程麗娜，吳子威，吳榕珍，朱孔飛，宋茹*

浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院（舟山 316022）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）又稱南美藜、藜谷等，屬于藜科植物。藜麥不僅蛋白質(zhì)含量高，而且富含不飽和脂肪酸、類黃酮、維生素、酚類及鈣、鐵、鋅、銅等多種有益物質(zhì)，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)定為唯一一種單體植物就可以滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，也是最適宜人類的一種全營(yíng)養(yǎng)食品[1-2]。黃酮類化合物是植物中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，研究已證實(shí)黃酮類化合物在心血管病防治、病毒預(yù)防、腫瘤緩解治療、自由基清除、免疫調(diào)節(jié)等方面具有生理活性[3-4]。在植物性活性成分提取中，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)可使液體發(fā)生共振[5]，能加速植物細(xì)胞壁破裂，從而加速胞內(nèi)活性組分的快速溶出[6]。因此，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)溶劑萃取法相比，具有提取時(shí)間短、提取溫度低、提取效率高、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)[7]，在生物活性物質(zhì)提取中應(yīng)用廣泛。研究以紅藜麥為原料，采用超聲輔助水提取法提取藜麥中黃酮類化合物，在單因素試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化獲得最佳提取條件，并對(duì)藜麥黃酮類化合物的抗氧性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，旨在探索一種綠色環(huán)保、高效的藜麥黃酮類化合物提取方法，為藜麥功能型產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紅藜麥，山西省靜樂(lè)縣田園農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·），北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒，南京建成生物研究所；蘆?。簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇：均為國(guó)產(chǎn)分析純，生工生物工程（上海股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TP-214電子天平（丹佛儀器有限公司）；XMTD-0.25000恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；721可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TM-767攪拌機(jī)—專業(yè)沙冰調(diào)理機(jī)（中山市海盤(pán)電器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[8]

準(zhǔn)確稱取2.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶解，然后定容至25 mL。吸取0，1，2，3，4和5 mL上述蘆丁溶液于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% Na2NO3溶液，混勻后靜置6 min，加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min，然后加入2 mL 4%NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，靜置15 min，測(cè)定510 nm處吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 樣品預(yù)處理

將紅藜麥粉碎，按照質(zhì)量加入5倍體積石油醚，室溫下浸提24 h進(jìn)行脫脂處理，過(guò)濾，將脫脂后藜麥放55 ℃烘箱干燥至恒重，分裝至密封袋中，備用。

1.3.3 超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物影響因素

以藜麥黃酮類化合物提取量（mg/g）為考查指標(biāo)，蒸餾水為提取劑，研究藜麥粉碎孔徑（0.150，0.180，0.250，0.425和0.850 mm）、料液比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100和1∶125 g/mL）、超聲提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）和超聲提取時(shí)間（20，30，40，50和60 min）對(duì)藜麥黃酮類化合物提取量的影響。

1.3.4 藜麥黃酮類化合物含量測(cè)定

參考張永花[9]方法，并適當(dāng)修改。取1 mL提取液，參照1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，測(cè)定510 nm處吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度（mg/mL），按照公式（1）計(jì)算黃酮類化合物含量。

式中：C為提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度，mg/mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定料液比為1∶100（g/mL），選擇藜麥粉碎孔徑（A）、超聲提取溫度（B）和超聲提取時(shí)間（C）進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以藜麥黃酮類化合物提取量為響應(yīng)值，具體因素水平及編碼值見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和編碼值

1.3.6 抗氧化性

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

參考孫雪婷等[11]方法適當(dāng)修改，具體如下：將不同濃度的藜麥黃酮類化合物提取液0.1 mL加去離子水0.3 mL，再加0.2 mL的0.02% DPPH乙醇液，混勻后在室溫下避光放置60 min，去離子水調(diào)零，測(cè)定在517 nm下吸光度（A樣品），樣品對(duì)DPPH自由基清除率按照公式（2）計(jì)算。

式中：A對(duì)照用等體積去離子水代替樣品；A樣品空白用等體積無(wú)水乙醇代替0.02% DPPH乙醇液。

1.3.6.2 總抗氧化能力

采用總抗氧化能力測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，藜麥黃酮類化合物的總抗化能力以U/μg計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物影響因素研究

由圖2（a）可知，當(dāng)藜麥粉碎孔徑從0.250 mm增大到0.850 mm時(shí)，黃酮類化合物的提取量隨著孔徑的加大而急劇減小。粉碎篩的孔徑越小，表示物料顆粒的粒徑越小，所以與溶劑接觸表面積越大，進(jìn)而溶劑進(jìn)入到物料內(nèi)部的擴(kuò)散路徑越短，加上超聲輔助浸提對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用，因此粉碎篩的孔徑越小越有利于黃酮類化合物的快速溶出[12]。當(dāng)藜麥粉碎孔徑小于0.250 mm提取的黃酮類化合物含量趨于平穩(wěn)，說(shuō)明繼續(xù)減小粉碎孔徑并不能進(jìn)一步提高黃酮類化合物浸出，推測(cè)與超聲快速破壁有關(guān)。此外，粉碎過(guò)細(xì)則固體過(guò)小，會(huì)加大后續(xù)過(guò)濾處理難度。因此，超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物要選擇合適的粉碎孔徑大小。

從圖2（b）可以看出，料液比由1∶25 g/mL增大到1∶50 g/mL時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量由3 mg/g提高到7 mg/g。在較低料液比時(shí)，加水量少導(dǎo)致藜麥顆粒與水接觸得不充分，結(jié)果部分黃酮類化合物不能及時(shí)溶出，造成提取量降低。當(dāng)料液比在1∶50～1∶150 g/mL范圍時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量保持在7 mg/g左右，表明藜麥黃酮類化合物已基本提取完全，而料液比過(guò)大則不利于提取液的濃縮。

圖2 超聲輔助浸提條件對(duì)藜麥黃酮類化合物的提取量影響

由圖2（c）可知，當(dāng)超聲提取溫度在室溫（24 ℃左右）到40 ℃時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量維持在5.50 mg/g左右。之后，超聲提取溫度為40～60 ℃時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量開(kāi)始緩慢地增加。當(dāng)超聲提取溫度從60 ℃提高到70 ℃時(shí)，黃酮類化合物的提取量隨著提取溫度的增高而急劇地增加，其中70 ℃下的藜麥黃酮類化合物的提取量達(dá)到9.85 mg/g。浸提溫度提高有助于增加黃酮類分子能量，促進(jìn)其氫鍵和疏水鍵斷裂，加大黃酮類分子和溶劑分子碰撞機(jī)率，從而快速提高其溶出速度[13]。但是，當(dāng)超聲提取溫度大于70 ℃時(shí)，黃酮類化合物的提取量出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，推測(cè)與提取溫度過(guò)高導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)被破壞，或黃酮類化合物物在較高溫度下發(fā)生分解和轉(zhuǎn)化有關(guān)[14]。

圖2（d）結(jié)果顯示，在超聲提取時(shí)間為0～30 min時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于藜麥顆粒與水充分接觸和超聲破壁效應(yīng)，有利于黃酮類化合物的溶出，其中超聲提取30 min時(shí)，藜麥黃酮類化合物的提取量達(dá)到11.00 mg/g。之后，延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間（＞30 min），黃酮類化合物提取量又出現(xiàn)大幅度的下降，隨后趨于平緩，推測(cè)可能與超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致熱效應(yīng)增加，促使已浸提出來(lái)的黃酮類化合物發(fā)生部分降解有關(guān)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)藜麥黃酮類化合物提取量影響大的藜麥粉碎孔徑、超聲提取溫度和超聲提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以藜麥黃酮類化合物的提取量為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程分析，確定Y（黃酮類化合物提取量）與A（粉碎孔徑）、B（超聲提取溫度）和C關(guān)系為：Y=11.718 75+0.225 4A-0.144 425B-0.063 857 5C-0.007 375AB+0.011 15AC+0.000 325BC-0.000 267A2+0.004 857B2-0.001 942C2。根據(jù)回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小和正負(fù)，可確定單因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度和影響方向[15]。由此可知，A（粉碎孔徑）對(duì)響應(yīng)值Y（黃酮類化合物提取量）有正向影響，而B(niǎo)（超聲提取溫度）和C（超聲提取時(shí)間）則對(duì)藜麥黃酮類化合物的提取量有一定程度負(fù)影響。

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析（見(jiàn)表3），其中模型p值0.004 6小于0.05，失擬項(xiàng)值0.057 5大于0.05，且模型R2=0.800 6，說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行Э尚?，可用于預(yù)測(cè)超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物工藝條件。當(dāng)p＜0.05表示因素對(duì)綜合評(píng)分值有顯著影響[16]，從表3可知，模型的一次項(xiàng)B和交互項(xiàng)AB和AC對(duì)響應(yīng)值影響顯著（p＜0.05），而模型的一次項(xiàng)A、C和交互項(xiàng)BC則對(duì)響應(yīng)值影響不顯著（p＞0.05）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

進(jìn)一步分析了粉碎孔徑和超聲提取溫度（AB），粉碎孔徑和超聲提取時(shí)間（AC），超聲提取溫度和超聲提取時(shí)間（BC）的交互作用對(duì)藜麥黃酮類化合物提取量的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3（a）分析得：當(dāng)粉碎孔徑一定時(shí)，隨著超聲提取溫度的升高，藜麥黃酮類化合物的提取量顯著提高，說(shuō)明超聲提取溫度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物黃酮類化合物的提取量具有顯著線性影響，即超聲提取溫度的升高可以促進(jìn)黃酮類物質(zhì)分子和溶劑分子碰撞，使得黃酮類化合物加速溶解，從而提高黃酮類化合物的提取量，但當(dāng)粉碎孔徑小于0.241 mm時(shí)，其影響并不明顯，其原因可能是物料粒徑較小，黃酮類化合物較快溶出，減弱超聲溫度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的提取作用。在一定的超聲溫度條件下，減小粉碎孔徑對(duì)黃酮類化合物提取有促進(jìn)作用，粒徑減小，物料與提取液接觸面積的增大，有利于溶劑充分提取藜麥黃酮類化合物。而當(dāng)超聲提取溫度為75～80 ℃時(shí)，減小粉碎孔徑對(duì)黃酮類化合物提取有減弱作用。

由圖3（b）可知：在超聲提取時(shí)間20～30 min時(shí)，超聲提取時(shí)間一定，藜麥黃酮類化合物的提取量隨粉碎孔徑增大而增加；在超聲提取時(shí)間為30～40 min時(shí)，隨著粉碎孔徑的增大，其提取量減少。當(dāng)粉碎孔徑為0.180～0.241 mm時(shí)，其提取量隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；當(dāng)粉碎孔徑為0.278～0.425 mm時(shí)，超聲提取時(shí)間延長(zhǎng)，其提取量顯著減少。說(shuō)明粉碎孔徑與超聲提取時(shí)間相互影響。

由圖3（c）可以看出：當(dāng)超聲提取時(shí)間一定時(shí)，超聲提取溫度升高有利于提高藜麥黃酮類化合物提取量；當(dāng)超聲提取溫度一定時(shí)，藜麥黃酮類化合物提取量隨著超聲提取時(shí)間的升高而下降，推測(cè)可能是由于超聲提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分黃酮類化合物質(zhì)不穩(wěn)定而降解，導(dǎo)致藜麥黃酮類化合物提取量的下降。

圖3 各因素交互作用對(duì)藜麥黃酮類化合物提取量的影響

經(jīng)響應(yīng)面分析確定，料液比為1∶100 g/mL條件下藜麥中黃酮類化合物的最優(yōu)浸提條件為粉碎孔徑0.425 mm、超聲提取溫度80 ℃和超聲提取20 min。經(jīng)測(cè)定，該條件下藜麥黃酮類化合物提取量達(dá)到12.09 mg/g，與理論預(yù)期值12.13 mg/g非常接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化確定的工藝條件可行。

2.3 藜麥黃酮類化合物的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

由圖4可知，藜麥黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基清除具有典型的劑量依賴性，即清除率隨著黃酮類化合物濃度的增加而增加。同樣，水溶性抗氧化劑抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除也具有劑量依賴性。但在低質(zhì)量濃度下，如0～4.0 μg/mL，藜麥黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基清除能力略高于抗壞血酸。當(dāng)質(zhì)量濃度為24 μg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到88%，藜麥黃酮類化合物的為72%，今后可以采用提高藜麥黃酮類化合物添加量方式提高其對(duì)DPPH自由基清除效果。

圖4 藜麥黃酮類化合物與抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率

2.3.2 總抗氧化能力

與清除DPPH自由基結(jié)果相似，藜麥黃酮類化合物和抗壞血酸的總抗氧化能力均表現(xiàn)出隨著濃度的增加而增大變化趨勢(shì)，且相同濃度下兩者抗氧化能力較為接近。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到24 μg/mL時(shí)，藜麥黃酮類化合物的總抗氧化能力可達(dá)0.62 U/μg，抗壞血酸達(dá)0.68 U/μg，兩者總抗氧化能力接近。但是，藜麥黃酮提取液還含有其他水溶性成分，如蛋白質(zhì)、肽、糖類等，因此藜麥黃酮提取液有作為營(yíng)養(yǎng)型抗氧化劑應(yīng)用前景。

圖5 藜麥黃酮類化合物與抗壞血酸的總抗氧能力

3 結(jié)論

在料液比1∶100 g/mL條件下，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到超聲輔助提取藜麥黃酮類化合物的最佳工藝條件為藜麥粉碎孔徑0.425 mm，超聲提取溫度80 ℃和超聲提取時(shí)間20 min，該條件下藜麥黃酮類化合物的提取量達(dá)到12.09 mg/g。經(jīng)測(cè)定提取的藜麥黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基清除效果和總氧化能力與水溶型抗氧劑抗壞血酸能力較為接近，為藜麥資源深度開(kāi)發(fā)利用提供一定技術(shù)依據(jù)。