于擴(kuò)增全長(zhǎng)circRNA序列［7］。

可變剪切通常指從一個(gè)mRNA前體中通過(guò)選擇不同的剪接位點(diǎn)組合方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程。circRNA同樣存在可變剪接現(xiàn)象，在擬南芥［8］、番茄［3］、棉花［9］、水稻［4，7］、玉米［10］、枸橘［5］和楊樹(shù)［6］等植物中均有報(bào)道。circRNA可變剪接可分為2種類(lèi)型，同一基因產(chǎn)生具備相同剪接位點(diǎn)但轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度不同的circRNA為可變剪接環(huán)化，其中同一基因產(chǎn)生不同反向剪接位點(diǎn)的circRNA為可變反向剪接環(huán)化［11］。由于circRNA生信分析軟件主要基于反向剪接位點(diǎn)進(jìn)行篩選，目前，circRNA可變剪接事件的報(bào)道集中在可變反向剪接環(huán)化。枸橘558個(gè)circRNA共出現(xiàn)143個(gè)可變反向剪接環(huán)化事件［5］，來(lái)源于水稻175個(gè)基因的1 356個(gè)circRNA共出現(xiàn)486個(gè)可變反向剪接環(huán)化事件［4］，說(shuō)明可變反向剪接環(huán)化事件具有高頻率性。且已有研究通過(guò)背向引物RT-PCR方法在擬南芥［8］、番茄［3］、棉花［9］、水稻［4］和枸橘［5］中成功驗(yàn)證可變反向剪接環(huán)化事件的存在。

截止目前，尚沒(méi)有針對(duì)植物circRNA發(fā)生可變反向剪接環(huán)化事件時(shí)特異檢測(cè)被包含circRNA表達(dá)量的研究報(bào)道。究其原因，使用常規(guī)背向引物對(duì)被包含的circRNA進(jìn)行qRT-PCR定量分析時(shí)勢(shì)必出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確定量。

本研究對(duì)葡萄高可信度circRNA的可變剪接環(huán)化事件進(jìn)行分析，旨在開(kāi)發(fā)一種適用于circRNA可變反向剪接環(huán)化事件下被包含circRNA定量分析的引物設(shè)計(jì)方法，并運(yùn)用RT-PCR和qRT-PCR驗(yàn)證了該方法可以提高circRNA發(fā)生可變反向剪接環(huán)化事件時(shí)擴(kuò)增被包含circRNA的特異性，為circRNA的表達(dá)研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為一年生‘巨峰’盆栽葡萄，培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院光照培養(yǎng)室。培養(yǎng)基質(zhì)為土壤∶珍珠巖∶蛭石（1∶1∶1）混合物，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2 000-2 400 lx，光照/黑暗時(shí)間12 h/12 h。

1.2 方法

1.2.1 circRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的獲取 對(duì)玫瑰香根、莖、葉、花、果實(shí)混合組織進(jìn)行circRNA測(cè)序，使用FIND_CIRC［12］、CIRI［13］和CIRCexplorer［14］3種 工具篩選獲得8 354個(gè)獨(dú)立的circRNA，取3種算法的交集獲得1 432個(gè)高可信度的circRNA［15］，用于分析可變剪接事件。

1.2.2 RNA提取及檢測(cè) 取‘巨峰’葡萄根或葉片約0.5 g，液氮研磨，用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（BSC65S1，博日科技）提取總RNA。取3-5 μL RNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.3 cDNA第一鏈的合成 按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所用引物為6堿基隨機(jī)引物。逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為RT-PCR和qRT-PCR的模板。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn) 設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：引物GC含量比為40%-60%，TM值為60-65℃，引物長(zhǎng)度為20-30 bp，產(chǎn)物大小為150-250 bp，使用NCBI網(wǎng)站的Primer Blast進(jìn)行特異性驗(yàn)證（表1）。改進(jìn)引物基于手動(dòng)選擇，盡量滿(mǎn)足引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

表1 RT-PCR與熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers for RT-PCR and qRT-PCR

表2 RT-PCR與熒光定量PCR改進(jìn)引物Table 2 Improved primers for RT-PCR and qRT-PCR

1.2.5 RT-PCR檢測(cè) RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL Taq Master Mix（E005-02A，Novoprotein）、上下游引物 0.5 μmol/L、模板1 μL，用水補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增程序 為94℃ 90 s；94℃ 20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用柱式DNA膠回收試劑盒（DC301，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行純化，通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)反向剪接位點(diǎn)序列。

1.2.6 qRT-PCR檢 測(cè) 按 照TB Green? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（RR820A，TaKaRa Bio）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為10 μL SYBR Premix Ex Taq、上下游引物0.5 μmol/L、模板1 μL和滅菌水8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序?yàn)槠鹗紲囟?5℃，每個(gè)循環(huán)增加0.5℃至95℃。qRT-PCR引物同RT-PCR（表1和表2）。經(jīng)qRT-PCR擴(kuò)增后，檢查溶解曲線和擴(kuò)增曲線，以評(píng)估是否為特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 葡萄circRNA可變反向剪接環(huán)化事件

對(duì)前期試驗(yàn)獲得的1 432個(gè)高可信度葡萄circRNA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些circRNA共由1 043個(gè)基因產(chǎn)生。其中，817個(gè)基因只產(chǎn)生一個(gè)circRNA，226個(gè)基因可發(fā)生可變反向剪接環(huán)化事件，即產(chǎn)生2個(gè)或以上的circRNA，共涉及615個(gè)circRNA。根據(jù)2個(gè)circRNA之間的位置將可變反向剪接環(huán)化事件分為并列關(guān)系（圖1-a）、交叉關(guān)系（圖1-b）和包含關(guān)系（圖1-c和圖1-d）。

圖1 circRNA可變反向剪接環(huán)化事件Fig. 1 Alternative back-splicing circularization of circRNA

以VIT_201s0010g01480為例，其第7-13個(gè)外顯子可以產(chǎn)生6個(gè)circRNA，分別為circRNA_0376、circRNA_0379、circRNA_0380、circRNA_0381、circRNA_0382和circRNA_0383（圖2）。circRNA_0380 和circRNA_0383以及circRNA_0379和circRNA_0383 屬于并列關(guān)系；circRNA_0380和circRNA_0382屬于交叉關(guān)系；circRNA_0380和circRNA_0379、circRNA_0382和circRNA_0383、circRNA_0381和circRNA_0379、circRNA_0381和circRNA_0380、circRNA_0381和circRNA_0382、circRNA_0381和circRNA_0383、circRNA_0376和其余5個(gè)circRNA屬于包含和被包含關(guān)系。

圖2 VIT_201s0010g01480第7-13個(gè)外顯子產(chǎn)生的circRNAFig. 2 circRNA produced by exons 7-13 of VIT_201s0010g01480

理論上，設(shè)計(jì)背向引物對(duì)被包含的circRNA進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR反應(yīng)的過(guò)程勢(shì)必會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增的現(xiàn)象。從1 432個(gè)circRNA中選取4組具有包含關(guān)系的circRNA進(jìn)行驗(yàn)證（圖3和圖4），其中circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044 和circRNA_7086分 別 被circRNA_4364、circRNA_ 6018、circRNA_6045和circRNA_7085包含。

圖3 circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的RT-PCR結(jié)果Fig. 3 RT-PCR results of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086

運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增4個(gè)被包含的circRNA（circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086）時(shí)，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增（圖3），同預(yù)期結(jié)果一樣。經(jīng)sanger測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)較小的片段分別 為circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086（圖4），較大的片段分別是包含 它 們 的circRNA（circRNA_4364 circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085）。運(yùn)用qRT-PCR擴(kuò)增后4個(gè)circRNA溶解曲線均呈雙峰（圖5），說(shuō)明qRT-PCR過(guò)程同樣出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增，導(dǎo)致表達(dá)量分析結(jié)果不可信。

圖4 circRNA反向剪接位點(diǎn)及其附近序列Fig. 4 Back-splicing sites and nearby sequences of circRNA

圖5 circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的qRT-PCR溶解曲線Fig. 5 qRT-PCR dissolution curve of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086

2.2 改進(jìn)引物的特異性檢驗(yàn)

由 于circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_ 6044和circRNA_7086的成熟體序列分別被circRNA_4364 circRNA_6018、circRNA_6045和circRNA_7085完全覆蓋，僅在反向剪接位點(diǎn)處存在差異?；诖耍O(shè)計(jì)引物時(shí)可將一端引物3'端跨反向剪接位點(diǎn)3-4個(gè)堿基（圖6，表2）。

圖6 改進(jìn)后的引物設(shè)計(jì)方法Fig. 6 Improved primer design method

使用改進(jìn)引物分別對(duì)circRNA_4363、circRNA_ 6017、circRNA_6044和circRNA_7086進(jìn) 行RTPCR，結(jié)果顯示，circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，但circRNA_6044出現(xiàn)了新的非特異性擴(kuò)增片段（圖7）。檢測(cè)qRTPCR溶解曲線發(fā)現(xiàn)均呈單峰（圖8），表明使用該引物設(shè)計(jì)方法可以提高circRNA可變反向剪接環(huán)化事件RT-PCR和qRT-PCR的特異性。

圖7 引物改進(jìn)后circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的RT-PCR結(jié)果Fig. 7 RT-PCR results of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086 after using improved primers

圖8 引物改進(jìn)后circRNA_4363、circRNA_6017、circRNA_6044和circRNA_7086的qRT-PCR溶解曲線Fig. 8 qRT-PCR dissolution curve of circRNA_4363, circRNA_6017, circRNA_6044, and circRNA_7086 after using improved primers

3 討論

circRNA目前已知的主要功能包括miRNA吸附作用、與功能蛋白結(jié)合調(diào)控細(xì)胞功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白翻譯等［16］。circRNA來(lái)源豐富，可分為外顯子來(lái)源的circRNA、內(nèi)含子來(lái)源的circRNA、外顯子-內(nèi)含子來(lái)源的circRNA、基因間區(qū)circRNA和反義鏈circRNA。擬南芥、番茄、水稻和葡萄中絕大多數(shù)circRNA來(lái)源于編碼蛋白質(zhì)的基因，外顯子類(lèi)型的circRNA占比例最大。多外顯子circRNA為其發(fā)生可變反向剪接環(huán)化事件提供了多種可能。高通量測(cè)序表明植物circRNA可變反向剪接環(huán)化事件廣泛存在，并且響應(yīng)脅迫［8］，暗示不同circRNA可變反向剪接環(huán)化體在逆境等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮功能。circRNA的表達(dá)規(guī)律分析是研究其功能的基礎(chǔ)，當(dāng)circRNA可變反向剪接環(huán)化事件發(fā)生時(shí)，運(yùn)用PCR擴(kuò)增的方法無(wú)法對(duì)被包含的circRNA進(jìn)行精確定量。基于此本研究提出了一種適用于對(duì)circRNA可變反向剪接環(huán)化事件中被包含circRNA定量分析的引物設(shè)計(jì)方法，即一端引物的3'端跨反向剪接位點(diǎn)3-4個(gè)堿基，本研究以上游引物的3'端跨剪接位點(diǎn)為例。本研究中circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086通過(guò)應(yīng)用該引物改良方法解決了circRNA可變反向剪接環(huán)化引起的非特異擴(kuò)增問(wèn)題。由于改進(jìn)引物設(shè)計(jì)方法必須跨剪接位點(diǎn)，無(wú)法滿(mǎn)足所有的引物設(shè)計(jì)原則，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)有一定的局限性。例如本實(shí)驗(yàn)中的circRNA_6044，使用上游引物3'端跨剪接位點(diǎn)的方法依然不能獲得特異性條帶，可能是由于引物的特異性不高。在遇到這種情況時(shí)，可使用下游引物3'端跨剪接位點(diǎn)進(jìn)行嘗試。另外，由于circRNA可變剪接環(huán)化具備相同的反向剪接位點(diǎn)，本研究引物改進(jìn)方法無(wú)法用于發(fā)生可變剪接環(huán)化的circRNA的表達(dá)分析。因此，circRNA定量分析的方法有待進(jìn)一步的完善和優(yōu)化。

另外，該引物設(shè)計(jì)方法也可用于非可變剪接和可變反向剪接環(huán)化事件中并列關(guān)系、交叉關(guān)系中circRNA的表達(dá)量分析，并且跨剪接位點(diǎn)的引物既可以是上游引物也可以是下游引物，為葡萄及其他物種circRNA的表達(dá)分析研究提供了新的參考，填補(bǔ)了植物circRNA發(fā)生可變反向剪接環(huán)化事件時(shí)特異檢測(cè)被包含circRNA表達(dá)量方法的空白。

4 結(jié)論

本研究提出了一種適用于葡萄circRNA可變反向剪接環(huán)化事件中被包含circRNA表達(dá)分析的引物設(shè)計(jì)改良方法，即一端引物的3'端跨反向剪接位點(diǎn)3-4個(gè)堿基。通過(guò)應(yīng)用該引物改良方法提高了circRNA_4363、circRNA_6017和circRNA_7086擴(kuò)增的特異性，相較于常規(guī)的背向引物設(shè)計(jì)方法，該引物設(shè)計(jì)改良方法更加適用于circRNA發(fā)生可變剪接環(huán)化事件時(shí)的定量分析，其結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。