心肌梗死患者微小RNA表達(dá)及其與肌鈣蛋白T相關(guān)性研究

劉 濤，趙 洋，周恩濤，楊忠路，賀元辰，劉方緒，卜 澤

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

心肌梗死發(fā)生時，心肌細(xì)胞的凋亡或壞死會發(fā)展為心肌細(xì)胞的消失，從而減少心臟泵血，進(jìn)一步導(dǎo)致充血性心力衰竭[1-2]。心肌梗死后，在梗死心肌和非梗死心肌中可觀察到心肌纖維化，過度的心肌纖維化會損害心功能，這將導(dǎo)致心力衰竭相關(guān)的住院率和病死率升高[3-4]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一種小的非編碼RNA，能夠通過破壞靶基因穩(wěn)定或抑制其翻譯而成為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子,在心肌梗死中發(fā)揮重要作用[5-7]。本研究旨在探討miRNA在心肌梗死中可能發(fā)揮的作用機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年6月至2019年6月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的30例心肌梗死患者納入心肌梗死組，另將同期的30例健康體檢者納入健康組。健康組中，男性20例，女性10例；年齡范圍44～69歲；總膽固醇(4.30±0.53)mmol/L；甘油三酯(1.46±0.84)mmol/L；高密度脂蛋白(1.14±0.22)mmol/L；低密度脂蛋白(2.47±0.39)mmol/L；合并糖尿病6例；吸煙18例。心肌梗死組中，男性21例，女性9例；年齡范圍42～71歲；總膽固醇(4.32±0.67)mmol/L；甘油三酯(1.43±0.92)mmol/L；高密度脂蛋白(1.21±0.34)mmol/L；低密度脂蛋白(2.54±0.53)mmol/L；合并糖尿病7例；吸煙21例。兩組受試者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

TRIzol溶液、三氯甲烷、異丙醇、乙醇、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水購自國藥集團(tuán)，Takara試劑盒、SYBR試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司。采集健康組受試者靜脈血5 ml，保存在-80℃冰箱中；心肌梗死組患者在發(fā)病后4、8、12、24、48 h采集5 ml靜脈血，保存在-80℃冰箱中。

1.2.1 RNA提取 在血漿中加入3倍體積的TRIzol溶液，混勻，加入三氯甲烷，劇烈震蕩30 s，靜置15 min，12 000 r/min離心15 min，上清加入0.5 ml異丙醇，劇烈震蕩后靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1.0 ml乙醇，7 500 r/min離心5 min，棄上清，DEPC水60℃水浴狀態(tài)溶解沉淀。

1.2.2 芯片分析 隨機(jī)選取3例心肌梗死患者，發(fā)病后8 h，將其血漿中提取的RNA和3例健康體檢者的總RNA送至武漢博士德生物有限公司進(jìn)行芯片分析，微陣列數(shù)據(jù)分析采用genespring軟件(agilent技術(shù))。

1.2.3 實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Takara試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，SYBR試劑盒進(jìn)行實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，共40個循環(huán)。引物見表1。

表1 引物列表

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA表達(dá)比較 與健康組比較，心肌梗死組let-7f、miR-21、miR-29b、miR-223表達(dá)下調(diào)，miR-22、miR-143表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組受試者miRNA表達(dá)比較

2.2 兩組受試者不同時間點(diǎn)miRNA表達(dá)比較 發(fā)病后4、8、12、24 h測定心肌梗死組的miRNA含量，同時，對健康組進(jìn)行測定。與健康組相比較，心肌梗死組在心肌梗死發(fā)病后4、8、12、24 h時血漿中l(wèi)et-7f、miR-21、miR-29b和miR-233表達(dá)明顯下調(diào)，miR-143和miR-22表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組受試者不同時間的miRNA表達(dá)比較

續(xù)表2 兩組受試者不同時間的miRNA表達(dá)比較

2.3 兩組肌鈣蛋白T水平比較 心肌梗死組發(fā)病后4、8、12、24 h肌鈣蛋白T分別為(1.27±0.08)ng/ml、(1.32±0.06)ng/ml、(0.61±0.02)ng/ml、(0.45±0.03)ng/ml，即發(fā)病后4～8 h肌鈣蛋白T水平上升，之后其水平下降。心肌梗死組發(fā)病后4、8、12、24 h的肌鈣蛋白T水平均高于健康組的(0.03±0.01)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 心肌梗死組不同時間點(diǎn)miRNA與肌鈣蛋白T相關(guān)性 let-7f(4 h,r2=0.844 9,8 h,r2=0.653 9,12 h,r2=0.501 2,24 h,r2=0.534 1)、miR-21(4 h,r2=0.618 5,8 h,r2=0.619 9,12 h,r2=0.533 6,24 h,r2=0.702 1)、miR-29b(4 h,r2=0.513 6,8 h,r2=0.541 5,12 h,r2=0.915 1,24 h,r2=0.512 8)、miR-223(4 h,r2=0.716 9,8 h,r2=0.914 1,12 h,r2=0.800 1,24 h,r2=0.733 5)與肌鈣蛋白T呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-22(4 h,r2=0.713 0,8 h,r2=0.831 8,12 h,r2=0.541 3,24 h,r2=0.919 3)、miR-143(4 h,r2=0.581 5,8 h,r2=0.717 1,12 h,r2=0.809 1,24 h,r2=0.929 7)與肌鈣蛋白T呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

miRNA是心血管健康和疾病中各種生理和病理生理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)各種生物學(xué)活動的進(jìn)程[8-9]，在心肌梗死、心力衰竭、肥厚性心肌病、高血壓等疾病中均存在多種miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象。有研究顯示，心肌梗死患者心肌細(xì)胞中miR-499水平升高，其能夠通過直接或間接的方式調(diào)節(jié)心肌蛋白激酶和磷酸酶的表達(dá)[10]。與健康成人心臟相比較，心肌梗死患者梗死心肌組織中的miR-208表達(dá)也上調(diào)[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，患者的miR-1、miR-133a、miR-208表達(dá)增加，且在發(fā)病后2.0 h內(nèi)達(dá)到峰值，而miR-499水平在2.5 h后仍繼續(xù)升高。循環(huán)miR-133a水平升高與心肌挽救率降低、梗死面積增大、再灌注損傷加重有關(guān)[13]。由此可見，多種miRNA在心肌梗死中發(fā)揮重要作用。Gan等[14]研究顯示，大鼠心肌梗死區(qū)let-7a和let-7f表達(dá)明顯下調(diào)。miR-21在心肌梗死后心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用[15]。有研究顯示，miR-22-5p、miR-132-5p、miR-150-3p可能是心肌梗死早期診斷的候選生物標(biāo)志物[16]。心肌細(xì)胞中miR-29表達(dá)下調(diào)可能會增強(qiáng)心肌的纖維化反應(yīng)[17]。miR-143作為一個潛在的纖維化相關(guān)靶基因，可能在心肌梗死中發(fā)揮重要作用[18]。miR-223被認(rèn)為具有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及分化的作用，可能對心肌梗死后心肌的纖維化產(chǎn)生一定影響[19]。本研究結(jié)果顯示，與健康組比較，心肌梗死組let-7f、miR-21、miR-29b、miR-223表達(dá)水平明顯下調(diào)，miR-22、miR-143表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；let-7f、miR-21、miR-29b、miR-223與肌鈣蛋白T呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miR-22、miR-143與肌鈣蛋白T呈正相關(guān)(P<0.05)。這說明，心肌梗死發(fā)病后，患者血漿中l(wèi)et-7f、miR-21、miR-29b、miR-223、miR-22、miR-143表達(dá)水平發(fā)生改變，且與肌鈣蛋白T水平存在相關(guān)性。

綜上所述，心肌梗死患者循環(huán)血漿中l(wèi)et-7f、miR-21、miR-29b、miR-223、miR-22、miR-143存在異常表達(dá)現(xiàn)象，這些異常表達(dá)的miRNA與肌鈣蛋白T水平的改變具有相關(guān)性，可能作為心肌梗死診治的潛在靶點(diǎn)。