張 琪，于永生，劉慶雨，高 一，李 欣，劉洪亮，張 慶，張志彬，李兆華，張?jiān)迄i，張凈搏，李 娜*，張樹敏*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130124；2.公主嶺國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)飛馬斯牧業(yè)有限公司，吉林公主嶺1 361001）

松遼黑豬是以長(zhǎng)白豬為第一父本、杜洛克豬為第二父本、吉林本地民豬為母本歷經(jīng)23 年培育出的我國(guó)北方第一個(gè)瘦肉型母系新品種，因其適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、瘦肉率高及肌內(nèi)脂肪含量適當(dāng)?shù)葍?yōu)點(diǎn)越來越受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的喜愛。2014—2016 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（原農(nóng)業(yè)部）將松遼黑豬作為主要推廣品種，在全國(guó)范圍內(nèi)推廣。但松遼黑豬與其親本民豬比較，繁殖性狀仍然有選育提高的空間。豬的生產(chǎn)性狀中繁殖性狀是遺傳力較低的性狀，采用常規(guī)選擇育種法，遺傳速度較慢，如果將常規(guī)方法與標(biāo)記輔助法結(jié)合起來，可以顯著提高改良速度。

豬的甲基轉(zhuǎn)移酶23（Methyltransferase-like 23，）基因位于12 號(hào)染色體上，可編碼190 個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)6 545 bp，共5 個(gè)外顯子。屬于I 型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Arginine Methyltransferases，PRMTs)，參與調(diào)控RNA 代謝、細(xì)胞增殖以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中行使著不可替代的作用。有研究表明PRMTs 的甲基化修飾在小鼠胚胎著床方面起到非常重要的作用。關(guān)于基因的研究多是與人類智力相關(guān)聯(lián)，與豬繁殖性狀選育方面相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用直接測(cè)序的方法來檢測(cè)松遼黑豬基因內(nèi)含子4 多態(tài)性，并分析多態(tài)性位點(diǎn)與相關(guān)繁殖性狀（總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶仔豬數(shù)、初生重、3 周齡重、斷奶重、乳頭數(shù)）間的相關(guān)性，為松遼黑豬繁殖性能改良和在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取178 頭經(jīng)產(chǎn)健康松遼黑豬母豬（由公主嶺飛馬斯種豬場(chǎng)提供），用耳鉗夾取黃豆粒大小耳組織，浸入含75%酒精的2 mL 離心管中，樣品貯存在實(shí)驗(yàn)室冰箱備用，同時(shí)統(tǒng)計(jì)收集所選母豬的繁殖數(shù)據(jù)。

1.2 主要試劑及設(shè)備 基因組DNA 提取試劑盒（Axygeno）；2×Taq MasterMix（康為世紀(jì)生物）；PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)）；電泳儀；凝膠成像分析儀。詳細(xì)信息見參考文獻(xiàn)。

1.3 松遼黑豬耳組織DNA 抽提 按照DNA 抽提試劑盒說明書，對(duì)松遼黑豬耳組織DNA 進(jìn)行抽提，并檢測(cè)DNA 的濃度及OD 值，濃度應(yīng)大于50 ng/μL，OD值在1.8～2.2 范圍之內(nèi)。采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，電泳條帶應(yīng)清晰并且無雜帶。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 使用Ensemble 軟件查找豬基因DNA 序列（ENSSSCT00000025222.3），Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：F：5'-CT GGAAATCTGTCAGCGTA-3'；R：5'-TTTGTTGAGGTC GTGGGTA-3'，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為898 bp。

1.5 PCR 擴(kuò)增及SNP 位點(diǎn)檢測(cè) 將提取并經(jīng)過鑒定質(zhì)量好的178 頭松遼黑豬DNA 做為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddHO 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DANMAN 與Chromas 軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)基因型，計(jì)算遺傳純合度（Ho）、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）。

式（1）、（4）中：n 為等位基因數(shù)目，i 為第i 個(gè)等位基因，j 為第j 個(gè)等位基因，P、P為計(jì)算的等位基因頻率。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 進(jìn)行整理后，運(yùn)用SPSS 19.0軟件中單因素方差進(jìn)行分析，以確定基因不同基因型與松遼黑豬繁殖性狀的相關(guān)性，<0.05 為差異顯著，<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 松遼黑豬基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示，可見該擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，無非特異性條帶，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 METTL23 基因內(nèi)含子4 引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析 由圖2 可知，在基因內(nèi)含子4 第43 位上發(fā)現(xiàn)G/A 突變。共發(fā)現(xiàn)2 種等位基因（G 和A）及3 種基因型（GG、GA 和AA）（圖3）。

圖2 松遼黑豬METTL23 基因內(nèi)含子4 序列比對(duì)結(jié)果

圖3 松遼黑豬METTL23 基因內(nèi)含子4 不同基因型測(cè)序圖

2.3 松遼黑豬基因型頻率和基因頻率 根據(jù)測(cè)序結(jié)果計(jì)算出松遼黑豬基因G/A 位點(diǎn)的基因型頻率與基因頻率，結(jié)果見表1。AA 基因型個(gè)體數(shù)量最多，為優(yōu)勢(shì)基因型。G、A 等位基因頻率分別為11.24%和88.76%，A 為優(yōu)勢(shì)等位基因。適合性卡方檢驗(yàn)表明，松遼黑豬基因內(nèi)含子4 的G43A 位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

表1 松遼黑豬METTL23 基因內(nèi)含子4 的基因型頻率和基因頻率

2.4 松遼黑豬基因群體遺傳多樣性 由表2可知，群體遺傳雜合度（0.199 5）數(shù)值較低，說明在松遼黑豬群體中該位點(diǎn)變異程度較??；多態(tài)信息含量為0.179 6，屬于低度多態(tài)。

表2 METTL23 基因G/A 位點(diǎn)在松遼黑豬中的遺傳特性

2.5 松遼黑豬基因多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析基因內(nèi)含子4 的G43A 位點(diǎn)GG 基因型個(gè)體3 周齡重、斷奶重顯著高于AA 基因型個(gè)體；GA 基因型的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)均高于GG、AA 基因型個(gè)體，但差異不顯著。

表3 松遼黑豬METTL23 基因不同基因型與繁殖性狀的相關(guān)性

3 討論

基因是精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶中的一種，它在調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育和器官生長(zhǎng)中起著重要作用。Blance 等報(bào)道，基因在胚胎發(fā)育的桑葚胚和囊胚期表達(dá)量升高。Hashimoto 等研究發(fā)現(xiàn)，將精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員敲除的小鼠突變體出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常和死亡的現(xiàn)象。同時(shí)，Bao 等發(fā)現(xiàn)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在小鼠睪丸中也高表達(dá)。Yu 等通過抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，導(dǎo)致了甘氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)的低甲基化，從而使DNA 自發(fā)性損傷，使細(xì)胞周期進(jìn)程延遲，導(dǎo)致染色體非整倍數(shù)或多倍數(shù)呈現(xiàn)，引起胚胎死亡。雌激素受體（ESR）在哺乳動(dòng)物生殖中通過上下級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。PRMT1 能夠瞬時(shí)使ESR內(nèi)的精氨酸260DNA 結(jié)合域甲基化。ESRα 甲基化可以調(diào)控雌激素反應(yīng)，促使復(fù)合物解離，進(jìn)一步使下游的相關(guān)酶失活，證實(shí)了基因在調(diào)節(jié)雌性動(dòng)物繁殖性能方面起著重要作用。以上研究說明精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在生殖過程中具有重要作用。

本研究通過Sanger 直接測(cè)序?qū)λ蛇|黑豬群體基因內(nèi)含子4 進(jìn)行SNP 位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子4 序列存在G/A 突變，檢測(cè)出基因型3 種（GG、GA 及AA），其中AA 為優(yōu)勢(shì)基因型，A 為優(yōu)勢(shì)基因。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，基因突變位點(diǎn)遺傳雜合度相對(duì)較低，說明該位點(diǎn)在松遼黑豬檢測(cè)群體中的遺傳變異程度偏低，且屬于低度多態(tài)。對(duì)G43A 位點(diǎn)與松遼黑豬繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，GG 基因型3 周齡重、斷奶重顯著高于AA 基因型。GA 基因型的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)高于GG、AA基因型，差異不顯著。

目前未見基因在不同品種豬上多態(tài)性與繁殖性狀相關(guān)研究的報(bào)道。研究表明，同一基因在不同群體或不同品種（品系）之間存在一定差異。由于繁殖性狀受多因素影響，因此目前尚不能確定基因是影響松遼黑豬繁殖性狀的主效基因或是與控制繁殖性狀主效基因連鎖的基因，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要在該品種豬更多群體間及不同品種中進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究對(duì)松遼黑豬基因內(nèi)含子4 進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增及Sanger 直接測(cè)序，經(jīng)分析檢測(cè)到G/A 突變。該位點(diǎn)與松遼黑豬3 周齡重和斷奶重顯著相關(guān)。但該突變位點(diǎn)能否作為松遼黑豬繁殖性狀的遺傳標(biāo)記，需要更大的群體進(jìn)一步驗(yàn)證。