誘導性低溫復蘇失血性休克大鼠腎組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子、法尼酯衍生物X受體表達研究

馬 銳，劉傳宏，王鑫宇，高廣榮，段福孝，張 成

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧省軍區(qū)沈陽第一離職干部休養(yǎng)所 門診部，遼寧 沈陽 110000

失血性休克是臨床常見急危重癥之一，血容量在短時間內(nèi)急劇下降可導致器官組織循環(huán)障礙、缺血缺氧，誘發(fā)多器官功能障礙，嚴重者可導致死亡[1]。誘導性低溫(induced hypothermia,IH)復蘇可改善失血性休克預后[2]。有研究報道，IH可通過增加機體的能量儲備和降低代謝率來調(diào)節(jié)能量代謝，從而提高復蘇效率[2-5]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1)、法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor,FXR)是參與能量代謝調(diào)控過程的重要基因[6-7]。在失血性休克引起的多器官功能障礙中，腎是較易受累的器官之一[8]。在失血性休克的救治過程中，IH復蘇對腎組織中PGC-1、FXR影響的相關(guān)研究報道較少。本研究通過觀察失血性休克大鼠不同溫度復蘇時腎組織中PGC-1、FXR的表達情況，分析失血性休克的基因調(diào)控機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑 力傳感器(Singapore Biosensors International PET.Ltd)；Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)護儀(GE公司)；高速冷凍離心機、PE-50管(Sigma公司)；Bayer Rapidlab 865型血氣分析儀(Bayer公司)；聚合酶鏈式反應擴增儀(Biometra公司)；紫外分光光度計(UV-visible Spectrometer,UV300)；微量輸液泵(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒(德泰生物有限公司)；肝素鈉(湖南華騰制藥有限公司)。PGC-1和FXR引物合成(上海生工生物工程有限公司)。PGC-1(sc-518025)和FXR(sc-25309)抗體(SANTA CRUZ公司)。

1.2 實驗動物與分組 40只成年SD大鼠(體質(zhì)量280～300 g)購自陸軍軍醫(yī)大學動物中心，將大鼠隨機分為對照組(n=8)、常溫復蘇組(n=16)及低溫復蘇組(n=16)。戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，氣管插管，接小動物呼吸機輔助呼吸。于左側(cè)股動靜脈處切開皮膚，逐步分離出左側(cè)股動脈及股靜脈，分別插管，用于放血和復蘇時液體回輸。于左側(cè)頸動脈處切開皮膚，分離出左側(cè)頸動脈，插管后用于監(jiān)測平均動脈壓。待大鼠麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后，常溫復蘇組、低溫復蘇組建立失血性休克模型。對照組僅進行手術(shù)操作，不建立休克模型。

1.3 失血性休克模型建立與復蘇 采用傳統(tǒng)失血性休克模型的構(gòu)建方法[9]，以25 ml/kg計算放血量，并在15 min內(nèi)完成放血，速度控制為0.5 ml/min。將血液儲存在肝素化無菌注射器并置于4℃冰箱保存，待復蘇時混合2倍格林液回輸。放血結(jié)束后，通過體外加溫毯、吹冷風及酒精擦拭的方法控制大鼠體溫。低溫復蘇組維持直腸溫度為32℃，常溫復蘇組維持直腸溫度為38℃。維持休克狀態(tài)60 min后，將混合2倍格林液的血液回輸進行復蘇，復蘇維持60 min。復蘇結(jié)束后，將各組大鼠直腸溫度維持在38℃。

1.4 觀察指標 復蘇結(jié)束后3 h，分別處死對照組、常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠各8只，取腎組織(髓質(zhì)、皮質(zhì))進行檢測，其余大鼠用于72 h生存分析。(1)采用定量聚合酶鏈式反應檢測各組大鼠腎組織PGC-1、FXR mRNA表達水平。RNA提?。簱v碎腎組織，加入Trizol和氯仿后離心，取上清液與等量異丙醇混合，再次離心后得到底層RNA白片。乙醇清洗后金屬洗5 min，隨后加入適量DEPC水，采用紫外分光光度計進行RNA純度與濃度檢測。反轉(zhuǎn)錄：TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，依次加入試劑后使用聚合酶鏈式反應儀行反轉(zhuǎn)錄，反應條件為37℃，15 min；85℃，5 s。聚合酶鏈式反應擴增：PGC-1引物序列，上游引物5′- CAGCCCTCTTCATCTCCAAG-3′，下游引物5′-TCGTGCAGGTCAGGTCATCAAGAAG-3′；FXR引物序列，上游引物5′-TTCGCTGTCCTCATTCACTG-3′，下游引物5′-GCAACTGCGTGATGGATATG-3′；GAPDH引物序列，上游引物5′-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3，下游引物5′-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。反應條件為95℃、30 s； 95℃、30 s，60℃、34 s，40個循環(huán)；60℃、1 min延伸。根據(jù)標準曲線計算結(jié)果，按照2-△△CT法計算目標基因在各組中表達的相對水平。(2)蛋白質(zhì)印跡法檢測PGC-1和、FXR蛋白表達水平。腎組織中加入已預冷的細胞裂解液，低溫勻漿后，超聲粉碎機粉碎。12 000 r/min離心15 min后取上清液，考馬斯亮藍法蛋白定量。聚丙烯凝膠電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜封閉后，加入一抗(PGC-1 1∶1 000；FXR 1∶1 000)，室溫免疫沉淀1 h后4℃搖洗過夜，次日加入二抗(1∶2 000)，常溫搖床作用2 h。浸膜后顯影拍照。使用ImageJ進行分析定量，記錄其相應蛋白條帶的平均光強度值，并計算PGC-1、FXR、GAPDH吸光度值的相對比值。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學變化情況 建模前，3組大鼠心率、平均動脈壓比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。建模后，常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠心率均較建模前明顯升高，平均動脈壓均較建模前明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。復蘇后，常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠心率均較建模后降低，平均動脈壓均較建模后升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 血流動力學指標

2.2 3組大鼠腎組織PGC-1、FXR mRNA表達情況 復蘇結(jié)束后3 h，常溫復蘇組大鼠腎組織中PGC-1 mRNA表達量高于對照組，而低溫復蘇組大鼠腎組織中PGC-1 mRNA表達量低于對照組、常溫復蘇組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。復蘇結(jié)束后3 h，常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠腎組織中FXR mRNA表達量均低于對照組，且低溫復蘇組低于常溫復蘇組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 3組大鼠腎組織PGC-1、FXR mRNA表達情況

2.3 3組大鼠腎組織PGC-1、FXR蛋白表達情況 復蘇結(jié)束后3 h，常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠腎組織PGC-1、FXR蛋白表達均低于對照組，且低溫復蘇組低于常溫復蘇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 復蘇結(jié)束后3 h大鼠腎組織PGC-1、FXR蛋白表達情況

2.4 生存分析 常溫復蘇組、低溫復蘇組大鼠在休克模型期、復蘇期均無死亡。復蘇后72 h，常溫復蘇組大鼠死亡5只，低溫復蘇組大鼠無死亡。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，低溫復蘇組大鼠72 h存活率顯著高于常溫復蘇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 常溫復蘇組與低溫復蘇組大鼠生存曲線

3 討論

機體快速失血超過全身總血容量的20%就會出現(xiàn)失血性休克。在失血性休克救治的研究中，糾正能量代謝失衡是需要解決的問題之一[10]。當發(fā)生失血性休克時，多種因素共同做用導致能量代謝失衡，其原因主要包括以下幾點：(1)失血性休克可使心輸出量減少，導致組織灌注不足，無氧代謝增加，使血乳酸水平升高，出現(xiàn)能量代謝紊亂。(2)失血性休克時機體可產(chǎn)生和釋放大量應激因子，減少胰島素合成和分泌，導致糖代謝紊亂。(3)失血性休克時機體組織對氧的利用能力受到限制，使氧自由基釋放增多、清除減少，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應；同時，這一過程可損傷線粒體，引起線粒體功能障礙[11]。機體核心體溫每下降10℃，全身代謝減少約50%，腦組織代謝減少63%[12-13]。還可明顯提高復蘇效率，改善失血性休克預后[14-15]。IH可調(diào)控機體能量代謝、維持能量平衡狀態(tài)，還可增加線粒體合成，保持三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)酶活性，降低組織細胞能量消耗，增加糖酵解敏感性[16]。

PGC-1可通過與調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，增強靶基因的轉(zhuǎn)錄效率，參與調(diào)節(jié)多種代謝通路。PGC-1在線粒體的生物合成、呼吸作用、適應性產(chǎn)熱，肝糖異生，以及脂肪酸的β氧化等過程中發(fā)揮重要作用[6,17-18]。既往研究報道，常溫復蘇3 h后大鼠肝中的PGC-1 mRNA表達明顯增加，而低溫復蘇3 h后，大鼠肝中的PGC-1 mRNA表達明顯減少[4]。失血性休克大鼠腸上皮細胞內(nèi)PGC-1 mRNA的表達在早期呈現(xiàn)增加趨勢[19]。其原因可能為常溫復蘇后細胞能量供給不足，導致適應性的線粒體合成增加、能量代謝增強，PGC-1 mRNA表達增加是機體對創(chuàng)傷后能量供給不足的一種適應性反應。本研究發(fā)現(xiàn)，腎組織中PGC-1蛋白在常溫復蘇時表達下降，這與PGC-1 mRNA的表達的趨勢相反。因失血性休克常溫復蘇時，機體能量代謝的調(diào)控處于失控狀態(tài)，雖然PGC-1 mRNA表達增加，但組織蛋白合成的原料不足，故PGC-1蛋白表達下降。而低溫復蘇時，腎組織中PGC-1 mRNA及蛋白表達均呈下降趨勢，且PGC-1蛋白的表達下降更明顯，分析其原因，低溫復蘇時機體對能量的需求更低，PGC-1 mRNA及蛋白表達均呈下降趨勢，是機體適應性的改變。

人類FXR基因表達于肝、腎上腺、結(jié)腸、腎、小腸等器官，而腦、心、肺和骨骼肌基本不表達[20]。FXR是一種膽汁酸受體，激活FXR途徑能夠控制膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運等過程；FXR在脂肪、糖類和能量代謝中也發(fā)揮重要作用[7]。FXR可從多種途徑參與能量代謝，包括調(diào)節(jié)糖異生、維持血糖穩(wěn)定、調(diào)節(jié)脂代謝、調(diào)節(jié)棕色脂肪生熱作用等[21]。小異二聚體伴侶分子(small heterodimer partner,SHP)是其下游直接靶基因，激活的FXR可活化下游的SHP來抑制能量代謝[20]。本研究中，常溫復蘇組大鼠的FXR mRNA表達減少，也是能量供給不足的一種適應性反應。既往研究報道，低溫復蘇時大鼠肝中FXR的下游基因SHP mRNA表達增加[4]。而本研究中，低溫復蘇大鼠的FXR mRNA表達則進一步減少。由此說明，低溫復蘇時FXR在參與能量代謝的過程中，為除FXR/SHP途徑以外的其他途徑占主導。本研究中，低溫復蘇時FXR mRNA的變化與PGC-1 mRNA的趨勢相同，并且PGC-1是FXR主要的調(diào)節(jié)因子。因此，F(xiàn)XR mRNA的變化可能為PGC-1調(diào)節(jié)的結(jié)果。

綜上所述，IH可調(diào)節(jié)失血性休克大鼠模型腎組織中PGC-1和FXR基因表達，從而改善能量代謝失衡。