基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)治療強(qiáng)直性脊柱炎的作用機(jī)制

賴楚兒，王義軍

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種炎癥性自身免疫性疾病，發(fā)病與遺傳和細(xì)菌感染等環(huán)境因素相關(guān)，以中軸關(guān)節(jié)、韌帶和肌腱受累產(chǎn)生非特異性炎癥、纖維化及骨化為主要表現(xiàn)。臨床癥狀典型為腰背疼痛和晨僵，后期隨著脊柱關(guān)節(jié)破壞、融合可出現(xiàn)脊柱僵直和畸形。西醫(yī)藥物治療主要是NSAIDs、DMARDs和bDMARDs（TNF 抑制劑）等[1-3]。在我國(guó)患病率約為0.3%[4]。中醫(yī)認(rèn)為AS 屬于痹病范疇，發(fā)病以正虛為本，腎虛及督脈空虛是根本病因，風(fēng)濕、瘀血、痰濁及濕熱等是阻滯經(jīng)脈，造成疼痛、僵硬，影響病情發(fā)展的重要原因，為標(biāo)。

青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)是胡蔭奇教授治療強(qiáng)直性脊柱炎的經(jīng)驗(yàn)用藥[5]，特別適用于寒濕痰瘀痹阻所致的腰背疼痛。青風(fēng)藤味苦、辛，性平，入肝、脾經(jīng)，主要功用是祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，此外還有通利小便的作用；穿山龍味甘、苦，性溫，歸肝、腎、肺經(jīng)，與青風(fēng)藤同有祛風(fēng)除濕、舒經(jīng)通絡(luò)之功效，兼可活血止痛[6]。兩藥相須為用，辛開苦泄，溫通肝腎之經(jīng)，加強(qiáng)祛風(fēng)通絡(luò)之功效。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)治療強(qiáng)直性脊柱炎的可能靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療強(qiáng)直性脊柱炎提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 青風(fēng)藤 穿山龍化學(xué)成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]，分別以中藥名搜索青風(fēng)藤和穿山龍，獲得中藥化學(xué)成分。根據(jù)ADEM篩選有效活性成分，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。另外根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充藥物有效成分。

1.2 化合物疾病靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 平臺(tái)下載中藥有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖，以.Mol 格式導(dǎo)入PharmMapper 服務(wù)器[8-10（]http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），據(jù)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，目標(biāo)集為“Human Protein Targets Only”，獲得的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，選擇Norm Fit＞0.5 的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，將其UniplotID 導(dǎo)入U(xiǎn)ntprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）[11]，獲得對(duì)應(yīng)的化合物疾病基因靶點(diǎn)。

1.3 強(qiáng)直性脊柱炎疾病靶點(diǎn)篩選

在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https://omim.org）、DrugBank 疾病靶點(diǎn)篩選數(shù)據(jù)庫(kù)[12]（https://www.drugbank.ca/）和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[13（]https://www.genecards.org/）輸入疾病名稱“ankylosing spondylitis”，獲得疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。疾病基因經(jīng)Unprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化處理，用疾病靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)繪制韋恩圖，獲得成分疾病交集基因。

1.4 藥物 成分 疾病 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)治療AS 的成分-疾病基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件[14]進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建出“藥物 成分 靶點(diǎn) 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（https://string-db.org/）導(dǎo)入成分 疾病交集基因，隱藏網(wǎng)絡(luò)無(wú)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，設(shè)定最低交互評(píng)分為0.4，構(gòu)建PPI（protein-protein interaction network）網(wǎng)絡(luò)。據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化分析，根據(jù)Degree值篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（Hub 基因），構(gòu)建關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體（Gene ontology，GO）富集分析

GO 富集分析包括包括生物過程（Biological process, BP）、細(xì)胞組分（Cellular component, CC）和分子功能（Molecular function,MF）3 方面。在Metascape[16]（https://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集基因，分別進(jìn)行GOBP、GOCC 和GOMF 分析，P ＜0.01。

1.7 京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路富集分析

KEGG Pathway 分析通過基因富集分析得出關(guān)鍵通路。將交集基因?qū)隡etascape，選擇P ＜0.01 進(jìn)行KEGG Pathway 分析，利用微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 富集柱狀圖及KEGG富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 青風(fēng)藤-穿山龍化學(xué)成分篩選

在TCMSP 平臺(tái)搜索獲得化學(xué)成分，青風(fēng)藤16個(gè)，穿山龍9 個(gè)，按OB≥30%，DL≥0.18 篩選后，共獲得有效成分9 個(gè)，查閱文獻(xiàn)[17]發(fā)現(xiàn)穿山龍中有效成分薯蕷皂苷元、纖細(xì)薯蕷皂苷已有與疾病相關(guān)研究，故補(bǔ)充這2 個(gè)成分，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得其成分結(jié)構(gòu)信息，見表1。

表1 青風(fēng)藤 穿山龍有效成分Table 1 The effective components of Caulis Sinomenii-Rhizoma Dioscoreae Nipponicae Herb Pairs

2.2 化合物疾病靶點(diǎn)篩選

在PharmMapper 服務(wù)器獲得有效成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)，獲得青風(fēng)藤成分的靶點(diǎn)基因573 個(gè)，穿山龍成分靶點(diǎn)基因954 個(gè)，去除重復(fù)基因，共獲得青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)有效成分靶點(diǎn)基因297 個(gè)。

2.3 強(qiáng)直性脊柱炎疾病靶點(diǎn)篩選

OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得AS靶點(diǎn)基因108 個(gè)；DrugBank疾病靶點(diǎn)篩選數(shù)據(jù)庫(kù)獲得AS疾病蛋白質(zhì)靶點(diǎn)348 個(gè)，經(jīng)Uniprot 轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)；在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索AS疾病相關(guān)基因共2123個(gè)，按Relevancescore ＞1.08篩選，獲得627個(gè)疾病靶點(diǎn)基因，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的疾病基因整合，去除重復(fù)項(xiàng)，得到816 個(gè)AS 靶點(diǎn)基因。通過Excel 函數(shù)獲得成分 疾病交集基因56 個(gè)，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)與強(qiáng)直性脊柱炎交集基因韋恩圖Fig.1 Intersection genes from the Venn diagram

2.4 藥物 成分 疾病 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將青風(fēng)藤 穿山龍治療AS 的成分 疾病基因?qū)隒ytoscape 3.7.2 軟件得到“藥物 成分 交集靶點(diǎn)疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖中正方形代表疾病，正六邊形代表藥物，圓形代表藥物有效成分，菱形代表青風(fēng)藤穿山龍藥對(duì)藥物成分對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)，三角形代表其與疾病交集基因，同時(shí)圖形面積代表連結(jié)節(jié)點(diǎn)數(shù)，面積越大代表連結(jié)節(jié)點(diǎn)越多。

圖2 藥物 成分 靶點(diǎn) 疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 TCM component target disease network

2.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺(tái)導(dǎo)入交集基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共有節(jié)點(diǎn)56 個(gè)，邊數(shù)186 條，平均節(jié)點(diǎn)度（average node degree）6.64。經(jīng)Cytoscape 可視化分析，隱去游離節(jié)點(diǎn)，見圖3。其中圓圈表示基因節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)面積與連接度（Degree值）的大小成正比，節(jié)點(diǎn)之間連線的粗細(xì)與Combine score 的大小成正比。在Cytoscape 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)Degree 值篩選關(guān)鍵基因（Hub 基因），選擇Degree值前10 的基因構(gòu)建關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。如圖4 關(guān)鍵基因依次是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2、F2、PPARG、IL2、CYP19A1 和NR3C1。

圖3 交集基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of intersecting genes

圖4 關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of hub genes

2.6 GO功能富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果得到GOBP 739 條，GOCC 19 條，GOMF 79 條。按p-value 值從小到大篩選GOBP前20 條，GOCC 和GOMF 各前10 條，繪制富集柱狀圖，主要富集分析結(jié)果如圖5。

圖5 GO 功能富集圖Fig.5 Histogram of GO functional enrichment analysis

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果

在Metascape 對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共得到74 條通路，按P-value 值從小到大排列，去除癌癥相關(guān)通路，取前25 條通路制作富集氣泡圖，見圖6。結(jié)果顯示，交集基因KEGG 通路主要富集如下：Steroid hormone biosynthesis（類固醇激素生物合成）、Ovarian steroidogenesis（卵巢類固醇生成）、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（細(xì)胞色素P450 對(duì)異種生物的代謝）、PPAR signaling pathway（PPAR 信號(hào)通路）、Complement and coagulation cascades（補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)）、foxo signaling pathway（foxo信號(hào)通路）、Endocrine resistance（內(nèi)分泌抵抗）、Longevity regulating pathway（長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路）、HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信號(hào)通路）、AMPK signaling pathway（AMPK信號(hào)通路）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號(hào)通路）、Axon guidance（軸突導(dǎo)向）、T cell receptor signaling pathway（T 細(xì)胞受體信號(hào)通路）和insulin resistance（胰島素抵抗）。

圖6 KEGG 通路富集圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis

3 討論

3.1 中藥與化學(xué)成分

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和降血壓作用[18]。穿山龍具有明顯的抗炎作用，此外還有鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗氧化、降尿酸及耐缺氧作用[19]。青風(fēng)藤和穿山龍兩藥配伍使用是胡蔭奇教授治療強(qiáng)直性脊柱炎的特色經(jīng)驗(yàn)用藥，用于治療寒濕痰瘀痹阻型大僂。除此之外，王慶國(guó)[21]治療強(qiáng)直性脊柱炎的經(jīng)驗(yàn)方穿藤通痹湯中也有這兩藥相須為用，以藤類之屬，可通經(jīng)入絡(luò)，通利祛邪[20]。溫啟宗認(rèn)為青風(fēng)藤與穿山龍配伍治療大僂及其他痹癥，可散風(fēng)寒濕痹，活絡(luò)止痛，善治腰背疼痛[21]。

薯蕷皂苷元（Dgn）的抗炎作用通過減弱多種酶活性和減少IL-1 誘導(dǎo)的炎性因子分泌抑制中性粒細(xì)胞活化及超氧化物形成[22]。調(diào)節(jié)免疫方面Dgn 促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌，刺激M2 細(xì)胞分化和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高免疫調(diào)節(jié)活性[23]。此外Dgn 有保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，可能通過減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)[24]。纖細(xì)薯蕷皂苷也與保護(hù)骨細(xì)胞相關(guān)，通過下調(diào)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因抑制破骨細(xì)胞形成和吸收[25]。

青藤堿（SIN）的抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用主要是降低炎性因子水平和抑制巨噬細(xì)胞活化遷移過程。SIN 可以下調(diào)多種炎性因子水平，通過阻斷活化的TLR4/MyD88/NF- B 信號(hào)通路，SIN抑制巨噬細(xì)胞遷移及免疫應(yīng)答，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬[26,27]。SIN 抑制TNF-誘導(dǎo)分泌，調(diào)節(jié)體內(nèi)TH17/Treg 的失衡，抑制成骨分化從而減輕關(guān)節(jié)炎、減少骨侵蝕[28]。在鎮(zhèn)痛方面，SIN可以改善神經(jīng) 免疫失衡，抑制氧化應(yīng)激和慢性疼痛狀態(tài)的中樞致敏[29]。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因有ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2。血清白蛋白（ALB）有良好的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)能力，是維持血漿膠體滲透壓的重要成分。ALB在AS患者中是一個(gè)有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，缺血修飾白蛋白（IMA）、纖維蛋白原與白蛋白比值在AS 患者中明顯升高，均與疾病活動(dòng)相關(guān)[30,31]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）具有高效的促生長(zhǎng)活性，在間充質(zhì)干細(xì)胞中起到促進(jìn)增殖和成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成的作用[32]。此外IGF-I通過阻斷PI3K/AKT/TLR4 通路減弱IL-6 和TNF- 分泌，起到抗炎效果[33]。雌激素受體（ESR1）和雄激素受體（AR）等類固醇激素及其受體參與調(diào)節(jié)靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。雌二醇可減少破骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，起到保骨作用[34]。AR 能夠促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞分化及自噬，從而減輕炎癥反應(yīng)和組織凋亡，促進(jìn)組織的修復(fù)[35]。MMP2 是一種廣泛存在的金屬蛋白酶，中國(guó)人群中MMP-2 rs243865 C/T 基因的多態(tài)性可能與AS風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[36]。AS 患者中下調(diào)MMP-2 表達(dá)可使成骨細(xì)胞分化和骨形成中的轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)，防止異位骨化中的成骨細(xì)胞分化[37]。白細(xì)胞介素-2（IL2）是T 細(xì)胞增殖的必要生長(zhǎng)因子，是人體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的核心物質(zhì)。AS 患者血清中IL-2 水平顯著升高，且與炎癥反應(yīng)標(biāo)志物、疾病活動(dòng)指數(shù)等指標(biāo)呈正相關(guān)，經(jīng)治療后可降低[38]。AS 患者外周血中CD4+Treg 和CD8+Treg 細(xì)胞減少，IL-2 處理可糾正Treg/Th17 細(xì)胞失衡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[39]。

3.3 KEGG通路

KEGG 通路富集分析顯示，青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)治療AS 的交集基因靶點(diǎn)富集在類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、foxo信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路。

類固醇激素包括性激素和皮質(zhì)激素。在治療AS中，局部注射糖皮質(zhì)激素有利于改善關(guān)節(jié)炎和附著點(diǎn)炎，這得益于其抗炎、抑制免疫功能，但不建議全身糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用。雌激素E2 缺乏可使Th17 細(xì)胞分化增加，E2 可抑制IL-17 介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，減少骨質(zhì)流失[40]。E2 還可以降低小鼠中TNF、干擾素-和IL-17A 的表達(dá)起到抗炎作用[41]。另一種類固醇激素維生素D，一方面可調(diào)節(jié)骨組織鈣磷吸收，另一方面可參與調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)，維生素D 在固有免疫早期可增強(qiáng)細(xì)胞募集和細(xì)胞因子分泌，并通過負(fù)反饋機(jī)制防止廣泛的炎癥和組織破壞；在適應(yīng)性免疫中促進(jìn)初始T細(xì)胞活化，增強(qiáng)抗原呈遞，間接調(diào)節(jié)DC 功能[42]。較高的血清維生素D 水平是AS 的保護(hù)因素，維生素D活化產(chǎn)物25OHD水平與AS患病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[43,44]。

補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路中，補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫中的重要介質(zhì)，補(bǔ)體系統(tǒng)異常則會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷，減少補(bǔ)體激活可以降低AS 中心血管疾病發(fā)病率[45]。在AS 中可見補(bǔ)體激活產(chǎn)物沉積，攻擊成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，使用補(bǔ)體抑制劑能有效阻止免疫細(xì)胞的增殖和分化[46]。凝血系統(tǒng)的激活與炎癥性疾病的疾病活動(dòng)有關(guān)，axSpA 患者體內(nèi)纖維蛋白原和D-二聚體升高，且與炎癥及疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)[47]。

foxo 信號(hào)通路中FoxO 轉(zhuǎn)錄因子通過控制T、B淋巴細(xì)胞的功能和發(fā)育，調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受，在FoxO活性失調(diào)時(shí)導(dǎo)致慢性炎癥和自身免疫[48]。Foxo1失活會(huì)抑制CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)中的aTreg 細(xì)胞遷移，過度激活則會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞依賴性的炎癥疾病[49]。

AMPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路與骨形成和代謝相關(guān)。AMPK 是一種蛋白激酶，在AS 中，它可以激活自噬刺激成骨細(xì)胞的分化和礦化及負(fù)向調(diào)節(jié)抑制破骨細(xì)胞的分化和功能[50]。PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)骨髓中的細(xì)胞增殖遷移和成骨分化[51]。PI3K-Akt通路被抑制后，影響成骨細(xì)胞的早期分化和晚期鈣化，破骨細(xì)胞形成受抑制[52]。兩個(gè)通路共同起到促進(jìn)成骨細(xì)胞存活、抑制破骨細(xì)胞形成和抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨的作用。

T 細(xì)胞受體信號(hào)通路是T 淋巴細(xì)胞增殖、分化，激活免疫效應(yīng)的重要組成，在HLA-B27 陽(yáng)性的AS患者中具有高度同源性TCR 的T 細(xì)胞克隆，表明AS相關(guān)的T 細(xì)胞克隆型的存在和富集參與了發(fā)病[53]，當(dāng)AS 處于高活動(dòng)度時(shí)，病理性CD4+T 細(xì)胞可能因?yàn)榕cCD8+共享TCR 而識(shí)別HLA-B27 呈遞的自身抗原，激活T 細(xì)胞不均衡擴(kuò)增[54]。

4 小結(jié)

綜上所述，青風(fēng)藤 穿山龍藥對(duì)治療強(qiáng)直性脊柱炎，主要通過化學(xué)成分薯蕷皂苷元、纖細(xì)薯蕷皂苷與青藤堿，關(guān)鍵靶點(diǎn)基因可能是ALB、IGF1、ESR1、AR、MMP2 和IL2，主要信號(hào)通路為類固醇激素生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、AMPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、foxo 信號(hào)通路和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路，多靶點(diǎn)、多通路共同起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制炎癥過程和調(diào)控骨細(xì)胞活性等作用。但由于個(gè)別藥物化學(xué)成分靶點(diǎn)信息較少，各數(shù)據(jù)庫(kù)收錄、匹配靶點(diǎn)算法不同，藥物成分、靶點(diǎn)基因與疾病之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。