李曉飛 劉穎 付崇建

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種致死性肺部疾病，全球發(fā)病率逐漸升高，自診斷之日起中位生存期為3～5 年[1]。從分子角度來看，IPF的發(fā)病過程伴隨著多種纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，如ACTA2， FN1， Col1a1， Col3a1的表達(dá)升高[2]。在IPF發(fā)生和加重的過程中，肺泡上皮細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)化扮演了至關(guān)重要的角色[3]。研究表明TGF-β信號(hào)可能導(dǎo)致肺泡上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而使其失去細(xì)胞黏附能力和基底特異的細(xì)胞極性[4]。因此，靶向TGF-β信號(hào)通路，抑制肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，可能是潛在的緩解肺纖維化的手段。

牙髓干細(xì)胞是一種間充質(zhì)干細(xì)胞[5]。牙髓干細(xì)胞的收集只需要進(jìn)行非侵入性手術(shù)，可在普通外科手術(shù)中摘除多余牙齒或智齒中進(jìn)行[6-7]。研究報(bào)道牙髓干細(xì)胞已經(jīng)在研究中被應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)支持體系等重建，牙頜面部軟硬組織的修復(fù)和免疫系統(tǒng)的特異性調(diào)節(jié)[8]。然而，目前尚無研究探索牙髓干細(xì)胞對(duì)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)能力以及其對(duì)于肺纖維化的的作用。該研究通過建立博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型并通過尾靜脈注射人牙髓干細(xì)胞來探索牙髓干細(xì)胞對(duì)肺纖維化的緩解作用，并探究其潛在的分子機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 人牙髓干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

2020 年10 月期間收集無齲壞和炎癥的完整智齒，用于此項(xiàng)研究。人牙齒的獲取和對(duì)牙齒的處理均經(jīng)過了解放軍960醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審批。采用聯(lián)合酶消化法獲取牙髓干細(xì)胞。使用孔徑為60 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾牙髓干細(xì)胞混合物，并用含雙抗和20%胎牛血清(Gibco公司， 新西蘭)的DMEM培養(yǎng)基收集細(xì)胞[9]。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6J背景的成年小鼠被飼養(yǎng)在解放軍960醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有的實(shí)驗(yàn)程序和規(guī)程均獲得了解放軍960醫(yī)院動(dòng)物使用與保護(hù)倫理委員會(huì)的審批[批號(hào): (2022)科研倫理審第(48號(hào))]。

1.3 肺纖維化模型建立和hDPSCs處理

成年C57BL/6J小鼠被隨機(jī)數(shù)字法分為4 組，每組16 只。對(duì)照組(Ctrl)：接受生理鹽水氣管注射(2 mg/kg)。博萊霉素組(BLM)：接受2 mg/mL博萊霉素(Sigma公司， 美國)溶液氣管注射(2 mg/kg)。hDPSCs-1組：接受2 mg/mL博萊霉素溶液氣管注射(2 mg/kg)和并通過尾靜脈注射數(shù)量為1×105牙髓干細(xì)胞(BLM處理后第3 天進(jìn)行)。hDPSCs-2組：接受2 mg/mL博萊霉素溶液氣管注射(2 mg/kg)和并通過尾靜脈注射數(shù)量為1×105牙髓干細(xì)胞(BLM處理后第7天進(jìn)行)。BLM處理后28 d處死小鼠取肺組織。

1.4 肺組織干重和肺系數(shù)計(jì)算

肺組織取下后立刻稱重，記錄為濕重。同時(shí)測(cè)量肺的長(zhǎng)度。將肺組織放入80 ℃烘箱中24 h，徹底烘干肺臟內(nèi)的水分，稱重，記錄為干重。肺系數(shù)計(jì)算公式為：肺系數(shù)=濕重(g)/小鼠體重(g)。

1.5 HE染色和Masson染色實(shí)驗(yàn)

按照操作說明書使用HE染色試劑盒、 Masson染色試劑盒(Abcam公司， 英國)對(duì)組織切片進(jìn)行HE和Masson染色。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)

本實(shí)驗(yàn)中使用ELISA試劑盒(Abcam公司, 英國)，按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行操作。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用氯仿和異丙醇從組織中提取RNA。GAPDH用作陰性對(duì)照。引物序列如表 1。

表 1 引物序列

1.8 Western-blot實(shí)驗(yàn)

RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)被用來提取組織中的蛋白質(zhì)。Smad2/3 抗體、 磷酸化Smad2/3抗體(p-Smad2/3, Abcam, 英國)； E-cadherin抗體、 Vimentin抗體、 GAPDH抗體(Cell Signaling Technology, 美國)被用來與蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs的處理緩解了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化癥狀

流氏分析被用來檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物以鑒定hDPSCs，包括CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19(圖 1)。HE染色顯示，BLM氣管注射導(dǎo)致小鼠正常肺臟結(jié)構(gòu)完全破環(huán)，包括肺泡結(jié)構(gòu)喪失和肺泡實(shí)質(zhì)化。而在BLM處理后第3天和第7天向小鼠尾靜脈內(nèi)注射1×105個(gè)hDPSCs，則可以延緩BLM對(duì)小鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞(圖 2A)。Masson染色實(shí)驗(yàn)表明，BLM氣管注射導(dǎo)致小鼠肺臟內(nèi)嚴(yán)重的纖維增生。而尾靜脈內(nèi)注射hDPSCs可以抑制纖維增生和膠原沉積(圖 2B)。BLM誘導(dǎo)小鼠的相對(duì)肺臟干重上升(圖 2C)。而在第3天(P<0.05)和第7天(P<0.01)向小鼠尾靜脈內(nèi)注hDPSCs可以使小鼠肺臟干重降低，并顯著降低小鼠肺臟指數(shù)(P<0.01， 圖 2D)。

圖 1 hDPSCs表面標(biāo)志物表達(dá)

圖 2 HE(A)， Masson(B)染色結(jié)果和小鼠肺臟重量(C、 D)

2.2 hDPSCs的處理抑制了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化相關(guān)基因的表達(dá)

BLM處理促進(jìn)ACTA2基因的表達(dá)(P<0.001)，而尾靜脈注射hDPSCs則抑制(P<0.001)(圖 3A)。相似的，在BLM誘導(dǎo)后第3天(P<0.05)和第7天(P<0.001)尾靜脈注射hDPSCs也顯著降低了在BLM誘導(dǎo)的肺組織中FN1的mRNA表達(dá)量(圖 3B)。有趣的是，只有在第7天注射hDPSCs可以降低Col1a1的表達(dá)量(P<0.001)(圖 3C)，而2 次注射對(duì)Col3a1的表達(dá)的抑制作用是相似的(P<0.001)(圖 3D)。

圖 3 hDPSCs中ACTA2， FN1， Col1a1， Col3a1的mRNA表達(dá)水平

2.3 hDPSCs的處理抑制了TGF-β1信號(hào)通路的激活

分析小鼠血清和肺臟內(nèi)TGF-β1水平。如圖 4A和 4B顯示，BLM處理顯著提高TGF-β1在小鼠血清和肺臟內(nèi)的含量(P<0.001)，而hDPSCs的處理可以逆轉(zhuǎn)這一過程。另一方面，hDPSCs尾靜脈注射并不能調(diào)控TGF-β1的受體Smad2的表達(dá)(圖 4C)。BLM刺激Vimentin高表達(dá)，而hDPSCs顯著抑制了這一過程(圖 4D)。BLM誘導(dǎo)E-cadherin低表達(dá)，而hDPSCs的處理促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)量提高(圖 4E)。

圖 4 小鼠血清內(nèi)和肺臟內(nèi)TGF-β1含量和小鼠肺臟組織內(nèi)Smad2， Vimentin， E-cadherin的mRNA表達(dá)水平

2.4 hDPSCs的處理抑制了Smad2/3的磷酸化

hDPSCs的尾靜脈注射不能調(diào)控Smad2的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索hDPSCs是如何調(diào)控TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路的，用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了Smad2/3的磷酸化和其下游基因的表達(dá)量。與圖3的結(jié)果一致，hDPSCs抑制了Vimentin的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)了E-cadherin的蛋白表達(dá)量(圖 5A)。更重要的是，雖然hDPSCs并沒有影響Smad2/3的蛋白表達(dá)總量，但是hDPSCs顯著抑制了被BLM誘導(dǎo)升高的Smad2/3的磷酸化水平，而且第3天或第7天給予hDPSCs的尾靜脈注射對(duì)于Smad2/3的磷酸化抑制作用并無顯著差異(圖 5A、 5B)。

圖 5 小鼠肺組織中pSmad2/3， Smad2/3， Vimentin， E-cadherin的蛋白量水平(A)和Smad2/3的磷酸化水平(B)

3 討 論

TGF-β在肺組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展中是不可或缺的介質(zhì)。多種因素可以導(dǎo)致TGF-β信號(hào)的激活，TGF-β分子與TGF-β受體(TGF-βR)相互作用并介導(dǎo)下游效應(yīng)[10]。TGF-β促進(jìn)上皮細(xì)胞發(fā)生以間充質(zhì)特征為特征的表型轉(zhuǎn)變。 此外，活躍的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)在介導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞活化以及隨后產(chǎn)生膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分中起著核心作用[11]。因此，靶向TGF-β信號(hào)通路并抑制肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化治療是極有潛力的肺纖維化潛在療法。

間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織重建和疑難疾病治療中[12]。大量研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞治療導(dǎo)致博來霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺中肺膠原沉積的改善和PF Ashcroft評(píng)分的改善，并顯著改善組織肺病理學(xué)[13]。然而，無論是臍帶，胎盤還是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，都具有獲取方法復(fù)雜，獲取量受限等問題，這極大的限制了間充質(zhì)干細(xì)胞在肺纖維化治療中的應(yīng)用[14]。

牙髓干細(xì)胞可以從生物廢材中廣泛獲取。而在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中，牙髓干細(xì)胞同樣顯示出了顯著的治療效果。本研究說明了尾靜脈注射牙髓干細(xì)胞可通過抑制TGF-β1/Smad2/3 信號(hào)通路激活的肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程緩解小鼠肺纖維化，且在造模第3天或第7天時(shí)給予效果無顯著區(qū)別。牙髓干細(xì)胞作為一種來源廣泛，獲取簡(jiǎn)單的間充質(zhì)干細(xì)胞，能顯著降低干細(xì)胞治療成本，并成為一種潛在的肺纖維化治療手段。