袁國徽, 田志慧, 高 原, 沈國輝

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403)

千金子Leptochloa chinensis(L.) Nees 屬一年生禾本科雜草，是一種世界性農(nóng)田惡性雜草，在我國主要分布于華東、華中、華南、西南及陜西省等地[1-2]。由于水稻栽培制度的變化和除草劑長期單一使用，千金子在南方稻區(qū)迅速蔓延，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。

乙酰輔酶A 羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase，ACCase) 抑制劑是以ACCase 為作用靶標(biāo)的一類除草劑，主要包括芳氧苯氧基丙烯酸酯類 (APPs)、環(huán)己烯酮類 (CHDs) 及苯基吡唑啉類 (PPZs)，多用于苗后一年生禾本科雜草的防除。氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈均屬于APPs 除草劑，是目前防除水稻田千金子的主要藥劑。近年來，上海市多個地區(qū)水稻田千金子使用APPs 除草劑防除失敗，表現(xiàn)出較嚴(yán)重的抗藥性，已成為該地區(qū)稻田雜草防除的一大難題[4]。研究表明，ACCase 抑制劑類除草劑極易導(dǎo)致雜草抗藥性的產(chǎn)生[5-6]。截至目前，全球已報道49 種雜草對該類除草劑產(chǎn)生了抗性，2002 年首次報道了千金子對ACCase 抑制劑類除草劑的抗性[7]。靶標(biāo)酶基因位點突變是雜草對ACCase 抑制劑類除草劑最常見的抗性機(jī)制，目前已發(fā)現(xiàn)7 個ACCase 氨基酸位點突變能夠?qū)е码s草對該類除草劑產(chǎn)生抗性，分別是第1781 位異亮氨酸 (Ile)、第1999 位色氨酸 (Trp)、第2027 位Trp、第2041 位Ile、第2078 位天冬氨酸 (Asp)、第2088 位半胱氨酸 (Cys) 以及第2096 位甘氨酸 (Gly)[8-10]。Yu 等[11]在 2016 年首次報道了ACCase 基因第2027 位Trp 突變?yōu)镃ys 是千金子對ACCase 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的原因。此外，研究發(fā)現(xiàn)ACCase 抑制劑類除草劑被快速代謝解毒也是雜草產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一[12-13]。文馬強(qiáng)等[2]研究發(fā)現(xiàn)，千金子抗性種群對氰氟草酯產(chǎn)生抗性可能與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶(POD) 及過氧化氫酶 (CAT) 的活力增強(qiáng)有關(guān)。目前關(guān)于抗性千金子對除草劑降解和代謝的研究仍局限于酶活性測定的初步探究階段[8]。

本研究在上海市千金子發(fā)生較為嚴(yán)重的地區(qū)采集了51 個千金子種群，測定了其對ACCase 抑制劑類除草劑氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈的抗性水平，并對抗性種群進(jìn)行了靶標(biāo)酶基因檢測，以期進(jìn)一步明確上海市水稻田抗性千金子種群的發(fā)生情況及可能存在的靶標(biāo)抗性機(jī)制，旨在為千金子防除策略制定和延緩其抗性種群發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 千金子種子 2016 年和2017 年9?10 月采集于上海市千金子發(fā)生較為嚴(yán)重的8 個區(qū) (崇明區(qū)、奉賢區(qū)、嘉定區(qū)、金山區(qū)、閔行區(qū)、浦東新區(qū)、青浦區(qū)及松江區(qū)) 水稻田，共采集51 個千金子種群，所有種子晾干后置于4 ℃冰箱中儲存，待用。采集地點等具體信息見表1。

表1 千金子種群的采集地點Table 1 Source locations of the L. chinensis populations examined in this study

1.1.2 除草劑 100 g/L 氰氟草酯 (cyhalofop-butyl)乳油 (EC)，美國陶氏益農(nóng)公司；10%唑酰草胺(metamifop) 乳油，美國富美實公司；69 g/L 精唑禾草靈 (fenoxaprop-P-ethyl) 水乳劑 (EW)，拜耳股份公司。

1.1.3 生物試劑和主要儀器 高效植物基因組DNA 提取試劑盒 (Hi-DNAsecure Plant Kit)，天根生化科技 (北京) 有限公司；Taq酶 (TransStart?TopTaqDNA Polymerase)，北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech) 有限公司。ASS-4 型化學(xué)農(nóng)藥實驗自動控制噴灑系統(tǒng)，北京盛恒天寶科技有限公司生產(chǎn)；5804R 型高速冷凍離心機(jī)，德國 Eppendorf公司；T100 Thermal Cycler PCR 儀，美國Bio-Rad公司；Tannon-1600 全自動數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；DYY-8C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GR60DR 高壓滅菌器，致微 (廈門) 儀器有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MGC-450HP人工氣候箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 千金子種群室內(nèi)整株生物測定 采用單劑量抗性甄別法[14]測定各千金子種群對ACCase 抑制劑類除草劑氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈的敏感性。從各千金子種群中分別選取均勻一致的種子播種于填有壤土，長、寬各為10 cm的方形塑料盆缽內(nèi)，每盆播種20 粒，置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng) (光周期L/D：12 h/12 h；白天 30 ℃，晚上25 ℃；相對濕度 70%)。待千金子長至2 葉期時間苗，每盆保留長勢一致的幼苗15 株。于3～4 葉期時采用ASS-4 型自動控制噴灑系統(tǒng)進(jìn)行莖葉噴霧處理，用水量為450 L/hm2，噴霧壓力為0.275 MPa。3 種除草劑有效成分施用劑量分別為：氰氟草酯105 g/hm2，唑酰草胺120 g/hm2，精唑禾草靈62.1 g/hm2；以清水處理為空白對照。藥后21 d 調(diào)查記錄每個種群的存活株數(shù)，計算存活率。每處理4 次重復(fù)，整體試驗重復(fù)2 次。

1.2.2 千金子種群ACCase 基因突變檢測 基于

1.2.1 節(jié)的抗性測定結(jié)果，從各發(fā)展中抗性 (DR)種群和抗性 (R) 種群中分別隨機(jī)選取60 株千金子幼苗，利用Hi-DNAsecure Plant Kit 分別提取單株的基因組DNA。參考已報道的千金子引物進(jìn)行ACCase 基因片段擴(kuò)增[9]，所用引物序列分別為QJ-F：5′-ATTCCTATGGAGCGTCCTG-3′ 和QJR：5′- TCCTTCGCAAGAACATCC-3′，所擴(kuò)增序列包含了目前已知能夠賦予抗性的所有突變位點。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系體積為50 μL，包括基因DNA 模板2 μL，正反向引物 (10 μmol/L) 各1 μL，TransStart? TopTapDNA Polymerase (2.5 units/μL)1 μL，10 ×TransStart? TopTapBuffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，ddH2O 36 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，將含目的條帶的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。測序所得核苷酸序列于NCBI 庫中進(jìn)行BLAST 比對，以確定所得序列是否為目標(biāo)基因序列。采用Chromas 2.23 軟件分析ACCase 基因的Ile-1781、Trp-1999、Trp-2027、Ile-2041、Asp-2078、Cys-2088、Gly-2096 氨基酸位點處是否發(fā)生了堿基置換、移位、缺失和插入等非同義突變情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。根據(jù)千金子種群存活率判定抗性程度：存活率小于1%為敏感 (S) 種群，介于1%～20%之間為發(fā)展中抗性 (DR) 種群，大于20%則為抗性 (R)種群[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同千金子種群對3 種ACCase 抑制劑類除草劑的抗性發(fā)生程度

由表2 可看出，在氰氟草酯105 g/hm2有效成分劑量選擇壓下，2016-JD1、2016-JD2、2017-CM1、2017-CM3、2017-CM9、2017-JD4、2017-JD5 和2017-JS2 種群的存活率均大于23%，標(biāo)記為抗性種群；2016-JD5、2017-JD2、2017-JD3、2017-JS1、2017-PD1 和2017-PD5 種群的存活率在2%～19%之間，標(biāo)記為發(fā)展中抗性種群；其余千金子種群均為敏感種群，存活率為0。由抗性千金子種群的分布范圍看，上海市嘉定區(qū)、崇明區(qū)、金山區(qū)和浦東新區(qū)水稻田發(fā)現(xiàn)的抗性種群和發(fā)展中抗性種群較多。

表2 不同千金子種群在氰氟草酯105 g/hm2 有效成分劑量處理下的存活率和抗性分類Table 2 The survival rate and resistant category of the L. chinensis populations against cyhalofop-butyl at 105 g (a.i.)/hm2

表3 不同千金子種群在唑酰草胺120 g/hm2 有效成分劑量下的存活率和抗性分類Table 3 The survival rate and resistant category of the L. chinensis populations against metamifop at 120 g (a.i.)/hm2

表3 不同千金子種群在唑酰草胺120 g/hm2 有效成分劑量下的存活率和抗性分類Table 3 The survival rate and resistant category of the L. chinensis populations against metamifop at 120 g (a.i.)/hm2

注：a 敏感種群 (S)：存活率 <1%；發(fā)展中抗性種群 (DR)：存活率在1% ～ 20%之間；抗性種群 (R)：存活率 >20%。Note: a Susceptible population (S): survival rate <1%; development of resistance population (DR): 1%≤ survival rate ≤20%; resistant population (R):survival rate >20%.

2016-FX1 0 S 2017-JD2 5.0 DR 2016-FX2 0 S 2017-JD3 0 S 2016-JD1 62.5 R 2017-JD4 0 S 2016-JD2 100 R 2017-JD5 6.7 DR 2016-JD3 0 S 2017-JD6 0 S 2016-JD4 0 S 2017-JS1 0 S 2016-JD5 0 S 2017-JS2 0 S 2016-QP1 0 S 2017-JS3 0 S 2016-QP2 0 S 2017-JS4 0 S 2016-QP3 5.8 DR 2017-JS5 0 S 2016-SJ1 0 S 2017-JS6 0 S 2016-SJ2 0 S 2017-JS7 0 S 2017-CM1 28.3 R 2017-MH1 0 S 2017-CM2 0 S 2017-PD1 0 S 2017-CM3 5.0 DR 2017-PD2 0 S 2017-CM4 0 S 2017-PD3 0 S 2017-CM5 0 S 2017-PD4 0 S 2017-CM6 0 S 2017-PD5 3.3 DR 2017-CM7 0 S 2017-PD6 0 S 2017-CM8 0 S 2017-PD7 0 S 2017-CM9 45.0 R 2017-PD8 0 S 2017-FX1 0 S 2017-PD9 0 S 2017-FX2 0 S 2017-QP1 0 S 2017-FX3 0 S 2017-QP2 0 S 2017-FX4 0 S 2017-QP3 0 S 2017-JD1 0 S

表4 不同千金子種群在精唑禾草靈62.1 g/hm2 有效成分劑量下的存活率和抗性分類Table 4 The survival rate and resistant category of the L. chinensis populations against fenoxaprop-P-ethyl at 62.1 g (a.i.)/hm2

表4 不同千金子種群在精唑禾草靈62.1 g/hm2 有效成分劑量下的存活率和抗性分類Table 4 The survival rate and resistant category of the L. chinensis populations against fenoxaprop-P-ethyl at 62.1 g (a.i.)/hm2

種群Population抗性分類a Resistant category 2016-FX1 0 S 2017-JD2 35.8 R 2016-FX2 0 S 2017-JD3 0 S 2016-JD1 61.7 R 2017-JD4 0 S 2016-JD2 100 R 2017-JD5 11.7 DR 2016-JD3 0 S 2017-JD6 0 S 2016-JD4 0 S 2017-JS1 0 S 2016-JD5 0 S 2017-JS2 0 S 2016-QP1 0 S 2017-JS3 0 S 2016-QP2 0 S 2017-JS4 0 S 2016-QP3 0 S 2017-JS5 0 S存活率Survival rate/%抗性分類a Resistant category種群Population存活率Survival rate/%

續(xù)表4Table 4 (Continued)

2.2 不同千金子種群ACCase 基因抗性突變鑒定

BLAST 比對結(jié)果表明，所得核苷酸序列與親緣關(guān)系較近的大穗看麥娘Alopecurus myosuroides對應(yīng)基因的同源性均大于95%。將翻譯后的氨基酸序列與大穗看麥娘進(jìn)行比對，結(jié)果顯示：2016-JD1、2016-JD2、2017-CM1、2017-CM3、2017-CM9、2017-JD2、2017-JD5、2017-PD1 和2017-PD5 這9 個種群均發(fā)生了靶標(biāo)基因突變 (表5)。其中，2016-JD1 和2016-JD2 種群ACCase 基因第1999 位氨基酸密碼子由TGG 突變?yōu)門CG，導(dǎo)致Trp 突變?yōu)镾er；2017-JD2、2017-JD5 和2017-PD5 種群ACCase 基因第1999 位氨基酸密碼子由TGG 突變?yōu)門GT，導(dǎo)致Trp 突變?yōu)镃ys；2017-CM3、2017-CM9 和2017-PD1 種群ACCase 基因第2027 位氨基酸密碼子由TGG 突變?yōu)?TCG，導(dǎo)致Trp 突變?yōu)镾er；在2017-CM1、2017-CM3 和2017-JD2 種群中發(fā)現(xiàn)了ACCase 基因第2027 位氨基酸Trp 被Cys 取代，該突變由密碼子TGG 突變?yōu)門GT 或TGC 所致。本研究發(fā)現(xiàn)，2017-CM3 和2017-JD2 種群同時存在兩種ACCase 基因突變類型，而2016-JD5、2016-QP3、2017-JD3、2017-JD4、2017-JS1 和2017-JS2 這6 個種群均未發(fā)現(xiàn)已知氨基酸位點的突變。

表5 抗性千金子種群中ACCase 基因突變形式及突變頻率Table 5 ACCase gene mutation form and mutation ratio of the resistant L. chinensis populations

通過對各千金子種群單株測序結(jié)果進(jìn)行分析，得到不同種群的ACCase 基因突變頻率 (表5)。2016-JD1、2016-JD2、2017-CM1、2017-CM9 和2017-JD5 5 個種群的靶標(biāo)基因突變頻率均大于60%，其中2016-JD2 種群突變頻率最高，達(dá)96.7%；2017-JD2、2017-PD1 和2017-PD5 種群的突變頻率 ≤ 20%， 其中2017-PD1 種群突變頻率最低，僅為5%。

3 結(jié)論與討論

氰氟草酯由美國陶氏益農(nóng)公司開發(fā)，對千金子有特效，于2006 年在我國正式登記用于水稻田苗后防除禾本科雜草[17]。唑酰草胺是由韓國東部韓農(nóng)化學(xué)公司開發(fā)的水稻田禾本科雜草的苗后除草劑，于2010 年在我國登記[18]。精唑禾草靈由德國拜耳公司開發(fā)，加入安全劑解草唑 (fenchlorazole) 后，于1998 年登記用于小麥田禾本科雜草防除[19]。根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng) (http://www.icama.org.cn/) 的查詢結(jié)果，精唑禾草靈和氰氟草酯的復(fù)配制劑于2009 年首次登記用于水稻田防除一年生禾本科雜草。因此，氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈在我國水稻田應(yīng)用均已有十多年的歷史。ACCase 抑制劑類除草劑屬于高抗性風(fēng)險級別[20]，據(jù)報道，該類除草劑連續(xù)重復(fù)使用6～10 年就可導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗藥性[21]。本研究所測的上海市51 個千金子種群中，8 個種群對氰氟草酯可標(biāo)記為抗性，6 個種群為發(fā)展中抗性；4 個種群對唑酰草胺可標(biāo)記為抗性，5 個種群為發(fā)展中抗性；6 個種群對精唑禾草靈可標(biāo)記為抗性，2 個種群為發(fā)展中抗性。分析所得結(jié)果可以看出，抗氰氟草酯、抗唑酰草胺和抗精唑禾草靈的千金子種群之間存在著一定程度的一致性，但又并非完全一致，這可能與采集地點作物種植模式、用藥歷史背景以及其抗性機(jī)制等因素不同有關(guān)。

靶標(biāo)抗性機(jī)制和非靶標(biāo)抗性機(jī)制是雜草對ACCase 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的兩大原因[22]，多數(shù)情況下，ACCase 基因靶標(biāo)位點突變是導(dǎo)致雜草抗藥性產(chǎn)生的主要原因[23]。到目前為止，已報道7 種ACCase 氨基酸突變方式與千金子的抗藥性相關(guān)，分別是Ile-1781-Leu、Ile-1781-Val、Trp-1999-Cys、Trp-1999-Ser、 Trp-2027-Cys、Trp-2027-Ser 和Ile-2041-Asn[4,24-26]。本研究對15 個抗性千金子種群的 ACCase 基因部分片段進(jìn)行了克隆和序列比對，在9 個抗性種群中共發(fā)現(xiàn)了4 種氨基酸突變方式：Trp-1999-Ser、Trp-1999-Cys、Trp-2027-Ser 和 Trp-2027-Cys。因此，ACCase 基因中1999 位點及2027 位點的氨基酸突變可能是導(dǎo)致千金子對ACCase 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一，這一結(jié)論與楊浩娜等[8]關(guān)于千金子對氰氟草酯產(chǎn)生的較高抗性與其靶標(biāo)基因2027 和1999 位點氨基酸突變有關(guān)的報道一致。武向文等[4]首次報道了Trp-1999-Ser 突變是千金子對氰氟草酯產(chǎn)生抗性的原因，但其未測定交互抗性問題。本研究發(fā)現(xiàn)，ACCase 基因Trp-1999-Ser 發(fā)生突變的千金子種群可對氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈產(chǎn)生交互抗性。Powles 等[27]報道，通常ACCase 基因1999、2027、2041 和2096 位點的氨基酸突變會導(dǎo)致雜草對一種或多種APPs 除草劑產(chǎn)生抗性。本研究結(jié)果與該報道一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，抗性千金子種群的ACCase 基因突變頻率與其對氰氟草酯、唑酰草胺和精唑禾草靈的抗性程度并不一致。Powles等[27]的研究還表明，雜草對ACCase 抑制劑類除草劑的交互抗性水平與靶標(biāo)酶基因突變方式、突變基因型以及ACCase 抑制劑類除草劑的種類相關(guān)。Deng 等[26]報道千金子具有兩個ACCase基因拷貝，存在基因稀釋效應(yīng)。Iwakami 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)酶基因的稀釋效應(yīng)也會影響抗性突變體對除草劑的抗性水平。

與靶標(biāo)抗性機(jī)制相比，由非靶標(biāo)抗性機(jī)制引起的雜草抗藥性更為復(fù)雜，更加難以預(yù)測[29]。非靶標(biāo)抗性機(jī)制包括雜草對除草劑吸收和轉(zhuǎn)運的減少，對除草劑的隔離屏蔽以及代謝解毒能力增強(qiáng)等[30]。本研究中有6 個抗性千金子種群未發(fā)現(xiàn)已報道的氨基酸突變方式，因此推斷這些抗性種群中由非靶標(biāo)抗性機(jī)制參與的可能性較高。Deng等[13]的研究表明，千金子對氰氟草酯代謝分解速率的快慢與其抗藥性水平密切相關(guān)。Chen 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450 單加氧酶 (P450s) 抑制劑馬拉硫磷 (malathion) 能顯著逆轉(zhuǎn)抗性千金子種群對氰氟草酯的抗藥性，表明其抗藥性的產(chǎn)生與P450s 活性增強(qiáng)有關(guān)。本研究僅從靶標(biāo)抗性方面鑒定了不同抗性種群靶標(biāo)酶基因的突變，而其抗性中是否存在非靶標(biāo)抗性則需要進(jìn)一步研究。

本研究中，上海市部分地區(qū)水稻田千金子對ACCase 抑制劑類除草劑的抗性已較為嚴(yán)重，且靶標(biāo)酶基因突變是導(dǎo)致不同千金子種群產(chǎn)生抗性的重要原因之一，而長期、頻繁地使用相同類型的除草劑防除同一種雜草，會加速雜草抗藥性的發(fā)生。因此，針對水稻田千金子發(fā)生區(qū)域，尤其是抗性千金子發(fā)生區(qū)域，不能再單一使用ACCase抑制劑類除草劑，應(yīng)提倡采用多元化的綜合治理措施，如多種作用機(jī)制的除草劑交替或混配使用，以及直播稻與移栽稻輪作等方法，從而盡量控制和延緩雜草抗藥性的發(fā)展。