微波輔助法提取竹葉花椒黃酮的結(jié)構(gòu)特征

何鑫柱，李潮俊，陳凱，康明，梁曉峰*

1. 西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院（綿陽 621010）；2. 四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校川西北中藥材資源研究與開發(fā)利用實驗室（綿陽 621010）

竹葉花椒（Zanthoxylum armatumDC.）為蕓香科花椒屬植物，主要分布在中國西南、華中、華北和華東等地區(qū)，其根、莖、葉、果實、種子均可入藥，主治胃腑冷痛，風(fēng)濕關(guān)節(jié)等[1]。竹葉花椒中含有揮發(fā)油、黃酮、木質(zhì)素、生物堿等活性成分[2]，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理功效[3-5]。其中的黃酮類物質(zhì)是天然多酚類化合物，具有多種生物活性。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)中，2個苯環(huán)通過1個C3部分聯(lián)結(jié)形成C6—C3—C6骨架，由于聯(lián)結(jié)方式、連接位置、氧化水平及聚合程度等不同，使得黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)豐富多樣，理化性質(zhì)及生物活性表現(xiàn)各不相同[6-7]。利用現(xiàn)代分析測試技術(shù)對黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性能進行表征研究是黃酮研究和開發(fā)利用的重要內(nèi)容，隨著現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)測定手段發(fā)展，許多新的黃酮類化合物得以發(fā)現(xiàn)[8]。近年來，對竹葉花椒的活性成分提取及其藥用性能等開展較多研究[9-10]，對竹葉花椒中總黃酮的提取、分離研究取得積極進展。利用微波輔助提取法獲得提取黃酮類物質(zhì)的工藝參數(shù)。

對微波輔助法提取竹葉花椒總黃酮進一步研究分析，用聚酰胺-大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法純化竹葉花椒中的總黃酮，利用現(xiàn)代分析測試技術(shù)研究竹葉花椒黃酮的譜學(xué)特征、顯微形貌、熱穩(wěn)定性等特征，對豐富黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性能數(shù)據(jù)及竹葉花椒綜合開發(fā)利用具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的竹葉花椒果皮（成都蜀荊味商貿(mào)有限公司）；95%乙醇、石油醚（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；聚酰胺（0.250～0.600 mm，即30～60目）、D101大孔吸附樹脂（上海麥克林生化科技）。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartorius BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；YTLG-12A冷凍干燥機（上海葉拓科技有限公司）；XH-MC-1實驗室微波合成儀（祥鵠科技）；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；UV-315紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Nicolet-5700紅外吸收光譜（美國熱電儀器有限公司）；RF-6000熒光光譜儀（日本日立公司）；X Pert pro X-射線衍射儀（荷蘭帕納科）；UItra55高分辨冷場發(fā)射掃描顯微鏡（德國卡爾·蔡司NTS有限公司）；SDT Q160熱分析儀（美國TA儀器公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹葉花椒中黃酮的提取

將竹葉花椒果皮用粉碎機粉碎，稱取適量粉末，加入原料30倍的60%乙醇溶液，用微波輔助法提取，提取溫度80 ℃，提取時間25 min，微波功率400 W，提取液先進行抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，用石油醚進行脫脂處理[11]，冷凍干燥得到黃酮粗提物；用聚酰胺-大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法進行純化[12]，得到淡黃色粉末狀黃酮純化物。

1.3.2 紫外可見光譜測試

分別稱取黃酮粗提物黃酮純化物適量，用60%乙醇溶液溶解，利用UV-315紫外可見分光光度計掃描，掃描范圍為200～800 nm。

1.3.3 紅外吸收光譜測試

利用Nicolet-5700紅外光譜儀掃描制備好的黃酮粗提物與純化物的溴化鉀片，分辨率0.4 cm-1，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.4 X-射線衍射測試?yán)肵 Pert pro X-射線衍射儀對制備好的黃酮粗提物和純化物進行測試，其掃描角度3°～80°。

1.3.5 掃描電鏡測試

將黃酮粗提物和純化物粉末用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，進行噴金處理，利用UItra55高分辨冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡對其形貌進行觀察。

1.3.6 熒光光譜測試

分別稱取黃酮粗提物和純化物適量，用60%乙醇溶液溶解，利用RF-6000熒光光譜儀進行測試，激發(fā)光波長365 nm，掃描范圍為385～710 nm。

1.3.7 熱重測試

利用SDT Q160熱分析儀對黃酮粗提物和純化物進行測試，測試氛圍為N2，N2流速100 mL/min，升溫范圍為室溫-800 ℃，升溫速率10 ℃/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉花椒黃酮的紫外可見光譜

竹葉花椒黃酮粗提物與純化物的紫外可見光譜圖如圖1所示。粗提物的吸收峰位于259.5，269.5，279.5和328 nm，其中259.5和279.5 nm為肩峰；粗提物的吸收帶Ⅰ較弱，吸收帶Ⅱ較強，在吸收帶Ⅱ處伴有雙肩峰，這可能是由于提取物中異黃酮或二氫黃酮等引起[13]。樣品經(jīng)純化后，其紫外可見光譜主要有2個吸收峰，分別位于279和330 nm處，未見肩峰。黃酮類化合物具有C6—C3—C6這一基本結(jié)構(gòu)，其紫外光譜在220～400 nm范圍內(nèi)一般有2個主要吸收帶，峰帶Ⅰ（300～400 nm）和峰帶Ⅱ（220～280 nm），帶Ⅰ主要是B環(huán)肉桂酰生色團的電子躍遷產(chǎn)生的吸收帶，帶Ⅱ主要是A 環(huán)的苯甲酰生色團的電子躍遷產(chǎn)生的吸收帶[14]，由此推斷竹葉花椒黃酮具有黃酮類化合物的紫外特征吸收峰。其中帶Ⅰ內(nèi)的吸收峰峰寬大而且不夠尖銳，其造成的原因可能是提取物在300～400 nm內(nèi)有吸收峰的物質(zhì)較多，即B環(huán)取代基的位置復(fù)雜[15]。

圖1 黃酮粗提物（a）與純化物（b）的紫外可見光譜圖

2.2 竹葉花椒黃酮的紅外吸收光譜

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的紅外光譜圖如圖2所示。黃酮粗提物和純化物的紅外吸收特征峰相似，在3414 cm-1處有1個極強的吸收峰，這是酚羥基的特征譜峰[16]；2973 cm-1處為甲基C—H的反對稱伸縮振動吸收峰；2928 cm-1處為亞甲基C—H的反對稱伸縮振動吸收峰；1669 cm-1處為羰基C＝O的伸縮振動吸收峰[17]；1627，1518和1450 cm-1為苯環(huán)骨架的振動吸收峰；1385 cm-1處為甲基C—H的對稱變角振動吸收峰；1300 cm-1以下，1284，1160，1048和955 cm-1等是糖環(huán)中的C—O的伸縮振動吸收峰；880，824和767 cm-1為芳環(huán)上CH的面外彎曲振動吸收峰。黃酮純化物與粗提物相比，黃酮純化物的紅外光譜分辨率更高，特征官能團更加突出。

圖2 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的紅外光譜圖

2.3 竹葉花椒黃酮的結(jié)晶性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物平滑后的X-射線衍射圖如圖3所示。黃酮純化物在23°附近有一個衍射強度弱的寬峰，這是一個典型的無定型粉末特征衍射峰，其他位置幾乎沒有衍射峰，由此推斷黃酮純化物為無定型粉末；黃酮粗提物在28.3°，40.5°和66.3°有強度弱的衍射峰出現(xiàn)，在23°附近有一個衍射強度弱的寬峰，也由此推斷黃酮粗提物為無定型粉末。

圖3 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的X-射線衍射圖

2.4 竹葉花椒黃酮的微觀形貌

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的掃描電鏡如圖4所示。圖4（a和b）分別是黃酮粗提物在500倍和5000倍下的微觀形貌，圖4（c和d）分別是黃酮純化物在500倍和5000倍下的微觀形貌。由圖4可見，黃酮粗提物在高倍鏡下可以明顯地觀察到片狀、棒狀、橢圓狀和微球等結(jié)構(gòu)。其中，片狀、棒狀、橢圓狀的形貌不規(guī)整，尺寸大小不均一，主要在幾個微米和幾十個微米之間；微球狀結(jié)構(gòu)的形貌規(guī)整，但分布不均勻，尺寸大小約1 μm左右。黃酮純化物在高倍鏡下可以明顯的觀察其大部分都是形貌比較規(guī)整的微球，尺寸大小主要為1 μm左右，此外還具有薄膜狀結(jié)構(gòu)。

圖4 黃酮粗提物（a和b）和純化物（c和d）的掃描電鏡圖

2.5 竹葉花椒黃酮的發(fā)光特性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物在365 nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜圖如圖5所示。它們都具有2個明顯的熒光發(fā)射峰，黃酮粗提物發(fā)射峰位分別在450 nm和670 nm；黃酮純化物發(fā)射峰分別位于457 nm和667 nm。熒光是電子從第一激發(fā)單重態(tài)躍遷回基態(tài)所產(chǎn)生的降級輻射[18]，能強烈發(fā)光的分子幾乎都是通過吸收π→π*躍遷而達到電子激發(fā)態(tài)的，一般只有那些具有共軛雙鍵，尤其是具有剛性平面和多環(huán)結(jié)構(gòu)的分子才有利于發(fā)光，黃酮是一類具有多環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因此黃酮類物質(zhì)會具有較強的熒光性能。黃酮純化物的熒光性能比粗提物的強，這是由于黃酮純化物中黃酮類物質(zhì)的含量更高，具有多環(huán)結(jié)構(gòu)的分子更多，更有利于發(fā)光。

圖5 黃酮粗提物（a）和純化物（b）的熒光發(fā)射光譜圖

2.6 竹葉花椒黃酮的熱穩(wěn)定性

竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的熱重（thermogravimetric，TG）和微商熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線見圖6。由黃酮粗提物和純化物主要有4個失重階段，第1個階段主要是提取物中吸附水和結(jié)晶水的損失[19]，第2個階段主要是提取物中的一些黃酮類物質(zhì)和其他有機物的分解，第3個階段提取物的失重區(qū)間較短，失重率較低，可能是由于提取物中的某一種黃酮類物質(zhì)分解導(dǎo)致，第4個階段提取物在到達最快失重溫度264 ℃后，失重率逐漸降低，這時提取物進入預(yù)碳化階段[20]，具有較高熱穩(wěn)定性的黃酮類物質(zhì)開始分解，溫度達到700 ℃后質(zhì)量變化不大，提取物在該溫度下幾乎完全碳化。黃酮純化物的熱穩(wěn)定性比粗提物更好，殘?zhí)柯史謩e為40.28%和34.09%。

圖6 黃酮粗提物（上）和純化物（下）的TG和DTG曲線

3 結(jié)論

運用現(xiàn)代分析測試技術(shù)對竹葉花椒黃酮粗提物和純化物的結(jié)構(gòu)與性能進行研究。紫外光譜表明黃酮提取物中有黃酮類物質(zhì)的特征吸收帶；紅外光譜表明提取物中具有酚羥基、羰基和苯環(huán)等黃酮類物質(zhì)的特征振動吸收峰；X-射線衍射圖譜表明提取物為無定型粉末；掃描電鏡表明提取物為1 μm左右的球狀結(jié)構(gòu)；提取物在365 nm激發(fā)波長下會在450 nm和670 nm左右分別發(fā)出藍色和紅色的熒光；純化黃酮的加熱失重率達60%，主要有4個失重階段，最快失重溫度為264 ℃。