基于轉錄組數(shù)據(jù)的毛蚶SSR分子標記開發(fā)與評價*

陳麗梅 李 莉 石栩蔚 秦藝銘 劉利華 郭永軍

基于轉錄組數(shù)據(jù)的毛蚶SSR分子標記開發(fā)與評價*

陳麗梅1李 莉2石栩蔚1秦藝銘1劉利華1郭永軍1①

(1. 天津農學院水產(chǎn)學院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室 天津 300384； 2. 山東省海洋生物研究院 山東 青島 266104)

本研究基于毛蚶()的轉錄組數(shù)據(jù)，利用MISA軟件對其中的微衛(wèi)星位點進行挖掘。從35 555條unigene中共獲得3987個SSR，SSR出現(xiàn)頻率達11.21%。SSR重復類型主要以二核苷酸重復為主(58.06%)，其次為三核苷酸重復(19.04%)。共有182種重復基元，不同類型SSR的重復基元分布特征不同，其中，二核苷酸重復基元中AC/GT類型比例最高，為45.70%。毛蚶轉錄組中SSR重復次數(shù)主要集中在5～7次，SSR長度主要集中在12～29 bp，多態(tài)性均在中等以上。利用篩選出的14對SSR引物在山東濰坊毛蚶野生群體中進行遺傳多樣性分析，結果顯示，平均有效等位基因數(shù)(a)、平均觀測雜合度(o)、平均期望雜合度(e)和多態(tài)性信息含量(PIC)分別為15.4、0.682、0.852和0.817，從PIC值來看，本研究開發(fā)的14個微衛(wèi)星標記均屬高多態(tài)性標記(PIC≥0.5)。此外，有7個位點顯著偏離哈迪–溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) (<0.05)。結果表明，基于毛蚶轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)微衛(wèi)星標記是切實可行的，研究結果豐富了毛蚶的分子標記數(shù)量，對毛蚶的種群遺傳學分析、遺傳圖譜構建及分子輔助育種等研究具有重要意義。

毛蚶；轉錄組；SSR；遺傳多樣性

毛蚶()俗稱毛蛤、麻蛤、麻蚶等(王如才等, 2008)，屬廣溫廣鹽性經(jīng)濟貝類。毛蚶廣泛分布于中國、日本、朝鮮沿岸，在中國以萊州灣、渤海灣、遼東灣、海州灣等淺海區(qū)資源尤為豐富(王慶志等, 2015)。對毛蚶的研究主要集中在形態(tài)學(陳蓉等, 2009; 宋菲菲等, 2012)、苗種繁育(翟林香等, 2010; 馬云聰?shù)? 2008)及養(yǎng)殖技術(王慶志等, 2015)等，關于群體遺傳學的研究較少(趙文等, 2011; 田吉騰等, 2016)。進入20世紀80年代，受生境破壞及過度捕撈等因素的影響，毛蚶自然資源逐年減少，產(chǎn)量大幅度下降，已遠遠不能滿足市場需求，毛蚶自然種群的遺傳評估和資源恢復工作也亟待進行。

微衛(wèi)星分子標記具有分布范圍廣、呈共顯性遺傳、多態(tài)性高和重復性好等特點，在群體遺傳多樣性分析、種質資源評價、遺傳圖譜構建等研究中有明顯優(yōu)勢(Nikolic, 2009; Bao, 2016; Kewwuwan, 2016)。微衛(wèi)星的開發(fā)方法主要有直接文庫篩選法(戰(zhàn)愛斌等, 2008)、磁珠富集法(宋丹丹等, 2019)、數(shù)據(jù)庫檢索法(魏大為等, 2015)、種間轉移擴增法(Liu, 2007)等。目前，毛蚶已開發(fā)出部分微衛(wèi)星標記，如Feng等(2009)利用磁珠富集法篩選了14對毛蚶微衛(wèi)星引物，陳辰(2015)利用同樣的方法獲得41對多態(tài)性較好的微衛(wèi)星引物。另外，Li等(2012)通過在魁蚶()中構建cDNA文庫，得到了25條在魁蚶和毛蚶中均通用的EST-SSR引物。Dong等(2012)利用泥蚶()的轉錄組數(shù)據(jù)，開發(fā)了62個EST-SSR引物，在毛蚶中的通用率為25.81%。但毛蚶微衛(wèi)星標記的數(shù)量還遠不能滿足其遺傳分析需求，需要開發(fā)更多可利用的微衛(wèi)星標記。近年來，利用轉錄組測序平臺開發(fā)SSR分子標記已經(jīng)得到越來越多的應用，其相比于傳統(tǒng)方法，具有通量大、周期短、成本低且直接與某些功能基因相關聯(lián)的優(yōu)點(于愛清等, 2019)。

本研究基于毛蚶鰓組織的轉錄組數(shù)據(jù)，對其中的SSR位點進行搜索，分析其分布特征及組成類型；并利用所篩選的引物在濰坊毛蚶野生群體中進行了遺傳多樣性分析，旨在為毛蚶微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)提供更為有效的方法，為毛蚶種群遺傳學分析、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及轉錄組測序

實驗所需毛蚶樣品于2017年10月采自天津濱海新區(qū)大神堂海域，殼長為(26.19±1.46) mm，活體重為(20.01±2.89) g。選取活力好的毛蚶3只，取其鰓組織，構建高通量轉錄組測序文庫，并利用Illumina HiSeq4000測序平臺(杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司)進行測序，共獲得93.57 Gb的數(shù)據(jù)量，原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)Trinity軟件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)組裝并去除冗余后，獲得了平均長度為621.23 bp的unigene 35 555條。

1.2 微衛(wèi)星標記篩選和引物設計

微衛(wèi)星序列的識別和定位使用MISA軟件進行，MISA搜索參數(shù)設置如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復次數(shù)分別為12、6、5、5、4和4，復合SSR兩個位點間最大間隔堿基數(shù)設置為100，結合Primer 3軟件批量設計引物。主要參數(shù)設置：引物長度為18～27 bp，PCR擴增產(chǎn)物在100～280 bp之間，57℃≤退火溫度(m)≤63℃，20%≤GC含量≤80%。同時，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Primer-BLAST對結果進行進一步驗證，主要參數(shù)設置：Self complementarity<6，Self′3 complementarity <3，且上下游引物m值差值不高于2℃。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 微衛(wèi)星多態(tài)性分析

使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進行毛蚶肌肉組織DNA的提取，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成熒光引物，對毛蚶濰坊群體的30個個體進行STR檢測(3730XL測序分析儀，美國ABI公司)，利用GeneMapper 3.2軟件對結果進行基因分型。

等位基因數(shù)(a)、期望雜合度(e)和觀測雜合度(o)用Microsatellite Analyser (MSA)軟件計算(Dieringer, 2003)。多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)用PIC-CALC 0.6軟件計算。利用Genepop 4.2軟件進行哈迪–溫伯格平衡(Hardy- Weinberg equilibrium, HWE)分析(http://genepop.curtin. edu.au/)，并對值進行Bonferroni校正。

2 結果與分析

2.1 毛蚶轉錄組中SSR的數(shù)量和分布特點

對毛蚶轉錄組中序列總長度22 087 807 bp的35 555條unigene序列進行SSR檢測，共得到3987個SSR (完美型SSR為3074個)，分布在3162條unigene序列當中。SSR發(fā)生頻率(含SSR的unigene數(shù)/unigene總數(shù))為8.89%，SSR出現(xiàn)頻率(檢出SSR位點數(shù)/unigene總數(shù))為11.21%，平均每5.54 kb含有1個SSR位點(總unigene長度/搜索到的SSR數(shù)量)。其中，612條unigene含有1個以上SSR位點，以復合微衛(wèi)星形式出現(xiàn)的SSR數(shù)目為913個。

2.2 毛蚶轉錄組中SSR的重復基元類型和頻率特征

從毛蚶轉錄組中篩查到的3987個SSR位點中，二核苷酸重復SSR出現(xiàn)頻率最高，為2315個，占總數(shù)的58.06%；其次是三核苷酸重復SSR (759個，19.04%)和單核苷酸重復SSR (696個，17.46%)；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復SSR所占比例最少，分別占總數(shù)的4.01%、1.15%和0.28%。

3987個SSR共有182種重復基元類型，根據(jù)堿基互補配對原則和閱讀起始堿基順序的差異(欒生等, 2007)，對每種長度類型的重復基元進行同類兼并后，單、二、三、四、五、六核苷酸重復基元類型分別為2、4、10、18、17和8種(表1)。單核苷酸重復中出現(xiàn)最多的基元類型是A/T，占單核苷酸重復的比例為是83.62%。二核苷酸重復中出現(xiàn)較多的是AC/GT和AG/CT類型，占二核苷酸重復的比例分別為45.70%和33.09%，AAT/ATT基元在三核苷酸重復中出現(xiàn)的頻率最高，占三核苷酸重復的34.78%。

表1 毛蚶轉錄組SSR主要重復基元類型及分布比例

Tab.1 The type and percentage of main repeat motif of SSR in transcriptome of S. kagoshimensis

2.3 毛蚶轉錄組中SSR長度及重復次數(shù)分布

本研究中，毛蚶轉錄組中SSR(完美型)長度在12～84 bp之間，其中，長度在12～19 bp之間的SSR占比最大，為SSR總數(shù)的61.06%。其次為長度20～ 29 bp的SSR，占總數(shù)的22.38%。長度≥50 bp的SSR僅占總數(shù)的2.64%。SSR的長度分布規(guī)律見圖1。

毛蚶轉錄組中不同類型SSR的重復次數(shù)分布見表2。由表2可知，SSR單核苷酸重復次數(shù)主要集中在12～14次，二核苷酸重復次數(shù)主要集中在6～8次，三核苷酸和四核苷酸重復次數(shù)主要集中在5～6次，五核苷酸和六核苷酸重復次數(shù)主要為4次?？偟膩砜矗貜?次的SSR占比最高，為778個(19.51%)，其次為重復5次和7次，分別為488個(12.24%)和423個(10.61%)。重復次數(shù)≥15次的SSR位點共有803個，占總SSR個數(shù)的20.14%。

圖1 毛蚶轉錄組中的SSR長度分布

2.4 毛蚶SSR引物設計及群體遺傳多樣性分析

除部分微衛(wèi)星序列側翼序列過短或者本身結構不適合設計引物以外，使用Primer 3軟件對其中含有SSR的3162條序列進行引物設計，最后從60對引物中篩選出擴增穩(wěn)定、多態(tài)性較高的14對引物(表3)。利用這14對引物對毛蚶濰坊野生群體的30個個體進行遺傳多樣性分析。等位基因數(shù)(a)、觀測雜合度(o)、期望雜合度(e)、多態(tài)信息含量(PIC)和哈迪–溫伯格平衡檢驗(HWE)等參數(shù)詳見表4。

表2 毛蚶轉錄組中不同類型SSR重復次數(shù)分布

Tab.2 Repeat number of SSR in transcriptome of S. kagoshimensis

表3 毛蚶14對SSR引物信息

Tab.3 Information of SSR primers in S. kagoshimensis

表4 基于14個SSR位點的濰坊毛蚶群體遺傳多樣性分析

Tab.4 Genetic diversity of Weifang population in S. kagoshimensis at 14 SSR loci

*表示Bonferroni校正后顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(<0.05)

* means significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium after Bonferroni correction (<0.05)

14個微衛(wèi)星位點總共檢測到216個等位基因，每個位點的等位基因個數(shù)從4個到26個不等，平均等位基因數(shù)為15.4個。o為0.379～0.967，平均值為0.682；e為0.623～0.962，平均值為0.852，PIC為0.817。經(jīng)Bonferroni校正后發(fā)現(xiàn)，14個位點中有7個偏離哈迪–溫伯格平衡。

3 討論

3.1 毛蚶轉錄組SSR類型和分布規(guī)律

近年來，越來越多的貝類中報道了利用轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)微衛(wèi)星的方法，在墨西哥灣扇貝()的轉錄組測序數(shù)據(jù)中，SSR的出現(xiàn)頻率為10%(譚杰等, 2018)，馬氏珠母貝()的SSR出現(xiàn)頻率為13.34% (王忠良等, 2015)，泥東風螺()的SSR出現(xiàn)頻率為13.62% (熊鋼等, 2020)。本研究中，毛蚶轉錄組中SSR的出現(xiàn)頻率為11.21%，和上述報道相似，但低于扁玉螺()的86.53% (盧瑋筱等, 2018)。在其他水生動物中，轉錄組中SSR出現(xiàn)頻率差異較大，如牙鲆()為43.24% (李超等, 2015)，大口黑鱸()為11.30% (黃勇等, 2019)，金烏賊()為90.66% (張金勇等, 2020)，曼氏針烏賊()為48.70%(管奧等, 2018)，凡納濱對蝦()為22.1% (楊銘等, 2017)。在SSR檢索標準一致的情況下，SSR出現(xiàn)頻率主要與物種差異、轉錄組結構及測序數(shù)據(jù)大小有關。

除單核苷酸重復外，大多數(shù)貝類如墨西哥灣扇貝、馬氏珠母貝、泥東風螺及菲律賓蛤仔()(譚杰等, 2018; 王忠良等, 2015; 熊鋼等, 2020; 閆路路, 2015)等轉錄組中SSR均以二核苷酸重復為主，本研究中毛蚶轉錄組中SSR也以二核苷酸重復為主，和上述研究結論一致。多數(shù)魚類，如牙鲆、刀鱭()、密斑刺鲀() (李超等, 2015; 于愛清等, 2019; 馬軍等, 2020)以及蝦類，如凡納濱對蝦、紅螯螯蝦() (楊銘等, 2017; 李喜蓮等, 2020)等，轉錄組中的SSR類型分布也符合這一規(guī)律。

3.2 毛蚶轉錄組SSR的長度和重復次數(shù)

SSR標記多態(tài)性的高低是判斷其物種可用性的重要依據(jù)。根據(jù)Temnykh等(2001)的研究，SSR的長度大小是影響其多態(tài)性高低的關鍵因素，當SSR長度≥20 bp時，呈高度多態(tài)性，12 bp≤長度≤20 bp時，呈中等多態(tài)性；前者更容易發(fā)生變異，原因是在較長的模板上滑動錯配發(fā)生的幾率更高(毛俐慧等, 2018)。本研究在設置篩選參數(shù)時，已剔除了長度在12 bp以下的SSR序列，12～19 bp和長度≥20 bp的序列分別占SSR總數(shù)量的66.23%和33.77%，在此基礎上設計引物，保證了引物具有較高的多態(tài)性。

本研究篩選出的14對多態(tài)性較好的SSR引物中，二核苷酸重復主要為6次，三核苷酸重復主要為7次，隨著重復次數(shù)的增加，各類型SSR的數(shù)量均逐漸降低。重復次數(shù)范圍和SSR數(shù)量變化規(guī)律和大多數(shù)同類研究一致。相比之下，陳辰(2015)和Feng等(2009)用磁珠富集方法開發(fā)的毛蚶SSR中，高重復序列所占比例較大，其二核苷酸重復次數(shù)一般集中在13～27次。造成這種差異的原因，一方面是由于轉錄組中開發(fā)的SSR重復次數(shù)往往要低于基因組中的SSR (Xia, 2018)，另一方面是磁珠富集的雜交洗脫等程序能夠將大部分低重復序列除去(孫效文等, 2005)。Schl?tterer等(2000)認為，重復次數(shù)與SSR位點突變率存在一定程度正相關。雖然本研究從轉錄組中開發(fā)的SSR重復次數(shù)相對較低，但從毛蚶群體遺傳學分析的結果來看，依然顯示了較高的多態(tài)性。

3.3 濰坊毛蚶群體遺傳多樣性分析

本研究對基于轉錄組數(shù)據(jù)得到的微衛(wèi)星引物進行篩選，并在濰坊毛蚶野生群體中進行了遺傳多樣性分析，其平均等位基因數(shù)(N)、觀測雜合度(H)和期望雜合度(H)分別為15.4、0.682和0.852，與陳辰(2015) (N：15.2；H：0.719；H：0.856)的研究結果類似，相比Feng等(2009)(N：21.64；H：0.798；H：0.931)多態(tài)性略低。14個微衛(wèi)星位點的PIC值范圍為0.549～0.943，平均值為0.817。根據(jù)Botstein等(1980)的標準，PIC≥0.5、0.25≤PIC<0.5和PIC<0.25分別代表高度多態(tài)性、中度多態(tài)性和低度多態(tài)性。從結果來看，本研究開發(fā)的14個微衛(wèi)星標記均屬高多態(tài)性，能夠提供豐富的遺傳信息，在毛蚶種群遺傳學研究、遺傳圖譜構建及家系分析鑒定中具有較高的實用性。另外，本研究采集的樣本為山東濰坊野生群體，也說明目前群體依然保持著較高的遺傳多樣性。

經(jīng)Bonferroni校正后發(fā)現(xiàn)，14個微衛(wèi)星位點中有7個顯著偏離哈迪–溫伯格平衡(＜0.05)，微衛(wèi)星位點偏離哈迪–溫伯格平衡的現(xiàn)象在相關報道中并不少見，如在菲律賓蛤仔(閆路路, 2015)、青蛤(方軍等, 2020)、里式擬石磺()(吳欣等, 2016)和熊本牡蠣()(黃飄逸等, 2020)的群體遺傳學研究中，微衛(wèi)星位點偏離哈迪–溫伯格的比例分別為75%、70.37%、35.71%和20%。一般來說，群體偏離平衡的原因主要是近交或存在無效等位基因而導致的純合子過?；蛉訕颖玖窟^小。其中，微衛(wèi)星標記中存在無效等位基因是一個較為普遍的現(xiàn)象，尤其是在海洋貝類中(Reece, 2004)。本研究采集的群體為野生群體，從平均等位基因數(shù)、雜合度等遺傳參數(shù)來看，均體現(xiàn)出較高的多態(tài)性，故推測微衛(wèi)星中無效等位基因的存在或樣本量較小是造成偏離哈迪–溫伯格平衡的主要原因。

本研究結果表明，利用高通量轉錄組測序篩選毛蚶微衛(wèi)星是一種高效可行的方法。研究結果增加了毛蚶的可用微衛(wèi)星標記，對毛蚶的種群遺傳學分析、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種都具有重要的意義。

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Development and Evaluation of SSR Markers Based on Transcriptome Sequencing in

CHEN Limei1, LI Li2, SHI Xuwei1, QIN Yiming1, LIU Lihua1, GUO Yongjun1①

(1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fishery Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao, Shandong 266104, China)

is a marine shellfish of great economic value. In recent decades, populations of.have declined due to environmental destruction and overfishing. To enhance our understanding of the genetic diversity and population-level genetic structure of., microsatellite loci were detected based on the transcriptome data of.using MISA software. A total of 3987 Single Sequence Repeats (SSRs) were identified from 35,555 unigenes and the frequency of their occurrence was 11.21%. The main types of repeats were dinucleotides and trinucleotides, which accounted for 58.06% and 19.04%, respectively. A total of 182 types of repeat motifs were classified in all SSRs, and AC/GT was the most abundant among dinucleotide repeats (45.70%). The repeat numbers of SSRs primarily ranged between five and seven, and the number of SSRs gradually decreased as repeat number increased．Motif length was predominantly between 12 and 29 bp, and the SSR polymorphism level was above moderate. Among the 60 designed primer pairs, 14 pairs proved to be polymorphic microsatellite markers and were amplified in 30 wild individuals sampled from Weifang in Shandong Province. The results showed that the average number of alleles (a), average observed heterozygosity (o), average expected heterozygosity (e), and polymorphism information content (PIC) were 15.4, 0.682, 0.852, and 0.817, respectively. All 14 loci were highly polymorphic (PIC≥0.5). After Bonferroni correction, seven of the 14 loci deviated significantly from theHardy-Weinberg equilibrium (<0.05). These results indicate that it is feasible to develop microsatellite markers based on the.transcriptome. The polymorphic microsatellite loci obtained in this study will facilitate further studies on population genetic management, genetic mapping, and molecular assisted breeding of.

; Transcriptome; SSR; Genetic diversity

S917

A

2095-9869(2022)03-0129-09

10.19663/j.issn2095-9869.20210206003

http://www.yykxjz.cn/

陳麗梅, 李莉, 石栩蔚, 秦藝銘, 劉利華, 郭永軍. 基于轉錄組數(shù)據(jù)的毛蚶SSR分子標記開發(fā)與評價. 漁業(yè)科學進展, 2022, 43(3): 129–137

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GUO Yongjun, E-mail: guoyongjun＠tjau.edu.cn

*財政部和農業(yè)農村部: 國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-48)、山東省現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助項目 (SDAIT-14-04)和天津市企業(yè)特派員項目(19JCTPJC60100)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-48), Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System in Shandong Province (SDAIT-14-04), and Tianjin Technical Expert Project (19JCTPJC60100)]. 陳麗梅, E-mail: chenlimeicc@163.com

郭永軍，研究員，E-mail: guoyongjun@tjau.edu.cn

2021-02-06,

2021-02-26

(編輯 馮小花)