曾晛陽，趙 熹，黃旭日

（吉林大學理論化學研究所,長春 130061）

作為細胞的重要能量來源，并且是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成代謝途徑的重要成分，葡萄糖不能通過簡單的擴散而通過任何種類的細胞生物膜.因此，葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）作為一種插入膜中的特殊蛋白質(zhì)，是將葡萄糖帶入細胞所必需的.這些轉(zhuǎn)運體涉及一系列常見的疾病，如癌癥、糖尿病和血清腦發(fā)育相關(guān)的疾病.根據(jù)結(jié)構(gòu)特點，葡萄糖轉(zhuǎn)運體屬于主要促進者超家族（MFS）中的糖轉(zhuǎn)運蛋白家族.MFS是最大的膜蛋白家族之一，其成員存在于生命的各個領(lǐng)域.在人體中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14個糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員，它們在組織分布、表達水平、底物特異性和親和力方面有所不同，估計是為了適應特定組織的生理需要［1］.其中，大多數(shù)人類葡萄糖轉(zhuǎn)運體均為易化擴散蛋白，葡萄糖沿著其濃度梯度跨膜運輸，而不依賴任何離子.此外，還有另一類極其重要的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白，如GLUT12［2］人類癌癥糖酵解代謝特征的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運體，存在于脂肪組織、骨骼肌、小腸和胎盤，還存在于人類乳腺腫瘤、人類前列腺癌和前列腺癌細胞系LNCaP、少突膠質(zhì)瘤、少突細胞瘤和星形細胞瘤，是一種重要的抗癌治療靶點.此類葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機理的研究尚不清晰.但與此同時，已有相關(guān)抑制劑類藥物對于葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的研究.

為了研究此種重要的共轉(zhuǎn)運蛋白，采用與人源葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白高度同源的表皮葡萄球菌的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白（GlcPSe），這種蛋白的內(nèi)向開放、非配位構(gòu)象結(jié)構(gòu)已被解析［3］.研究表明，表皮葡萄球菌的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白被葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUTs）的傳統(tǒng)抑制劑細胞松弛素B（Cytochalasin B）所抑制.研究表明，細胞松弛素B對于GlcPSe具有抑制效果，其半抑制濃度（IC50）為（18.1±6.3）μmol/L［3］.

GlcPSe與人類的GLUTs存在較高的序列一致性（27%～34%）和同源性（49%～58%）［3］.與大多數(shù)MFS成員一樣，12個跨膜（TM）螺旋構(gòu)成了GlcPSe結(jié)構(gòu)的主要部分.在GlcPSe的結(jié)構(gòu)中，殘基7-427構(gòu)成了典型的MFS折疊.葡萄糖結(jié)合點位于這兩個結(jié)構(gòu)域之間的界面.據(jù)了解，當?shù)孜锝Y(jié)合位點交替暴露在膜的任何一側(cè)時，底物就會發(fā)生轉(zhuǎn)移.N端和C端結(jié)構(gòu)域的重新排列和搖擺使GlcPSe從朝外（向周質(zhì)開放）的構(gòu)象轉(zhuǎn)移到朝內(nèi)（向細胞質(zhì)開放）的構(gòu)象，以便將葡萄糖從膜的一側(cè)送到另一側(cè).這種交替進入機制似乎是MFS的所有成員共有的［4］.

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的周期性轉(zhuǎn)運過程已有論證［5］.對葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的研究也從葡萄糖結(jié)合位點和結(jié)構(gòu)特征上支持了如下轉(zhuǎn)運過程，即轉(zhuǎn)運蛋白上的葡萄糖轉(zhuǎn)運位點交替向膜的一側(cè)開放以供葡萄糖通過.葡萄糖結(jié)合位點位于一個被1，4，7和10跨膜螺旋包裹的兩性腔內(nèi).GlcPSe中的葡萄糖結(jié)合位點為Q137（TM5），Q250，Q251，N256（TM7）和W357（TM10）［3］，分別對應人源GLUT1中的殘基Q161，Q282，Q283，N288和W388［6］.以上位置是葡萄糖結(jié)合的關(guān)鍵，所以抑制劑的結(jié)合方式很可能就是通過隔離這些殘基與葡萄糖的結(jié)合或阻塞葡萄糖的轉(zhuǎn)運通道［7］.

對比采取簡單易化擴散方式轉(zhuǎn)運葡萄糖的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的TM1和TM4上的殘基尤為重要.依據(jù)此特點，前人［3］提出了帶有葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白特征的轉(zhuǎn)運機理機制（Scheme 1）.在無H+的情況下，Asp22（TM1）和Arg102（TM4）形成鹽橋，使得TM1和TM4相互靠攏，從而使葡萄糖結(jié)合位點所在空腔向胞外開放.當H+與D22結(jié)合時，鹽橋被破壞，TM1和TM4重新排列以減小空腔的大小，同時這一構(gòu)象變化降低了葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象由向外開放到向內(nèi)開放的能量障礙，所以當葡萄糖結(jié)合時，其因這種構(gòu)象變化迅速被轉(zhuǎn)運.葡萄糖通過殘基與TM5、TM7和TM10的結(jié)合，也使得N端和C端兩結(jié)構(gòu)域的關(guān)系更加緊密.在向內(nèi)開放的構(gòu)象中，TM5和TM10遠離葡萄糖結(jié)合位點，使其上的兩個關(guān)鍵殘基Q137和W357從葡萄糖的結(jié)合位點中脫離，從而使結(jié)合位點的空腔向細胞內(nèi)開放.轉(zhuǎn)運蛋白向內(nèi)開放，隨后葡萄糖被釋放，緊接著H+釋放，使Asp22和Arg102回到它們的鹽橋形式，使葡萄糖結(jié)合位點的空腔轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛲忾_放.

Scheme 1 Proposed mechanism of glucose/H+symport

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白在向內(nèi)開放的構(gòu)象被認為是抑制劑結(jié)合的關(guān)鍵［8］.為了研究抑制劑在葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白中的作用機理，同時考察質(zhì)子化作用對抑制效果的影響，本文使用了GlcPSe的晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：4LDS）作為對接和分子動力學模擬（MD）的蛋白質(zhì)模板結(jié)構(gòu)，通過分子動力學方法，對向內(nèi)開放構(gòu)象下的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白在不同質(zhì)子化情況下與細胞松弛素B的結(jié)合進行模擬，計算了抑制劑與蛋白的結(jié)合效果，分析了抑制劑在葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白在各狀態(tài)下所起到的關(guān)鍵作用，以及相互結(jié)合的分子機制.

1 實驗部分

1.1 常規(guī)動力學模擬

采用GlcPSe內(nèi)向構(gòu)象的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：4LDS）作為模型的受體.由于4LDS的晶體結(jié)構(gòu)中缺少N端4個氨基酸，所以本文省略了這一部分.由于4LDS的C端尾巴在葡萄糖轉(zhuǎn)運體中的地位并不明確，對其進行了修補.然后根據(jù)H++服務器（http：//biophysics.cs.vt.edu/H++）計算的pKa值，來設(shè)定殘基的質(zhì)子化狀態(tài)，H++服務器是一個基于泊松-波爾茨曼（PB）或廣義波恩（GB）模型的大分子中可電離基團的pKa值的計算預測系統(tǒng).每個殘基的質(zhì)子化狀態(tài)都是根據(jù)pH=7下的pKa計算結(jié)果來分配的.GlcPSe與配體對接使用的是Autodock vina［9］.GlcPSe中的配體被設(shè)定為中心點，按照Autodock vina的默認參數(shù)對蛋白內(nèi)部的孔腔建立一個網(wǎng)格盒.Glide功能被用來搜索網(wǎng)格定義的結(jié)合區(qū)域，并產(chǎn)生配體的構(gòu)象集合.從產(chǎn)生配體的構(gòu)象中，選擇打分最高的構(gòu)象.在此，對GlcPSe在磷脂POPC分子的膜環(huán)境中與抑制劑細胞松弛素B（Cytochalasin B）形成的復合物進行了分子動力學模擬.細胞松弛素B的結(jié)構(gòu)來自于PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/CID：5311281），拓撲結(jié)構(gòu)由網(wǎng)頁服務器ATB version 3.0生成（https：//atb.uq.edu.au/）.

使用GROMACS［10～12］對GlcPSe分為兩組設(shè)置.一組分配質(zhì)子化狀態(tài)，另一組不設(shè)置質(zhì)子化狀態(tài)，并分別將蛋白-抑制劑的復合物嵌入472個POPC分子的膜環(huán)境中.為了保證模擬在電中性的環(huán)境下進行，在模型的周期性水盒子中加入平衡離子，并設(shè)定100 mmol/L氯化鈉溶液保證生理條件下的離子濃度.對模型采用最陡下降算法進行能量最小化，之后分別做了100 ps的正則系綜（NVT）平衡和1000 ps的等溫等壓系綜（NPT）平衡.過程中，采用GROMOS54A7力場.靜電相互作用的計算采用粒子網(wǎng)格埃瓦爾德（PME），庫侖截斷距離為1.2 nm.對與氫原子相連的鍵使用LINCS算法進行約束，時間步長為2 fs.在NVT過程中系統(tǒng)溫度達到參考溫度300 K，時間為0.1 ps.在NPT過程中壓力保持1.0×105Pa，采用Nose-Hoover恒溫器和Parrinello-Rahman定壓器.為了避免偶然性，進行了3次100 ns的MD模擬實驗，并且為每次模擬的初始構(gòu)象分配了滿足麥克斯韋-玻爾茲曼分布的不同初始速度.模擬使用GROMACS2020程序包［13］，MD的運動方程采用leap-frog積分算法，能量和坐標軌跡每2 ps記錄1次.

1.2 傘形采樣模擬

常規(guī)分子動力學的最后一幀被用作進一步拉伸分子動力學（Steered Molecular Dynamics，SMD）模擬的初始結(jié)構(gòu).在拉伸分子動力學之后進行了傘形采樣模擬，通過傘形采樣模擬得到的結(jié)果平均力勢（Potential of mean force，PMF）來計算結(jié)合自由能.將細胞松弛素B從結(jié)合位點向細胞質(zhì)方向拉伸5 nm.拉伸速率為0.01 nm/ps，彈簧力常數(shù)為1000 kJ·mol-1·nm-2.在拉伸分子動力學過程中會為接下來的傘形采樣模擬創(chuàng)建一系列初始構(gòu)型，每個構(gòu)型與傘形采樣模擬中的每一個窗口相對應.傘形采樣模擬中配體抑制劑處于簡諧勢限制下，與蛋白參考分子質(zhì)量中心（COM）之間的距離借助傘形偏離勢而逐漸增加.這種限制可以讓配體抑制劑對環(huán)境構(gòu)象空間中指定的區(qū)域進行采樣，采樣沿配體和參考分子質(zhì)量中心（COM）之間的反應坐標進行.傘形采樣模擬的窗口間隔為0.1 nm［14］，在質(zhì)子化狀態(tài)下的蛋白模型中取51個窗口，在去質(zhì)子化的蛋白模型中適當增加了采樣窗口為54個窗口.每個窗口都進行了100 ps的NPT預平衡，最后運行了10 ns的傘形采樣模擬.最后使用加權(quán)直方圖分析方法（Weighted Histogram Analysis Method，WHAM）得到PMF并計算結(jié)合自由能［15］.

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制劑的機制

通過Cheng-Prusoff關(guān)系式預估了結(jié)合能（ΔGEXP，kJ/mol）［16，17］：

式中：R（8.314 J·mol-1·K-1）為氣體常數(shù)；T（取310 K）為實驗溫度.基于熱力學的模擬和線性響應的假設(shè)，對絕對結(jié)合自由能計算使用Linear Interaction Energy（LIE）方法［18，19］，其中ΔUvdW和ΔUel(kJ/mol)分別為配體與周圍范德瓦爾斯的平均能量和靜電部分在MD模擬中的平均能量.ΔGLIE表示結(jié)合態(tài)與自由態(tài)之間的平均能量差，通過下式計算：

不同的權(quán)重系數(shù)α和β分別代表非極性和極性的貢獻對結(jié)合能的貢獻.根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定α為0.181［20］.參數(shù)β是由從線性響應近似中得出的，其取決于配體的化學性質(zhì).Cytochalasin B被歸類為帶有兩個羥基的極性化合物β=0.33［21］.在LIE模型中常數(shù)項γ被用于校正能量，以獲得絕對結(jié)合自由能，與結(jié)合位點的疏水性質(zhì)密切相關(guān)［22］.由表1可見，在γ=0時，結(jié)合能的實驗值與計算值相符.

Table 1 Summary of binding free energy

在100 ns的常規(guī)動力學模擬后，分別對葡萄糖/質(zhì)子共轉(zhuǎn)運蛋白的不同質(zhì)子化狀態(tài)［質(zhì)子化狀態(tài)（Protonized）和去質(zhì)子化狀態(tài)（No protonized）］下的蛋白受體和抑制劑細胞松弛素B進行了方均根偏差分析（RMSD）.兩種質(zhì)子化狀態(tài)下的蛋白受體在模擬的初始階段快速達到平衡，均在20 ns之后進入相對平衡的狀態(tài)（圖1）.

Fig.1 RMSD of glucose/H+symporter of two dif?ferent proton states

Fig.2 RMSD of cytochalasin B under two different proton states of glucose/H+symporter

質(zhì)子化狀態(tài)下的葡萄糖/質(zhì)子共轉(zhuǎn)運蛋白的RMSD平衡值（約0.6 nm）明顯高于去質(zhì)子化狀態(tài)，說明其結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了更高的結(jié)構(gòu)柔性，暗示了質(zhì)子化狀態(tài)下的蛋白與抑制劑的結(jié)合是不緊密的.與之形成鮮明對比的是，抑制劑細胞松弛素B在去質(zhì)子化狀態(tài)下的蛋白中表現(xiàn)了高于在質(zhì)子化狀態(tài)下的蛋白中的結(jié)構(gòu)柔性（圖2），暗示此時細胞松弛素B到達了合適的抑制劑結(jié)合空腔，結(jié)構(gòu)得到舒展.此時，抑制劑與去質(zhì)子化狀態(tài)下的轉(zhuǎn)運蛋白充分結(jié)合.

從構(gòu)象上觀察，去質(zhì)子化的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白與抑制劑細胞松弛素B的相互作用更加緊密，此時與細胞松弛素B相結(jié)合的氨基酸殘基包含Pro117，Arg129，Asn136，Gln137，Ile295，Val298，Trp357和Leu380（圖3）.在質(zhì)子化的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白中與細胞松弛素B相結(jié)合的氨基酸殘基包含Met113，Pro117，Ile144，Ile255，Thr291和Trp357（圖4）.細胞松弛素B與去質(zhì)子化的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用明顯大于與質(zhì)子化的葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合.觀察到抑制劑的結(jié)合位點處于葡萄糖轉(zhuǎn)運通道靠近細胞質(zhì)一側(cè)，抑制劑起到從空間上阻塞葡萄糖轉(zhuǎn)運通道的作用.并且由于Trp357同時是葡萄糖的關(guān)鍵結(jié)合氨基酸，同時也是細胞松弛素B的識別位點，其與葡萄糖形成競爭性結(jié)合葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的關(guān)系，從而抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運.

首先，選取RMSD平衡后50～100 ns的軌跡，對氫鍵數(shù)目進行分析，去質(zhì)子化狀態(tài)下細胞松弛素B與蛋白受體形成的氫鍵可達5個，而后者最多只有3個氫鍵（圖5）.這就表明在去質(zhì)子化狀態(tài)下，葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白與細胞松弛素B有更強的氫鍵相互作用，從而結(jié)合得更穩(wěn)定.

Fig.3 Modeled cytochalasin B binding site under no protonized glucose/H+symporter

Fig.4 Modeled cytochalasin B binding site under protonized glucose/H+symporter

Fig.5 Number of hyrdrogen bonds of no protonized(A)and protonized(B)during 50—100 ns

另外，還發(fā)現(xiàn)在質(zhì)子化狀態(tài)下，Trp357的吲哚和P117的吡咯分別與細胞松弛素B的十四元大環(huán)和六元小環(huán)上的甲基形成保守的疏水相互作用，當葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白來到去質(zhì)子化狀態(tài)下，Trp357和P117均與細胞松弛素B的六元小環(huán)形成疏水相互作用，在之后的傘形采樣分析中同樣得到佐證.也是我們認定的細胞松弛素B與葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的最佳結(jié)合狀態(tài)，并且可以發(fā)揮最大的抑制作用.W357（TM10）來自于葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的C端，P117（TM4）來自于葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的N端.已知葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白是依賴C端和N端向細胞膜兩側(cè)交替開放的方式來實現(xiàn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運，抑制劑也通過阻礙C端和N端分子動力學的構(gòu)象變化，使得葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白無法完成由向內(nèi)開放到向外開放的轉(zhuǎn)變，從而使細胞無法通過轉(zhuǎn)運蛋白吸收葡萄糖.N端結(jié)構(gòu)域的剛性和C端結(jié)構(gòu)域的可變性可能是由它們獨特的結(jié)構(gòu)特征所致.已有研究表明N端結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部是親水的［6］；相反，C端結(jié)構(gòu)域是高度疏水的，這一“多脂的”本質(zhì)造成了羧基端結(jié)構(gòu)的可變性.在模擬過程中，屬于N端結(jié)構(gòu)域的跨膜螺旋幾乎采取剛性的動力學運動，而C端結(jié)構(gòu)域中的不連續(xù)螺旋體TM10經(jīng)歷了突出的局部重排（圖6）.尤其在葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白從質(zhì)子化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿ベ|(zhì)子化狀態(tài)后，TM10在細胞質(zhì)側(cè)的末端發(fā)生彎折，導致Trp357從與尾部的十四元大環(huán)產(chǎn)生疏水相互作用，變?yōu)榕c抑制劑中部的六元小環(huán)產(chǎn)生疏水相互作用.為細胞松弛素B與更多的殘基發(fā)生相互作用提供空間上的便利條件（圖7）.對TM10的二級結(jié)構(gòu)做了考察，在軌跡穩(wěn)定的50～100 ns中每10 ns提取一次結(jié)構(gòu).證實了TM10的Ser351，Trp352和Gly353處，在去質(zhì)子化狀態(tài)下更容易形成Turn的二級結(jié)構(gòu)，從而使TM10的末端更容易發(fā)生彎折的結(jié)構(gòu)（圖8）.

Fig.6 Modeled TM10 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.7 Modeled zoomed cytochalasin B binding site with TM10 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.8 Secondary structure changes of TM 10(residues 330—359)under two different proton states of glucose/H+symporter

2.2 質(zhì)子化的結(jié)合位點

通過程序VMD［23］和HOLE［24］顯示關(guān)鍵質(zhì)子化結(jié)合位點處于TM1上的Asp22，并非在葡萄糖的轉(zhuǎn)運路徑上，離葡萄糖的結(jié)合位點也有一定距離（圖9），但它的存在不僅對葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運葡萄糖至關(guān)重要，也對抑制劑的結(jié)合和抑制作用至關(guān)重要.由模擬中50幀構(gòu)象的折線圖可見，在關(guān)鍵質(zhì)子化位點D22與R102的鹽橋距離差異十分明顯（圖10），表明質(zhì)子化作用讓殘基所在螺旋TM1和TM4之間的相對距離發(fā)生了不小的變化.

使用程序bio3D程序［25］進一步考察了兩種質(zhì)子化狀態(tài)下，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白中的氨基酸殘基的運動相關(guān)性.發(fā)現(xiàn)在去質(zhì)子化條件下，C端的TM10（resids 330～359）明顯地與N端質(zhì)子化位點相關(guān)的TM1（resids 7～33）和TM4（resids 95～123）呈現(xiàn)運動的負相關(guān)性（圖11）.說明去質(zhì)子化進程對抑制劑的結(jié)合產(chǎn)生了遠程的調(diào)控作用.與之相反，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白在質(zhì)子化條件下，轉(zhuǎn)運蛋白內(nèi)部的氨基酸之間運動相關(guān)變?nèi)?推測質(zhì)子化狀態(tài)，作為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白由“結(jié)合底物”到“徹底釋放底物”之間的過渡狀態(tài)，表現(xiàn)出運動相關(guān)性短暫“消失”的特性.這時，處于質(zhì)子化位點的殘基失去了對抑制劑結(jié)合位點的調(diào)控能力.

Fig.9 Position of protonation sites in relation to glucose transport channels

Fig.10 Distance of salt bridge of D22?R102 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.11 Residue cross correlation under two different proton states of glucose/H+symporter

2.3 傘形采樣模擬結(jié)果分析

Fig.12 Profiles of potential of mean force

通過傘形采樣模擬計算了抑制劑細胞松弛素B與葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合自由能.結(jié)果表明，去質(zhì)子化狀態(tài)下葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白與細胞松弛素B的結(jié)合自由能（E）更高（圖12），意味著細胞松弛素B在葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中，更加傾向于在處于去質(zhì)子化狀態(tài)的階段發(fā)揮抑制作用，其與氫鍵作用分析結(jié)果一致.傘形采樣模擬得到的PMF曲線顯示，在去質(zhì)子化狀態(tài)下細胞松弛素B相對與受體蛋白的拉伸距離（ξ）小于質(zhì)子化狀態(tài)下的拉伸距離（圖12）.表明在質(zhì)子化狀態(tài)下，細胞松弛素B與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合更加深入.在去質(zhì)子化狀態(tài)下Trp357與處于抑制劑中部的六元小環(huán)產(chǎn)生疏水相互作用，當在質(zhì)子化狀態(tài)下，Trp357已經(jīng)變?yōu)榱伺c抑制劑尾部的十四元大環(huán)產(chǎn)生疏水相互作用，這一結(jié)合現(xiàn)象導致了質(zhì)子化狀態(tài)下的轉(zhuǎn)運蛋白與胞松弛素B的拉伸動力學有更長的拉伸距離.

3 結(jié) 論

分子動力學結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運蛋白在質(zhì)子化狀態(tài)下，抑制劑細胞松弛素B與受體蛋白的結(jié)合變得更加深入，也更加靠近葡萄糖的結(jié)合位點，然而抑制效果卻明顯不如在去質(zhì)子化狀態(tài)下結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白.說明抑制劑在葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白中有獨有的結(jié)合方式，并不僅僅是通過空間上阻塞葡萄糖轉(zhuǎn)運通道來達到抑制效果.為了更好地發(fā)揮抑制作用，需要在恰當?shù)霓D(zhuǎn)運過程中去結(jié)合葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，使抑制劑可以處于最佳結(jié)合位置，盡可能多地與轉(zhuǎn)運蛋白建立相互作用.在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象逐漸向細胞內(nèi)開放的過程中，當進行到去質(zhì)子化的步驟，抑制劑細胞松弛素B對葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白的抑制作用找到了最佳結(jié)合位點.其中Trp357作為識別和結(jié)合抑制劑細胞松弛素B的關(guān)鍵氨基酸起到了重要作用.還發(fā)現(xiàn)了處于抑制劑結(jié)合位點的蛋白局部殘基與質(zhì)子化位點所處的蛋白局部殘基之間的運動相關(guān)性，證實了質(zhì)子化位點對抑制劑結(jié)合位點的調(diào)控能力.通過實驗探索，揭示了部分葡萄糖/質(zhì)子共轉(zhuǎn)運蛋白抑制機理的特點，為針對葡萄糖/質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑的開發(fā)和設(shè)計提供了理論基礎(chǔ).

感謝吉林大學理論與計算化學實驗室在計算方面的支持.