徐曉裕，李甜，王歡，王斌，史學(xué)偉

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

果蔬生長和采后易發(fā)生因病原菌侵害引起的病害。病害控制方法主要有低溫貯藏、氣體調(diào)節(jié)和化學(xué)農(nóng)藥殺菌等，其中，氣體調(diào)節(jié)和低溫貯藏成本高、能耗高、質(zhì)量不穩(wěn)定，而化學(xué)殺菌劑的廣泛使用可增加藥物殘留，對環(huán)境和消費者的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1，2］。用生物防治技術(shù)取代傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防治是目前果蔬病害防治的研究熱點［3］。

芽孢桿菌（Bacillus）是人類較早發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌之一，在生長過程中可以產(chǎn)生脂肽類、抗菌蛋白等多種活性物質(zhì)，是生物防治中的優(yōu)勢微生物種群［4］。暹羅芽孢桿菌（B．siamensis）是由Sumpavapol等［5］首次分離出來的一種新型芽孢桿菌，其與解淀粉芽孢桿菌（B．a(chǎn)myloliquefaciens）、貝萊斯芽孢桿菌（B．velezensis）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B．methylotrophicus）在基因水平上同源性較高。目前對暹羅芽孢桿菌的研究還處于初步階段。Fan等［6］從土壤中分離出的暹羅芽孢桿菌Hs02對Fusarium oxysporum、F．solani和Phoma herbarum等植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用。利用抗菌肽防治果蔬害蟲是一項新技術(shù)。由于抗菌蛋白是暹羅芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量低，使其在生物防治中的應(yīng)用受到很大限制［7，8］。因此，研究抗菌蛋白的分離純化，增加獲取微生物資源的途徑，對控制采后病害具有重要意義。

本研究選用從葡萄園土壤中分離的對葡萄采后病原菌具有廣譜抑菌作用的暹羅芽孢桿菌為研究對象，對抗菌肽進(jìn)行分離純化，并探討其抑菌特性，以期為暹羅芽孢桿菌抗菌肽在葡萄采后生物防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料、試劑

暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）X7由本實驗室從葡萄園土壤中分離得到。黑曲霉（Aspergillus niger）從采后自然腐敗的鮮食葡萄果實中分離，并通過ITS區(qū)進(jìn)行鑒定。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL。

DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-75葡萄糖凝膠、十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司；過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G250、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、NaCl，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PDA培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、甲醇、石油醚、氯仿，上海麥克林生化科技有限公司。

1．2 儀器與設(shè)備

BSA224S萬分之一電子天平，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；LDZF-30L-II立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MJ-70F-I微生物恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Legend Micro 21臺式高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GelDoc XR+凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；GAL-EV3620高電流蛋白電泳儀，GALILEO Bioscience。

1．3 試驗方法

1．3．1 抗菌物質(zhì)的定位 將暹羅芽孢桿菌X7

接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，收集菌懸液分為3等份。第1份不做任何處理；第2份在4℃、12 000 r/min條件下離心得到發(fā)酵上清液和菌體沉淀；第3份離心后將發(fā)酵上清液通過0．22μm水系濾膜，制備發(fā)酵上清濾液。分別測定4個不同組分（菌液、發(fā)酵上清液、菌體沉淀、發(fā)酵上清濾液）的抑菌效果，每個處理3次重復(fù)［9］。

1．3．2 抗菌蛋白粗提液的制備 將暹羅芽孢桿菌X7的種子液按接種量3%接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，12 000 r/min離心30 min，去除菌體沉淀，得到發(fā)酵上清液。采用硫酸銨沉淀法提取菌體粗蛋白：發(fā)酵上清液邊攪拌邊緩慢添加經(jīng)過研磨的硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，并放置4℃冰箱中過夜。12 000 r/min離心10 min，離心所得沉淀溶于0．01 mol/L Tris-HCl（pH＝7．5，下同）后，透析脫鹽得到粗蛋白。分別測定硫酸銨不同飽和度下粗蛋白的抑菌效果，確定最佳硫酸銨飽和度［10，11］。

1．3．3 抗菌蛋白的分離與純化 步驟主要為：

（1）蛋白含量的測定：以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，蛋白含量的測定采用Bradford染色法［12］。

（2）Sephadex G-75凝膠層析：稱取適量Sephadex G-75干粉置于超純水中浸泡過夜，使其充分溶脹，適當(dāng)攪拌排除凝膠內(nèi)部氣泡，傾斜將懸浮于表面的細(xì)顆粒除去。用布氏漏斗將溶脹后的凝膠抽干后置于燒杯中，加入適量的0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液靜置1 h，平衡兩次并做排氣處理。裝柱平衡后，將5mL樣品沿內(nèi)壁緩慢加入層析柱后打開開關(guān)，使液面與凝膠齊平關(guān)閉開關(guān)，用少量0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液洗柱內(nèi)壁兩次，加0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液至凝膠面以上3 cm左右，開始洗脫，控制流速1 mL/min，人工收集洗脫液。每管收集5 mL，連續(xù)收集30管，并測定OD280值，將峰值處的層析液分別進(jìn)行抑菌活性測定。將具有抑菌活性的吸收峰流出液再次層析［13］。

（3）DEAE-Sephadex A-25層析：稱適量DEAE-Sephadex A-25粉末，用超純水充分溶脹。預(yù)處理完后裝柱，用0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡，上樣量為2 mL，流速為0．5 mL/min，每管收集2 mL。采用0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液與0～1mol/LNaCl洗脫液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集280 nm波長洗脫峰處的層析液，并進(jìn)行抑菌活性測定［14］。

（4）抗菌蛋白SDS-PAGE電泳分析：將純化的抗菌蛋白經(jīng)過超濾管過濾濃縮后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測（12%的分離膠和4%的濃縮膠）。將樣品放在轉(zhuǎn)速為30 r/min的振蕩器上，染色1 h后，用脫色液脫色至條帶清晰。利用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，凝膠樣品保存于ddH2O中［15］。

1．3．4 抗菌肽理化性質(zhì)測定 測定項目如下：

（1）溫度穩(wěn)定性測定：將抗菌肽溶解液配制成1 mg/mL，并將其分別在35、45、55、65、75、85、95、105、115℃加熱30 min，以置于室溫的樣品作為對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［16］。

（2）酸堿穩(wěn)定性測定：將抗菌肽溶解液配制成1 mg/mL，用2 mol/L HCl溶 液 和2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶解液pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11，室溫放置2 h后，放于4℃冰箱過夜，以自然pH值樣品為對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌圈試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［17］。

（3）光照穩(wěn)定性測定：將抗菌肽溶解液配制成1 mg/mL，將其放置在日光燈下（距離光源40 cm處），分別照射4、8、12、16、20、24、28、32 h。以未經(jīng)日光燈照射的樣品為對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［18］。

（4）紫外線穩(wěn)定性測定：將抗菌肽溶解液配制成1 mg/mL，于超凈工作臺中用40 W 紫外燈（距離30 cm處）分別照射1、3、5、7、9、11 h。以未被紫外燈照射的樣品為對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［11］。

（5）蛋白酶敏感性測定：向抗菌肽溶解液中分別加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，使蛋白酶最終濃度為1 mg/mL，28℃水浴2 h，70℃水浴3 min使酶失活。以未經(jīng)處理的粗蛋白作對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［19］。

（6）有機(jī)試劑敏感性測定：向抗菌肽溶解液中分別加入50 mg/mL的甲醇、石油醚、氯仿，4℃條件下靜置過夜。以未經(jīng)處理的蛋白溶液作對照，采用平板對峙法進(jìn)行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑，每個處理3次重復(fù)［20］。

1．4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均取3次重復(fù)試驗的平均值，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗，利用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗菌肽的分離與純化

2．1．1 抑菌物質(zhì)的定位 由圖1可知，不同發(fā)酵液成分均具有一定的抑菌效果。發(fā)酵上清濾液、發(fā)酵上清液、菌液的抑菌效果差異不顯著（P＞0．05），抑菌物質(zhì)可以通過細(xì)菌過濾器，且不會隨著離心沉淀。表明暹羅芽孢桿菌X7具有較高的抑菌特性，且抑菌物質(zhì)是分泌于胞外的某種物質(zhì)。

圖1 不同發(fā)酵液成分的抑菌效果

2．1．2 硫酸銨最佳飽和度 從圖2可以看出，當(dāng)硫酸銨飽和度為10%～30%時，抗菌蛋白粗提液無抑菌效果；當(dāng)硫酸銨飽和度在40% ～60%時，隨飽和度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，且差異顯著（P＜0．05）；當(dāng)飽和度為60%時，抑菌圈直徑為22．36 mm，隨著飽和度的繼續(xù)增加，抑菌圈直徑減小。故選擇60%的硫酸銨飽和度分離抗菌蛋白。

圖2 硫酸銨不同飽和度下抗菌蛋白粗提液的抑菌效果

2．1．3 Sephadex G-75凝膠層析 將透析后的粗酶液樣品上樣于葡聚糖凝膠G-75中，層析分離結(jié)果如圖3所示。收集的30管流出液，出現(xiàn)了G1、G2和G3共3個洗脫峰。將這3個洗脫峰做抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)G1具有抑菌效果，G2和G3均無抑菌效果。將G1通過離子交換層析進(jìn)一步分離純化。

圖3 Sephadex G-75凝膠層析

2．1．4 DEAE-Sephadex A-25層析 將具有抑菌效果的G1上樣于DEAE-Sephadex A-25進(jìn)行離子交換層析后，得到D1和D2兩個洗脫峰（圖4）。抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)只有D1具有抑菌活性。將具有抑菌活性的洗脫峰收集并做SDSPAGE檢測。

圖4 DEAE-Sephadex A-25層析

2．1．5 抗菌肽的分離純化 從表1可以看出，經(jīng)硫酸銨沉淀得到5．90 mg粗蛋白溶液，最終得到1．69 mg目的蛋白，得率為28．64%。

表1 抗菌肽的分離純化

2．1．6 抗菌肽的SDS-PAGE電泳分析 對分離純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，表明經(jīng)過兩次層析之后的抗菌蛋白得到有效分離，大部分雜蛋白被去除，出現(xiàn)單一條帶，分子量為20．1 kDa（圖5）。

1：抗菌蛋白；Marker：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

2．2 抗菌肽的性質(zhì)

2．2．1 抗菌肽酸堿穩(wěn)定性 由圖6可知，抗菌肽物質(zhì)在pH值為3～11之間均有一定的抑菌效果?？咕牡囊志钚噪S著pH值的升高先升高后降低，pH值在5～7之間具有最高的抑菌活性，且抑菌活性無顯著差異（P＞0．05）。表明，抗菌肽在pH值為5～7之間有較好的穩(wěn)定性。

圖6 不同pH值對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

2．2．2 抗菌肽溫度穩(wěn)定性 由圖7可知，當(dāng)溫度在35～105℃下，抗菌肽均有一定的抑菌效果。65℃以下抗菌肽的抑菌效果無顯著變化（P＞0．05），75℃時抑菌效果開始顯著下降，105℃時抑菌效果僅為對照組的32．3%。表明，抗菌肽具有一定的熱穩(wěn)定性，溫度適應(yīng)性較廣。

圖7 不同溫度對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

2．2．3 抗菌肽光照穩(wěn)定性 由圖8可知，光照時間在4～32 h下，抑菌效果相較于對照組無顯著變化（P＞0．05）。可見抗菌肽對光照具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2．2．4 抗菌肽紫外線穩(wěn)定性 由圖9可知，與對照組相比，紫外照射時間在3 h內(nèi)時，抑菌效果無顯著差異（P＞0．05）。隨著紫外照射時間的增加，抑菌效果逐漸降低。總體看來，抗菌肽對紫外照射不敏感。

2．2．5 抗菌肽蛋白酶、有機(jī)試劑穩(wěn)定性 與對照組相比，不同蛋白酶和有機(jī)試劑處理下的抗菌肽抑菌圈直徑無顯著變化（P＞0．05，圖10、圖11）。說明抗菌肽對蛋白酶和有機(jī)試劑具有一定的穩(wěn)定性。

圖8 不同光照時間對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

圖9 紫外線照射時間對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

圖10 不同蛋白酶對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

圖11 不同有機(jī)試劑對抗菌肽穩(wěn)定性的影響

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌屬是研究最多且廣泛應(yīng)用于生物防治的細(xì)菌［21，22］。作為一種生防菌株，主要通過生產(chǎn)各種生物活性化合物（如脂肽和聚酮化合物）發(fā)揮作用［23］。近年來，有研究者從多種樣品中分離到具有不同功能的芽孢桿菌及其抗菌肽。從土壤中分離出的解淀粉芽孢桿菌RX7產(chǎn)生的抗菌肽具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，在80℃處理30 min后活性完全保留，之后在較高溫度下逐漸降低；該抗菌肽對α-糜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感［24］。從土壤樣品中分離的地衣芽孢桿菌VPS50．2中的新型抗利氏桿菌素地衣菌素50．2對溶菌酶和蛋白酶K不敏感，在100℃下處理30 min或在較大pH值范圍（2～12）內(nèi)仍然保持良好的穩(wěn)定性［25］?？咕膶暧^生物和環(huán)境安全，幾乎沒有副作用，也不會引起敏感性和免疫抑制，因此已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)等［26］。

生物防治是選擇對產(chǎn)品以及人體不造成危害的微生物，利用微生物之間的拮抗作用抑制病原菌生長的一種有效防治病害的新途徑。本試驗通過60%硫酸銨飽和溶液沉淀透析除鹽，從暹羅芽孢桿菌X7中分離到抗菌粗蛋白，經(jīng)DEAESephadex A-25層析、Sephadex G-75凝膠層析、SDS-PAGE純化得到抗菌蛋白。該抗菌蛋白的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性，對蛋白酶以及有機(jī)試劑不敏感，可以考慮將該菌用于果蔬采后病害防治。