陳學(xué)兵，歐世梅，張利沙

乙型肝炎病毒（HBV）感染屬于全球性健康問題，研究發(fā)現(xiàn)目前世界范圍內(nèi)近20億人感染過HBV，但是病人臨床結(jié)局存在較大差異，一般取決于HBV持續(xù)感染性以及病人康復(fù)狀態(tài)，HBV感染病人發(fā)生發(fā)展對于指導(dǎo)病人治療以及改善預(yù)后具有重要意義，因此如何有效的評價(jià)病人病情進(jìn)展一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)［1］。研究顯示宿主因素主要是宿主基因單核苷酸多態(tài)性是影響HBV感染與疾病發(fā)展的重要因素，既往研究發(fā)現(xiàn)鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白為肝細(xì)胞表面膽汁酸受體，也是HBV感染肝細(xì)胞受體，介導(dǎo)病毒進(jìn)入到肝細(xì)胞，HBV則可以同膽汁酸競爭性結(jié)合，膽固醇7-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）屬于膽汁酸生物合成途徑重要的限速酶，具有分解膽固醇變?yōu)槟懼崮軌蚓S持肝細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)定的功能，有研究發(fā)現(xiàn)HBV能夠結(jié)合鈉離子-牛磺膽酸抑制膽汁酸進(jìn)入到肝細(xì)胞，造成了該基因表達(dá)升高，促進(jìn)了人體膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼釋?dǎo)致肝細(xì)胞被破壞，但是臨床對于CYP7A1基因多態(tài)性對于HBV感染的相關(guān)性臨床分析極為少見［2］。本研究分析了CYP7A1基因rs4738687多態(tài)性與HBV感染的相關(guān)性，目的是分析該基因多態(tài)性同HBV病人臨床結(jié)局之間的關(guān)系，對HBV病人發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性選取2015年1月至2019年2月在德陽市人民醫(yī)院治療的HBV感染病人（觀察組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［3］中的標(biāo)準(zhǔn)；②入院前未接受抗病毒治療；③病人及近親屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等其他肝臟病變；②有HIV感染。最終納入200例（觀察組），其中慢性HBV感染者140例，HBV肝硬化病人60例。同時選取該院健康體檢者120例作為對照組，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》中的相關(guān)要求。

表1 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）和對照組（健康體檢者）一般資料比較

1.2實(shí)驗(yàn)方法抽取病人空腹靜脈血3 mL，取200μL全血采用TIANamp基因組DNA試劑盒提取全血DNA，采用Haploview 4.2軟件對CYP7A1 rs4738687位點(diǎn)進(jìn)行篩選，采用改進(jìn)多重高溫連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)進(jìn)行基因分型，PCR循環(huán)程序?yàn)?5℃2 min，11個循環(huán)（94℃20 s，65℃每個循環(huán)遞減0.5℃40 s，72℃90 s）；72℃2 min后4℃60 min，在10μL PCR產(chǎn)物加入5單位蝦堿性磷酸酶及2單位核酸外切酶Ⅰ，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。連接程序?yàn)?8個循環(huán)（94℃1 min，56℃4 min），4℃60 min取0.5 μL稀釋后連接產(chǎn)物，同0.5μL Liz500 SIZE STAN‐DARD與9μL Hi-Di混勻后95℃變性5 min，采用ABI3730XL測序儀開展監(jiān)測，利用GENEMapper 5.0生物系統(tǒng)分析并將最終結(jié)果輸出。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件，計(jì)量資料采用±s的形式表示。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異；采用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律檢驗(yàn)樣本代表性；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分比的形式表示，χ2檢驗(yàn)分析組間差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CYP7A1基因rs4738687多態(tài)性CYP7A1基因rs4738687位點(diǎn)檢測出AA、GA和GG基因型，觀察組和對照組rs4738687位點(diǎn)多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。

2.2兩組rs4738687多態(tài)性比較觀察組和對照組rs4738687位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）和對照組（健康體檢者）rs4738687多態(tài)性比較

2.3觀察組不同疾病病人rs4738687基因型及吸煙、飲酒情況比較觀察組HBV相關(guān)肝硬化病人rs4738687位點(diǎn)AG+GG基因型比例明顯高于慢性HBV感染病人（P<0.05）；慢性HBV感染和HBV相關(guān)肝硬化病人吸煙、飲酒比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 觀察組［乙型肝炎病毒（HBV）感染病人］不同疾病病人rs4738687基因型及吸煙、飲酒情況比較/例（%）

2.4觀察組不同性別、年齡病人rs4738687基因型比較觀察組不同性別、年齡病人rs4738687位點(diǎn)AG+GG基因型比例比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）不同性別、年齡病人rs4738687基因型比較/例（%）

3 討論

乙型病毒性肝炎是臨床常見的肝臟傳染性疾病，我國流行病學(xué)調(diào)查顯示在1～4歲、5～14歲、15～29歲人群中HBV表面抗原流行率為0.32%、0.94%、4.38%，每年有近百萬人死亡于肝硬化、原發(fā)性肝癌等嚴(yán)重肝臟疾病，嚴(yán)重地影響了人們身心健康和生命質(zhì)量［3-4］。HBV感染病人隨著病情不斷進(jìn)展會逐漸發(fā)展為肝硬化，肝細(xì)胞廣泛變性、壞死，再生結(jié)節(jié)形成，結(jié)締組織增生，導(dǎo)致肝臟中的血液循環(huán)障礙，肝細(xì)胞營養(yǎng)障礙加重，門靜脈高壓、肝功能損害［5］。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HBV感染病人出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，肝星狀細(xì)胞發(fā)揮了主要的調(diào)節(jié)作用，一旦病人肝臟細(xì)胞受到損傷后，肝星狀細(xì)胞會大量增殖，促進(jìn)了膠原合成，朝向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大量增生的纖維組織會重新分割包繞肝細(xì)胞，讓正常的肝小葉結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為肝硬化結(jié)節(jié)，因此慢性肝炎肝硬化均是肝細(xì)胞纖維化程度加重累積過程［6-7］。此外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)炎癥、凋亡和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變屬于刺激因素參與到組織損傷和HBV感染發(fā)生發(fā)展過程中，目前臨床尋找診斷HBV感染特異性和敏感性的非創(chuàng)傷性指標(biāo)極為重要，已有的血清學(xué)指標(biāo)在評估肝纖維化程度時可能受到肝臟炎癥活動度影響［8-9］。

HBV感染病人病毒持續(xù)存在的原因尚不清晰，有報(bào)道指出即使同種族、性別及年齡相似的個體經(jīng)同一種方式感染相同的病毒亞型，也會產(chǎn)生不同的后果，這提示了遺傳基因因素在慢性乙型肝炎中起著重要的作用［10-11］。本研究中重點(diǎn)分析了CYP7A1基因rs4738687多態(tài)性與HBV感染之間的關(guān)聯(lián)，CYP7A1是細(xì)胞色素P450酶，主要特異性存在人體肝臟微粒體，包含6個外顯子與5個內(nèi)含子，也是人體催化膽固醇朝向膽汁酸轉(zhuǎn)化的第1步，屬于膽汁酸合成限速酶，膽固醇可以轉(zhuǎn)變?yōu)?α-羥膽固醇，膽固醇核還原、羥化等過程形成具有24碳初級膽汁酸與結(jié)合膽汁酸，可以反映人體膽汁酸合成的快慢［12-14］。研究顯示當(dāng)人體出現(xiàn)膽汁淤積會導(dǎo)致膽汁酸代謝紊亂，造成肝細(xì)胞損傷與凋亡，嚴(yán)重的會發(fā)生壞死，而在HBV感染病人肝細(xì)胞中的CYP7A1會表達(dá)升高12倍，且同肝臟組織損傷嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)性［15-17］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)宿主因素特別是宿主基因單核苷酸多態(tài)性是導(dǎo)致HBV感染與疾病進(jìn)展的重要因素，單核苷酸多態(tài)性可能會影響CYP7A1表達(dá)引發(fā)膽汁酸生成，造成肝臟不同程度炎癥反應(yīng)［18-19］。本研究分析的rs4738687位點(diǎn)主要在該基因內(nèi)含子，內(nèi)含子突變會導(dǎo)致基因發(fā)生剪接，對基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，有報(bào)道指出該位點(diǎn)的突變與近端大腸癌發(fā)病關(guān)系密切［20］。本研究觀察發(fā)現(xiàn)肝硬化病人AG+GG基因型比例顯著升高，提示該位點(diǎn)出現(xiàn)突變后可能會導(dǎo)致HBV感染病人疾病出現(xiàn)進(jìn)展，而在性別與年齡分層發(fā)現(xiàn)，觀察組不同性別、年齡病人rs4738687位點(diǎn)AG+GG基因型比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位點(diǎn)基因型與等位基因在性別與年齡分層方面不具有差別，但是由于本研究納入病人數(shù)量較少，尤其是女性病人的樣本含量還不夠大，可能導(dǎo)致各基因型分布比例偏差較大，需要擴(kuò)充樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證上述位點(diǎn)的意義。

本研究分析顯示CYP7A1基因rs4738687位點(diǎn)檢測出AA、GA和GG基因型，觀察組和對照組rs4738687位點(diǎn)多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律，而且觀察組和對照組rs4738687位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位點(diǎn)基因型與等位基因方面同健康人群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組HBV肝硬化病人rs4738687位點(diǎn)AG+GG基因型比例明顯高于慢性HBV感染病人，說明肝硬化病人CYP7A1基因rs4738687位點(diǎn)AG+GG基因型比例顯著升高，也提示了上述位點(diǎn)發(fā)生突變后可能加速病人肝臟功能惡化，使HBV慢性感染發(fā)展為肝硬化。本研究的優(yōu)勢在于提出了CYP7A1基因rs4738687多態(tài)性在HBV感染病人中的變化，為臨床研究國人HBV感染不同臨床結(jié)局遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識，但是仍需開展多中心、多民族、大樣本、多基因的聯(lián)合分析，并進(jìn)行相關(guān)功能學(xué)及感染機(jī)制的研究，為HBV感染的防控提供依據(jù)。

綜上述所，CYP7A1基因rs473868位點(diǎn)多態(tài)性與HBV感染易感性無明顯關(guān)系，但可能與HBV肝硬化發(fā)生存在正相關(guān)關(guān)系。