楊桂梅 孫玉梅 顏淑云 郭瑋

大黃素是從中藥大黃中提取的有效活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種生理活性，研究表明大黃素可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞活性及增殖，對(duì)牙周炎癥相關(guān)疾病具有一定的緩解作用[1-2]，具體作用機(jī)制仍不清晰?；钚匝?絲裂原活化蛋白激酶/活化蛋白1(reactive oxygen species/mitogen-activated protein kinase/activator protein-1，ROS/MAPK/AP-1)通路與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，細(xì)菌裂解后釋放的LPS可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，并促進(jìn)MAPK、AP-1的表達(dá)，并加速機(jī)體相關(guān)炎癥因子的表達(dá)[3-4]。本研究利用脂多糖誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)，初步探究大黃素作用機(jī)制，供臨床治療牙周病參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人牙齦成纖維細(xì)胞HGF-1(資源編號(hào)：BNCC339845)(北京貝納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。

1.2 主要試劑及儀器

大黃素(上海麥克林生化科技有限公司)；牙齦卟啉單胞菌內(nèi)毒素(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)； ROS活性氧誘導(dǎo)劑/ROS誘導(dǎo)劑(上海貝博生物有限公司)；抗MAPK、AP-1、GAPDH、山羊抗小鼠IgG(Abcam公司, 美國(guó)； p38-MAPK(武漢菲恩生物科技有限公司)； 細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-15AC， SANYO公司, 日本)； 酶標(biāo)儀(XElx800， Perkin Elmer公司, 美國(guó))；蛋白凝膠成像儀(GIS-500， 杭州Miulab公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HGF-1細(xì)胞株細(xì)胞復(fù)蘇，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)為37 ℃、 5% CO2，每?jī)商旄乱淮闻囵B(yǎng)液。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度高于80%時(shí)進(jìn)行0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 大黃素溶液制備

大黃素用二甲基亞砜溶解，配置成50 mmol/L的母液，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋成20、40、60、80、100、120 μmol/L的含藥培養(yǎng)基[5]。

1.5 大黃素對(duì)HGF-1細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8法測(cè)定大黃素對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGF-1細(xì)胞，接種于96 孔板，細(xì)胞約為1×104個(gè)/孔，分別加入不同濃度的(0、 20、 40、 60、 80、 100、 120 μmol/L)含大黃素培養(yǎng)基， 37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基后每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，測(cè)定各孔HGF-1細(xì)胞在450 nm處的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算不同濃度大黃素對(duì)HGF-1細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞活力(%)=[A加藥-A空白]/[A對(duì)照-A空白]×100%，A加藥：含有細(xì)胞、含大黃素培養(yǎng)基、CCK-8溶液孔的吸光度值；A空白：有相應(yīng)培養(yǎng)基、CCK-8溶液、無(wú)細(xì)胞孔的吸光度值；A加藥：含有細(xì)胞、CCK-8溶液、無(wú)藥培養(yǎng)基孔的吸光度值。

1.6 HGF-1細(xì)胞分組及藥物處理

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGF-1細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、 LPS組(800 μg/L LPS培養(yǎng)24 h后更換普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)[6]、大黃素組(800 μg/L LPS培養(yǎng)24 h后更換60 μmol/L大黃素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、ROS誘導(dǎo)劑組(800 μg/L LPS培養(yǎng)24 h后加入稀釋比為1∶1 000的ROS培養(yǎng)1 h，然后換用普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h)、大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組(800 μg/L LPS培養(yǎng)24 h后計(jì)入稀釋比為1∶1 000的ROS培養(yǎng)1 h，然后換用60 μmol/L大黃素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h)。培養(yǎng)結(jié)束后采集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 各組HGF-1細(xì)胞活力檢測(cè)

收集各組HGF-1細(xì)胞，根據(jù)CCK-8試劑盒中的具體操作步驟測(cè)定各組HGF-1細(xì)胞的細(xì)胞活力。

1.8 各組HGF-1細(xì)胞中炎性因子及氧化應(yīng)激因子表達(dá)水平檢測(cè)

收集各組HGF-1細(xì)胞，無(wú)菌條件下將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中， 1 000 g離心后取上清液，根據(jù)白細(xì)胞介素(interleukin， IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、丙二醛(malonaldehyde， MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)相關(guān)試劑盒中檢測(cè)步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.9 各組HGF-1細(xì)胞中ROS含量測(cè)定

利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測(cè)，收集各組HGF-1細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA(1∶1 000)， 37 ℃、5% CO2條件下孵育20 min，經(jīng)DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后在熒光分光光度計(jì)中測(cè)定DCF的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)的ROS可將無(wú)熒光的DCFH氧化為有熒光的DCF，因此DCF熒光強(qiáng)度越高即代表細(xì)胞內(nèi)ROS含量越多。

1.10 各組HGF-1細(xì)胞中ROS/MAPK/AP-1通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

收集各組HGF-1細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，移入無(wú)菌離心管中，低溫加入蛋白質(zhì)提取試劑盒中RIPA裂解液，充分裂解后離心取上清液，根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的操作步驟測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量，取20 μL各組待測(cè)樣品，通過(guò)SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，用TBST漂洗，然后用5%的脫脂奶粉室溫封閉，加入MAPK(1∶1 000)、AP-1(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗， 4 ℃條件下孵育并過(guò)夜，用TBST漂洗，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)繼續(xù)孵育2 h，經(jīng)顯色、曝光后分析各組HGF-1細(xì)胞中MAPK、 AP-1蛋白表達(dá)情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大黃素對(duì)HGF-1細(xì)胞增殖的影響

大黃素濃度在20～60 μmol/L時(shí)HGF-1細(xì)胞的細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，濃度在80～120 μmol/L時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，選擇60 μmol/L的大黃素濃度用于后續(xù)研究(表 1)。

表 1 大黃素對(duì)HGF-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 各組HGF-1細(xì)胞的細(xì)胞活力比較

與對(duì)照組相比，LPS組HGF-1細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，大黃素組HGF-1細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)；與大黃素組相比，ROS誘導(dǎo)劑組及大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)(表 2)。

表 2 各組HGF-1細(xì)胞活力比較

2.3 各組HGF-1細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，LPS組HGF-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)； 與LPS組相比，大黃素組HGF-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與大黃素組相比，ROS誘導(dǎo)劑組及大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表 3)。

表 3 各組HGF-1細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)水平比較

2.4 各組HGF-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，LPS組HGF-1細(xì)胞中SOD表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，MDA、LDH表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，大黃素組HGF-1細(xì)胞中SOD表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，MDA、LDH表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與大黃素組相比，ROS誘導(dǎo)劑組及大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中SOD表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，MDA、LDH表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中SOD表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，MDA、LDH表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表 4)。

表 4 各組HGF-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子表達(dá)水平比較

2.5 各組HGF-1細(xì)胞中ROS含量比較

與對(duì)照組相比，LPS組HGF-1細(xì)胞中ROS含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，大黃素組HGF-1細(xì)胞中ROS含量顯著降低(P<0.05)；與大黃素組相比，ROS誘導(dǎo)劑組及大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中ROS含量顯著升高(P<0.05)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中ROS含量顯著降低(P<0.05)(表 5)。

表 5 各組HGF-1細(xì)胞中ROS含量比較

2.6 各組HGF-1細(xì)胞中ROS/MAPK/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，LPS組HGF-1細(xì)胞中p38-MAPK、AP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，大黃素組HGF-1細(xì)胞中p38-MAPK、AP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與大黃素組相比，ROS誘導(dǎo)劑組及大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中p38-MAPK、AP-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中p38-MAPK、AP-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表 6、 圖 1)。

表 6 各組HGF-1細(xì)胞中MAPK、AP-1蛋白表達(dá)水平比較

圖 1 各組HGF-1細(xì)胞中p38-MAPK、AP-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

牙周病是由粘附在牙齒表面的微生物群引起的慢性感染性疾病，人牙齦成纖維細(xì)胞是牙周組織主要的細(xì)胞類別之一，在牙周組織修復(fù)及再生中發(fā)揮重要作用，在病理狀態(tài)下，人牙齦成纖維細(xì)胞被炎癥介質(zhì)激活，增加炎癥因子的釋放，進(jìn)而影響患者口腔健康[7-8]。牙周組織中的細(xì)菌裂解后產(chǎn)生的脂多糖可作用于牙齦成纖維細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞， 增強(qiáng)牙周組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與牙周病的產(chǎn)生與發(fā)展[9]。牙齦卟啉單胞菌是牙周病的重要致病菌之一，在整個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程中起到重要作用，用牙齦卟啉單胞菌LPS誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞HGF-1發(fā)生炎癥反應(yīng)的效果顯著[10]。本研究結(jié)果顯示，LPS顯著降低HGF-1的細(xì)胞活性，HGF-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子及MDA、LDH氧化應(yīng)激因子表達(dá)水平顯著升高，SOD表達(dá)水平顯著降低，提示LPS可誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞的炎性反應(yīng)，并降低其抗氧化能力，Dronik等[11]研究表明脂質(zhì)過(guò)氧化在牙周病患者牙周組織炎癥發(fā)生中起到重要作用，且與正常人相比，牙周炎患者血漿中沉積的MDA較多，抗氧化能力顯著較低。

大黃素是中藥大黃的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物活性， Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)大黃素可顯著降低花生四烯酸誘導(dǎo)的HepG2肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并顯著降低HepG2肝細(xì)胞中的ROS含量。張國(guó)華等[13]研究表明大黃素能顯著改善牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的大鼠牙周炎，并降低大鼠牙周組織中IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)大黃素處理的HGF-1細(xì)胞的細(xì)胞活力較LPS處理細(xì)胞有顯著提升，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子及MDA、LDH氧化應(yīng)激因子表達(dá)水平顯著降低，SOD表達(dá)水平顯著升高，表明大黃素具有抑制LPS誘導(dǎo)的HGF-1細(xì)胞炎性反應(yīng)，提高其抗氧化能力的作用。

多項(xiàng)研究表明ROS/MAPK/AP-1通路與機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，ROS在氧化劑應(yīng)激及炎癥反應(yīng)中具有重要作用，被促炎因子激活的成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生大量ROS，引起機(jī)體氧化還原失衡，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生過(guò)氧化損傷，進(jìn)而降低細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞死亡[14-15]，ROS會(huì)使下游的MAPK發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)P-1等多種轉(zhuǎn)錄因子[16]，激活的AP-1可增加IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[17]，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)。蘇麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸可通過(guò)抑制ROS/p38-MAPK/AP-1信號(hào)通路降低電離輻射誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，LPS組及ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中ROS含量、ROS/MAPK/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，表明HGF-1細(xì)胞的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與ROS/MAPK/AP-1通路的激活密切相關(guān)；與ROS誘導(dǎo)劑組相比，大黃素+ROS誘導(dǎo)劑組HGF-1細(xì)胞中ROS含量、ROS/MAPK/AP-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示大黃素緩解LPS誘導(dǎo)的HGF-1細(xì)胞炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)與抑制ROS/MAPK/AP-1通路有關(guān)。

綜上所述，大黃素具有降低LPS誘導(dǎo)的HGF-1細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用，可能通過(guò)抑制ROS/MAPK/AP-1通路發(fā)揮作用。