鄔晶晶，宋陸陽，朱良琪

(中國城市規(guī)劃設(shè)計研究院，北京 100037)

檢出限(detection limit，DL)和測定下限(mini-mum quantitation limit，MQL)是水質(zhì)檢測方法中重要的特性指標(biāo)，其對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性有直接影響，進(jìn)而與環(huán)境保護(hù)、污染治理、供水安全等依靠水質(zhì)檢測結(jié)果判斷任務(wù)落實質(zhì)量的工作密切相關(guān)。在飲用水檢測中，樣品中目標(biāo)物的含量通常較低，檢測結(jié)果經(jīng)常處于檢出限或測定下限附近，因此，在使用檢測方法前，獲取適用且合理的檢出限和測定下限尤為重要。近年來，諸多研究人員對檢出限和測定下限的概念以及評價方法進(jìn)行了大量的探討[1-6]，但在評價方法的選擇上仍存在一定爭議。很多檢測人員在方法建立或確認(rèn)時對計算得到的檢出限和測定下限通常直接使用，沒有進(jìn)行合理性判定，甚至直接采用標(biāo)準(zhǔn)中給出的檢出限和測定下限，容易導(dǎo)致檢出限和測定下限與檢測工作不適用、不匹配，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性存在風(fēng)險。

飲用水檢測對檢測人員和檢測方法的要求較高。為降低檢測風(fēng)險，科學(xué)檢測水質(zhì)，保障供水安全，要求檢測人員對檢測方法的檢出限、測定下限等方法特性指標(biāo)的概念、評價方法及合理性判定有全面清晰的了解。本文將探討各種檢出限評價方法的適用性，提出在飲用水檢測方法建立或確認(rèn)過程中便于確定方法檢出限和測定下限的評價方法，并對已獲取的方法檢出限和測定下限的合理性判定進(jìn)行詳盡的探討。

1 檢出限與測定下限的定義

1.1 檢出限

1947年，德國學(xué)者Kaiser提出“檢出限”這一概念，其強(qiáng)調(diào)應(yīng)將檢出限視為分析化學(xué)中的一項重要指標(biāo)，是一種定性概念?！渡铒嬘盟畼?biāo)準(zhǔn)檢驗方法 水質(zhì)分析質(zhì)量控制》(GB/T 5750.3—2006)[7]、《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2020)[8]、《環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測質(zhì)量保證手冊》[9]、美國環(huán)保局(USEPA)[10]等均對檢出限具有類似的描述，即在一定置信水平下可從樣品中檢出待測物質(zhì)的最小濃度。

檢出限還可分為儀器檢出限、方法檢出限2種類型。其中，儀器檢出限即分析化學(xué)中儀器設(shè)備檢測某一待測物濃度的最低限值，方法檢出限則是在具體分析方法下目標(biāo)物以指定置信水平可被測定出的濃度的最低限值。方法檢出限的值不是一成不變的，會隨著試驗環(huán)境條件、儀器設(shè)備狀態(tài)、樣品處理技術(shù)、分析人員操作水平的變化而變化。所以，方法檢出限具備可變性特點(diǎn)，需要根據(jù)分析化學(xué)的試驗條件進(jìn)行適應(yīng)性確定，在飲用水檢測領(lǐng)域一般會使用方法檢出限。

1.2 測定下限

測定下限也稱為定量限或最低檢測質(zhì)量濃度，是指被測組分的濃度能產(chǎn)生比空白足夠大的信號[通常為信噪比(S/N)≥10]，這個信號能夠被實驗室以指定的置信水平在常規(guī)操作下定量檢出，強(qiáng)調(diào)了定量的概念。我國《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2020)和USEPA規(guī)定，測定下限為方法檢出限的4倍。飲用水檢測一般使用測定下限(定量限)作為判定標(biāo)準(zhǔn)來出具報告。

2 檢出限的評價方法及適用性

2.1 全程序空白標(biāo)準(zhǔn)差法

該方法僅用空白測定結(jié)果評估計算檢出限，與檢測方法中的目標(biāo)物無關(guān)，且只能計算出一個檢出限。因此，該方法僅適用于單指標(biāo)檢測方法，對于多指標(biāo)檢測方法并不適用。且在飲用水檢測過程中，空白樣品中很多情況下都不含有目標(biāo)物或其濃度極低，多次測定空白時無法計算標(biāo)準(zhǔn)差或只能得到極小的標(biāo)準(zhǔn)差，很難確定合適的檢出限。

2.2 凈吸光度法

當(dāng)沒有前處理時，分光光度法可以用吸光度(扣除空白)為0.01相對應(yīng)的濃度為檢出限。

2.3 S/N法

S/N為3時對應(yīng)的濃度為檢出限，S/N為10時對應(yīng)的濃度為測定下限[11-12]。

實際工作中，某些方法如質(zhì)譜法在檢測低濃度樣品時，平行測定多次的S/N差別非常大，要獲得S/N為3和S/N為10左右的濃度作為檢出限和測定下限較為困難，需要進(jìn)行多次平行測定并結(jié)合實際情況綜合考慮，以確定適用于檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)限值的檢出限和測定下限。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)方法是基于t分布獲得方法檢出限的評價方法，是目前飲用水檢測領(lǐng)域中一種較為通用的獲取方法檢出限的評價方法，參照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2020)[8]一般分為空白樣品中檢出和未檢出目標(biāo)物兩種情況。

2.4.1 空白樣品中檢出目標(biāo)物

當(dāng)空白樣品中檢出目標(biāo)物時，方法檢出限按式(1)計算。

MDL=t(n-1,0.99)×S

(1)

其中：MDL——方法檢出限；

n——樣品的平行測定次數(shù)；

t(n-1,0.99)——自由度為n-1，置信度為99%時的t分布值(單側(cè))；

S——n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

本方法計算檢出限的前提條件是：測定值之間可允許的差異范圍為“空白試驗測定值的均值±估計方法檢出限的1/2”。

空白試樣中檢出目標(biāo)物質(zhì)時，檢出濃度通常不是合適的濃度，使用該方法計算檢出限的前提條件大多數(shù)情況下都不滿足，且在飲用水檢測方法建立過程中，空白試驗中檢出目標(biāo)物的概率極低，該計算檢出限的方法不適用。

2.4.2 空白樣品中未檢出目標(biāo)物

對配制濃度為估計方法檢出限3～5倍的樣品進(jìn)行n(n≥7)次平行測定，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，按式(1)計算方法檢出限。

(2)

MDL=t(vA+vB,0.99)×Sp

(3)

其中：vA——方差較大批次的自由度，nA-1；

vB——方差較小批次的自由度，nB-1；

Sp——綜合標(biāo)準(zhǔn)偏差；

t(vA+vB,0.99)——自由度為vA+vB，置信度為99%時的t分布值(單側(cè))。

在飲用水檢測方法建立或方法確認(rèn)過程中，通常使用空白加標(biāo)的多次平行測定來確定方法檢出限，該評價方法的關(guān)鍵在于通過加標(biāo)獲得濃度為估計方法檢出限值3～5倍的樣品。估計的方法檢出限首先通過S/N=3左右來確定，但實際檢測過程中低濃度時的S/N存在較大的波動，可能導(dǎo)致加標(biāo)樣品的濃度不是計算出的檢出限的3～5倍，需要調(diào)整加標(biāo)濃度重新計算，直到獲得正確的檢出限。

目標(biāo)物為多組分的分析方法可以認(rèn)為是多個單一組分分析方法的組合，需要獲得每個單獨(dú)組分的檢出限。與單一組分分析方法的檢出限評價方法相同，需要對各個組分進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)試驗、計算、判定等一系列過程，最終確定分析方法中所有組分的檢出限，過程極為繁瑣。

3 便于確定方法檢出限的評價方法

在飲用水檢測領(lǐng)域，除比色法、滴定法、稱重法、微生物檢測等方法以外，絕大部分檢測方法都是通過建立各已知濃度與儀器響應(yīng)值之間的線性關(guān)系方程，再代入未知樣品的儀器響應(yīng)值來計算其濃度。常用檢出限的評價方法需要通過多次測定其估計值3～5倍濃度的樣品，再通過計算獲得，即先行估計測定下限附近濃度，但在檢測如此低濃度時，儀器響應(yīng)值的信號波動較大，測定同一濃度的S/N波動也較大。如圖1和表1所示，質(zhì)量濃度均為0.5 μg/L的久效磷測定8次，響應(yīng)值差別不大，但其S/N波動很大，為12.098～214.251，很難通過S/N=3的方法估計目標(biāo)物的方法檢出限，從而也很難獲得所需的加標(biāo)濃度計算得到目標(biāo)物的真實方法檢出限。隨著質(zhì)譜的普及，高通量的檢測方法在飲用水檢測領(lǐng)域中也越來越普遍，采用2.4.2小節(jié)中的方式評價檢出限也將會越來越復(fù)雜。

表1 質(zhì)量濃度為0.5 μg/L的久效磷測定8次的S/N情況

注：223.80>127.00表示定量離子對

統(tǒng)計學(xué)方法評價方法檢出限的關(guān)鍵在于獲得濃度為估計檢出限3～5倍的樣品，該樣品經(jīng)n次(n≥7)平行測定后通過式(1)計算方法檢出限。一般取測定下限為4倍方法檢出限，因此，需要的3～5倍檢出限濃度即為測定下限附近濃度。理論上校準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)濃度應(yīng)為測定下限濃度，這是檢測方法所能準(zhǔn)確測定的最小濃度，但測定下限通常不是整數(shù)，為了工作方便，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，最低點(diǎn)通常為略大于測定下限的整數(shù)濃度點(diǎn)。因為只有在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的檢測結(jié)果才能被認(rèn)為是準(zhǔn)確定量，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的濃度不能超過測定下限太多，否則很容易出現(xiàn)某一目標(biāo)物濃度大于測定下限，但又在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，造成有檢出但不能準(zhǔn)確定量的尷尬局面。如某一目標(biāo)物的測定下限為0.97 μg/L，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)一般選為1.00 μg/L。因此，方法檢出限和測定下限的確定與標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的確定密不可分，在建立飲用水檢測方法時，可將這三者結(jié)合考慮。

以《城鎮(zhèn)供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》(CJ/T 141—2018)[13]中的7.1節(jié)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測12種農(nóng)藥為例，便于確定方法檢出限、測定下限和標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的操作步驟如下。

①配制相同濃度的12種農(nóng)藥混標(biāo)，進(jìn)樣優(yōu)化儀器參數(shù)，優(yōu)化完成后可大致確定各農(nóng)藥的響應(yīng)情況，可配制一個較低濃度進(jìn)樣觀察色譜峰形和響應(yīng)情況。若混標(biāo)中各農(nóng)藥響應(yīng)差別不大，可按照相同濃度配制，若發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯等農(nóng)藥的響應(yīng)與其他農(nóng)藥差別很大，可以在配制混合標(biāo)準(zhǔn)樣品時適當(dāng)加大濃度。

②使用步驟①確定后的混標(biāo)配制多個低質(zhì)量濃度的樣品(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/L)，可根據(jù)自身儀器靈敏度進(jìn)行濃度調(diào)整。以農(nóng)藥樂果為例，如圖2所示，當(dāng)配制質(zhì)量濃度為2.00 μg/L時，其定量離子對的色譜峰形較好，響應(yīng)較強(qiáng)，進(jìn)一步配制更低質(zhì)量濃度，如1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 μg/L，可發(fā)現(xiàn)濃度越低，響應(yīng)越低，同時峰形越差。當(dāng)配制質(zhì)量濃度為0.05 μg/L時，色譜峰形難以維持，可停止降低濃度。

注：230.10>199.04表示定量離子對

③以步驟②中的低濃度點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的低濃度點(diǎn)，同時配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中高質(zhì)量濃度點(diǎn)(5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/L)進(jìn)樣測定，對每種農(nóng)藥進(jìn)行線性擬合，按照響應(yīng)情況初步確定各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)和最高點(diǎn)。最低點(diǎn)和最高點(diǎn)由數(shù)據(jù)處理時的線性擬合情況確定，將無響應(yīng)信號、S/N低的低濃度點(diǎn)和偏差太大導(dǎo)致線性不良的高濃度點(diǎn)刪去，保留中段作為初定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

④對配制的所有低濃度點(diǎn)進(jìn)行7次平行測定，按照濃度從低到高的順序依次進(jìn)樣，不同濃度之間插入空白，避免干擾。

⑤以步驟③中初步確定的各農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)，對步驟④中各農(nóng)藥的低濃度點(diǎn)進(jìn)行定量，同時觀察色譜圖，S/N太低時舍棄該濃度點(diǎn)。

⑥對定量后的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算各農(nóng)藥不同濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)偏差S，方法檢出限按式(1)計算。方法檢出限=3.14×S(置信度為99%時，測定7次的單側(cè)t分布值為3.14)，測定下限為4倍方法檢出限。此時各農(nóng)藥有響應(yīng)值的每個濃度點(diǎn)均能計算出對應(yīng)的方法檢出限和測定下限。

⑦對計算出的方法檢出限和測定下限進(jìn)行判定，確定合理的方法檢出限和測定下限，判定依據(jù)見第4章節(jié)。根據(jù)確定后的測定下限來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)和線性范圍。

本方法以直接進(jìn)樣的高通量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為實際案例展開研究，多個不同低濃度點(diǎn)的樣品可直接通過空白基質(zhì)配制獲得。當(dāng)檢測方法存在液液萃取、固相萃取等前處理過程時，若前處理過程影響不大(回收率穩(wěn)定在80%～120%)，可利用空白基質(zhì)配制多個不同低濃度的平行樣，按照本方法確定檢出限，再除以濃縮倍數(shù)得到最終的方法檢出限。若影響較大，應(yīng)按照樣品全程序獲得多個不同低濃度的平行樣上機(jī)測定，再按照本方法確定檢出限。

4 方法檢出限和測定下限的合理性判定依據(jù)

方法檢出限和測定下限不是獨(dú)立的方法特性指標(biāo)，它們與分析方法的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制緊密相關(guān)。如圖3所示，理論上分析方法的線性范圍應(yīng)為測定下限到濃度b，為了工作方便，通常取略大于測定下限的濃度a作為線性范圍的起點(diǎn)，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)。計算得出方法檢出限和測定下限必須經(jīng)過判定，合理的方法檢出限和測定下限才能作為方法特性指標(biāo)使用，否則將大大提高檢測風(fēng)險。

圖3 方法檢出限、測定下限與線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系

4.1 依據(jù)1：測定下限≤濃度a且盡量接近

濃度a為用于計算方法檢出限和測定下限的配制濃度，也是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，當(dāng)測定下限略小于濃度a時，說明濃度a為方法檢出限的4倍左右，符合t分布的基本條件。當(dāng)多次平行測定濃度a后，用式(1)計算出的測定下限>a時，表明濃度a在線性范圍之外，即濃度a是不能準(zhǔn)確定量的濃度，此時存在一個矛盾，即利用不能準(zhǔn)確定量的濃度a，估算出能準(zhǔn)確定量的測定下限；當(dāng)多次平行測定濃度a后，用式(1)計算出的測定下限遠(yuǎn)小于a時，此時得到的測定下限也不合理，一個原因是此時很容易造成某一濃度大于測定下限有檢出，但它在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外而不能準(zhǔn)確定量的情況，顯示數(shù)據(jù)存在風(fēng)險，另一個原因是不能保證此時計算出的測定下限具有可準(zhǔn)確定量的響應(yīng)信號(S/N≥10)，也不能保證計算出的方法檢出限具有穩(wěn)定可識別信號(S/N≥3)。

例如配制1.00 μg/L的某目標(biāo)物平行測定7次，計算得到的方法檢出限為0.08 μg/L，測定下限為0.32 μg/L，此時測定下限比濃度a小很多，說明平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，響應(yīng)穩(wěn)定，可選擇其他濃度點(diǎn)的數(shù)據(jù)結(jié)果。如質(zhì)量濃度為0.80 μg/L的樣品計算得到的方法檢出限為0.19 μg/L，測定下限為0.76 μg/L，此時MQL略小于濃度a，觀察色譜圖，若方法檢出限附近濃度具有穩(wěn)定可識別信號，那么此時的方法檢出限和測定下限較為合理。

4.2 依據(jù)2：方法檢出限附近濃度具有穩(wěn)定可識別信號

“檢出”是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高于空白的待測物質(zhì)。因此，方法檢出限附近濃度應(yīng)具有穩(wěn)定可識別的信號(S/N≥3)，若某一濃度條件下計算得到的測定下限滿足4.1小節(jié)中的判定依據(jù)，但其方法檢出限附近無穩(wěn)定可識別信號，那么此時獲得的測定下限依然不合理。例如配制0.40 μg/L的某目標(biāo)物平行測定7次，計算得到的方法檢出限為0.09 μg/L，測定下限為0.36 μg/L，測定下限略小于濃度a，但觀察色譜圖發(fā)現(xiàn)方法檢出限附近濃度無任何響應(yīng)，說明計算得到的方法檢出限和測定下限不合理，檢測時存在假陽性風(fēng)險。此時需選擇更高的濃度點(diǎn)計算后重新判定，直到找到合理的方法檢出限和測定下限，進(jìn)而確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)。

若多個濃度點(diǎn)計算出的方法檢出限和測定下限均符合4.1、4.2小節(jié)中的判定依據(jù)，考慮到不確定度的原因，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)限值要求情況，選擇稍大的方法檢出限和測定下限作為最終的方法特性指標(biāo)。

5 結(jié)論

(1)本文在研究各種檢出限和測定下限評價方法適用性的基礎(chǔ)上，提出了適用于飲用水檢測領(lǐng)域的方法檢出限和測定下限的評價方法，該評價方法以實際檢測方法的測定范圍為導(dǎo)向，將標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)與方法的檢出限和測定下限相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而得出適用于飲用水檢測領(lǐng)域中基于最小二乘法擬合曲線進(jìn)行目標(biāo)物分析時合理的檢出限和測定下限。同時，本文還提出了判定方法檢出限和測定下限合理性的兩條依據(jù)，即通過測定下限與標(biāo)準(zhǔn)曲線最低質(zhì)量濃度的關(guān)系判定測定下限是否合理，通過檢出限附近濃度的響應(yīng)信號判定檢出限是否合理。

(2)對于飲用水中待測物的含量通常較低,特別是有機(jī)物項目通常處于痕量分析范圍的工況，使用本文提出的檢出限和測定下限評價方法，并對其結(jié)果進(jìn)行合理性判定，能夠有效降低飲用水檢測中有機(jī)物項目等痕量分析檢測結(jié)果的風(fēng)險，從而達(dá)到降低檢測風(fēng)險、科學(xué)檢測水質(zhì)、保障飲用水安全的目標(biāo)。

(3)該評價方法的應(yīng)用符合我國飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)的檢測技術(shù)不斷更新、未來持續(xù)更新的新興污染物的痕量檢測要求更高的行業(yè)發(fā)展趨勢，同時隨著質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用普及，該評價方法也符合高通量檢測方法成為主流的檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢，具有廣泛的應(yīng)用前景。