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      小麥Hsp70基因家族鑒定及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

      2022-06-12 19:03:30楚宗麗李亮杰姬虹程琴孫君艷
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
      關(guān)鍵詞:小麥

      楚宗麗 李亮杰 姬虹 程琴 孫君艷

      摘要:為研究小麥Hsp70蛋白的相互作用,利用生物信息學(xué)方法,在全基因組范圍內(nèi)對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行蛋白互作及可視化分析。結(jié)果表明,在全基因組范圍內(nèi)共鑒定到21個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守的Hsp70基因家族成員,亞細(xì)胞定位顯示主要分布于細(xì)胞質(zhì),蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋與無規(guī)卷曲類型在每個(gè)蛋白中所占比重較大,二者之和大于70%,延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比重較小,二者之和小于30%?;プ鞣治鼋Y(jié)果表明,TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3,TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20,TaHsp70-17和TaHsp70-11之間有相互作用,GO分析顯示所鑒定基因主要在分子功能、生物過程及細(xì)胞成分方面起作用。

      關(guān)鍵詞:小麥;Hsp70;熱激蛋白;基因鑒定;蛋白互作

      中圖分類號(hào):S512.101 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

      文章編號(hào):1002-1302(2022)10-0037-07

      小麥(Triticum aestivum L.)屬禾本科(Gramineae)麥屬(Tritium),是我國(guó)重要的糧食作物之一,高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)對(duì)保證國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。在小麥栽培中,常遭受低溫、高溫、水澇和干旱等非生物脅迫[1],這些脅迫會(huì)導(dǎo)致生物膜破壞和蛋白質(zhì)的破壞,植株生理代謝發(fā)生紊亂,限制植株生長(zhǎng),嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。

      植物在進(jìn)化過程中形成了一系列應(yīng)對(duì)機(jī)制來響應(yīng)逆境脅迫[4],熱激蛋白(heat shock proteins,Hsps)是植物由不同逆境脅迫(如高溫、干旱、寒冷、重金屬、過氧化和各種病原體攻擊等)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類分子伴侶類型的應(yīng)激蛋白[5],在逆境下大量表達(dá),在植物適應(yīng)環(huán)境及抵御逆境中發(fā)揮重要作用[4,6]。Hsps廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中,具有高度的保守性[7]。在正常的生長(zhǎng)發(fā)育中,它們負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的折疊、組裝、易位和降解,具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和膜的功能,并可在應(yīng)激條件下協(xié)助蛋白質(zhì)折疊[6],維持細(xì)胞穩(wěn)定,在調(diào)控動(dòng)物、植物代謝和信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[8-9]。

      Hsps既是植物的應(yīng)激蛋白,又是必需蛋白,通常存在于植物的細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位[10],根據(jù)分子量的不同,可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP 5個(gè)家族[5],這些不同家族的Hsps在不同作物中已經(jīng)被鑒定和研究[11-14]。Hsp70是真核細(xì)胞里最豐富的熱激蛋白之一,其表達(dá)水平受外界環(huán)境條件影響,擬南芥幼苗在生長(zhǎng)溫度發(fā)生急劇變化條件下HSP70家族基因的表達(dá)水平迅速增加[9-10],在40 ℃高溫脅迫下水稻Hsp70基因在極短時(shí)間內(nèi)顯著表達(dá)[15],40 ℃熱激小麥幼苗后,TaHSP70在黃化幼苗葉片中的表達(dá)增加,但在綠色幼苗中保持穩(wěn)定,并且在與小麥條銹病的不親和和親和互作過程中差異表達(dá)[16],TaHSP70表達(dá)能被高溫處理、條銹菌和白粉菌侵染所誘導(dǎo)[17-18],說明在植物抗逆、抗病方面發(fā)揮著各種脅迫保護(hù)作用。HSP70基因家族在水稻[19]、玉米[20]、甘蔗[21]、辣椒[22]、鐵皮石斛[23]等作物中進(jìn)行了鑒定與分析,Hsp70家族在小麥的逆境等植物中已有研究[23],但小麥基因組龐大,品種多,抗逆育種是一個(gè)復(fù)雜的工作,Hsp70基因家族分析研究仍需不斷深入。因此,本研究利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫資源,對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行全基因組鑒定,并分析其理化性質(zhì)、蛋白互作關(guān)系,以期為小麥Hsp70基因的功能研究提供信息參考,為小麥抗性育種提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 注釋基因組序列獲取與Hsp70基因家族鑒定

      從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)中獲取小麥基因組數(shù)據(jù),下載小麥Hsp70的cds序列、DNA序列、蛋白質(zhì)序列、基因組注釋信息gff3文件。從Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中下載Hsp70的隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Model,簡(jiǎn)稱HMM)文件,Pfam編號(hào)為PF00012。使用擬南芥和水稻Hsp70蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTPP搜索。使用Hummer Search 3.0軟件,在小麥基因組序列中通過隱馬爾科夫模型比對(duì),篩選小麥中含有Hsp70結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列搜索。將上述方法篩選到的候選基因蛋白質(zhì)序列合并,利用SMART、NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫和Pfam對(duì)候選蛋白序列進(jìn)行檢測(cè),去掉不含有Hsp70保守結(jié)構(gòu)域或保守結(jié)構(gòu)域不完整序列和冗余序列,得到小麥Hsp70結(jié)構(gòu)域高度保守的蛋白成員。

      1.2 小麥Hsp70的亞細(xì)胞定位和染色體定位

      利用生物信息學(xué)在線分析軟件PSORT (https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測(cè)小麥Hsp70蛋白的亞細(xì)胞定位,TBtools (http://www.tbtools.org/)進(jìn)行Hsp70基因的染色體定位與基因結(jié)構(gòu)分析。

      1.3 小麥Hsp70蛋白的保守基序motif分析和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

      利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)進(jìn)行小麥Hsp70蛋白序列中保守基序分析(motif),SOPMA(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm;/)進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

      1.4 小麥Hsp70蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

      將上述得到的小麥Hsp70蛋白序列利用string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)以擬南芥Hsp70蛋白模型構(gòu)建小麥Hsp70的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

      1.5 小麥Hsp70基因成員的基因本體GO分析

      基因本體(gene ontology)論分析即GO分析,是基因按功能進(jìn)行富集分析的重要平臺(tái),其包括生物學(xué)過程(biological process),細(xì)胞成分(cellular component),分子功能(molecular function)三大類。首先將小麥Hsp70編碼的蛋白氨基酸殘基序列與擬南芥參考蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì),獲得對(duì)應(yīng)的參考序列,然后把參考序列對(duì)應(yīng)的基因IDmapping到AmiGO數(shù)據(jù)庫中((http://amigo.geneontology.org),從而獲得小麥Hsp70基因成員對(duì)應(yīng)的GO條目,設(shè)置e-value<10-5。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 小麥Hsp70基因成員的篩選鑒定及亞細(xì)胞定位

      HMM模型和本地BLAST 2種搜索比對(duì),從小麥全基因組中獲得109個(gè)Hsp70候選基因,Pfam和SMART、NCBI-CDD等在線網(wǎng)站對(duì)篩選,舍去不含有Hsp70蛋白結(jié)構(gòu)域或保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列,鑒定到21個(gè)小麥Hsp70(TaHsp70)家族成員(表1)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,小麥Hsp70蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)。

      2.2 小麥Hsp70基因成員的染色體定位

      為明確Hsp70基因在染色體上的位置情況,數(shù)據(jù)分析和利用TBtools(http://www.tbtools.org/)進(jìn)行染色體定位結(jié)果顯示,小麥Hsp70在小麥12條染色體上呈不均等分布,1A、2B、4D染色體分別有3個(gè)Hsp70基因基,2D、3B、4B染色體上分別有2個(gè)Hsp70基因,2B、4A、5A、5B、5D、6A染色體都只有1個(gè)Hsp70基因(圖1)。

      2.3 小麥Hsp70蛋白的保守基序分析

      利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)對(duì)小麥Hsp70蛋白序列進(jìn)行Motif保守元件的預(yù)測(cè)分析,搜索10個(gè)不同的保守基序,命名為Motif1-Motif10 (圖2)。Hsp70一般含有5~10個(gè)保守基序,其中motif 2(18/21)、motif 4(17/21)、motif 9(17)、motif 8(16)、motif 10(16)、motif 7(15)、motif 5(15)、motif 1(15)和motif 3(15)出現(xiàn)的頻率較高,motif 6出現(xiàn)頻率最低,為9次。其中第1條和第4條,第6~9條,第11~13條,第17~18條都具有相同的基序數(shù)量和順序。

      2.4 小麥Hsp70的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

      利用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)TaHsp70蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明,Hsp70蛋白α-螺旋與無規(guī)螺旋卷曲的占比較大,二者之和大于70%,延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角類型的氨基酸所占比重較小,二者之和小于30%(圖3、表2)。

      2.5 小麥Hsp70蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

      利用string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),進(jìn)行小麥Hsp70蛋白的互作分析。結(jié)果顯示,TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3,TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20,TaHsp70-17、TaHsp70-11共10個(gè)蛋白參與互作,存在35條互作關(guān)系(圖4)。其中線條顏色越深,互作強(qiáng)度越強(qiáng),線條顏色越淺,互作強(qiáng)度越弱。為了探究其相關(guān)功能,進(jìn)一步做基因本體論分析。

      2.6 小麥Hsp70基因成員的基因本體分析

      基因本體注釋可實(shí)現(xiàn)與基因有關(guān)的數(shù)據(jù)庫挖掘、轉(zhuǎn)化和整合,利用Blast2GO對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行分析,設(shè)置e-value<10-5,結(jié)果表明,在生物過程方面,主要集中于應(yīng)激反應(yīng)、脅迫反應(yīng)、熱反應(yīng)、無機(jī)反應(yīng)、多組織過程、蛋白質(zhì)折疊、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)等。在細(xì)胞成分方面,主要集中于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。在分子功能中,主要集中于雜環(huán)化合物的結(jié)合、離子結(jié)合、ATP結(jié)合、藥物結(jié)合、蛋白結(jié)合等(圖5)。

      3 討論與結(jié)論

      蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),也是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,Hsps是生物體在受到脅迫時(shí)的一種應(yīng)激蛋白,廣泛存在于各種生物體內(nèi),參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等過程[24],其中Hsp70是提高植物高溫耐受力的重要因子之一,在植物生長(zhǎng)及抵御多種非生物脅迫中發(fā)揮作用[17,25-26]。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展隨著植物基因組測(cè)序的逐漸完成,Hsps及Hsp70家族在擬南芥[10]、玉米[20]、水稻[19]、大麥[12,27]、葡萄[28]、煙草[29]等多種植物中進(jìn)行了全基因組范圍內(nèi)鑒定和逆境條件下的表達(dá)分析研究,亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞質(zhì),結(jié)構(gòu)域高度保守[5]。

      小麥Hsps家族基因進(jìn)行了鑒定、克隆和表達(dá)[5],本研究在全基因組范圍內(nèi)對(duì)小麥Hsp70基因家族進(jìn)行鑒定,共內(nèi)鑒定到21個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守的Hsp70基因家族成員,不均等分布在12條染色體上,對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示主要分布于細(xì)胞質(zhì),結(jié)構(gòu)域高度保守,與前人研究結(jié)果[5]一致。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示,α-螺旋與無規(guī)卷曲類型在每個(gè)蛋白中所占比重較大,二者之和大于70%,延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角類型的氨基酸所占比重較小,二者之和小于30%。

      研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)通過互相作用發(fā)揮生物功能[30],蛋白互作分析及可視化分析結(jié)果表明,TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3、TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20、TaHsp70-17、TaHsp70-11共10個(gè)蛋白參與互作,存在35條互作關(guān)系。GO分析結(jié)果表明,所鑒定基因主要在分子功能、生物過程及細(xì)胞成分方面起作用。在生物過程方面,主要集中于熱反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、抗壓反應(yīng)、有機(jī)反應(yīng)、無機(jī)反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)等。在細(xì)胞成分方面,主要集中于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、發(fā)生反應(yīng)。在分子功能中,主要集中于雜環(huán)化合物的結(jié)合、離子束縛、蛋白結(jié)合、結(jié)合ATP、藥物結(jié)合等。

      Hsps參與植物的多種代謝過程,在植物的逆境響應(yīng)起主要作用,抗性育種是小麥育種中重要課題之一。隨著小麥基因組測(cè)序的完成和不斷完善,為深入研究這些基因的功能以及上游和下游的調(diào)控蛋白提供了基礎(chǔ),對(duì)TaHsps家族的分析,為通過分子手段改良小麥的耐熱性提供理論依據(jù),TaHsp家族的功能及通過何種途徑提高小麥的抗性仍需進(jìn)一步研究闡明。

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