四種天然有機添加物對印度梨形孢形態(tài)及生長的影響

陳明花，劉煥煥，陳麗娟，熊 翔，何 勇，田志宏

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點實驗室，湖北荊州 434025）

1998 年，印度梨形孢（Piriformospora indica）在印度沙漠土壤中首次被分離出[1]，因孢子結(jié)構(gòu)形似梨形，故稱作印度梨形孢。印度梨形孢培養(yǎng)早期時為薄壁孢子，成熟后呈現(xiàn)為黃色、雙膜厚壁孢子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒狀的物質(zhì)，一般含有8～25 個細(xì)胞核。除區(qū)別于叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）的優(yōu)勢是可以用人工培養(yǎng)基純培養(yǎng)[2-3]外，印度梨形孢在形態(tài)和功能上與叢枝菌根真菌均相似。印度梨形孢在早期與植物建立共生關(guān)系，具有顯著改善宿主營養(yǎng)吸收的能力、促進植物生長等多種作用[4]，效果顯著、持續(xù)時間長，對環(huán)境非常安全[5]。印度梨形孢能促進水稻的生長發(fā)育[6]，顯著提高鐵皮石斛的葉綠素含量和藥用多糖含量[7]。李佳歡等探究了培養(yǎng)基種類、溫度、pH 值、碳源、氮源和無機鹽對印度梨形孢的影響，篩選出了一種比原MMN 培養(yǎng)基繼代時間縮短近2 倍的人工合成培養(yǎng)基，平均生長速率達(dá)到1.808 3 cm·d-1[8]。觀察微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)通常借助顯微技術(shù)，陳安良等[9]和吳方麗等[10]利用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)觀察到番茄灰霉病菌形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)有顯著差異，El-Ganiny等[11]通過掃描電鏡觀察到煙曲霉菌各菌株的菌絲寬度、生長速度、菌絲分支情況和分生孢子數(shù)量不同。目前，關(guān)于印度梨形孢最佳培養(yǎng)基的研究有較多報道，但稀有利用天然有機添加物進行印度梨形孢的固體與液體培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察研究印度梨形孢的報道。本研究利用固體和液體兩種培養(yǎng)方式，觀察四種天然有機添加物對印度梨形孢形態(tài)和生長速度的影響，旨在篩選出適合印度梨形孢培養(yǎng)生長的天然有機添加物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天然有機添加物（芹菜、白菜、椰子、香蕉）均為從湖北荊州的菜市場購買，印度梨形孢為本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

固體培養(yǎng)基：以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，稱取100 g·L-1天然有機添加物（芹菜、白菜、去皮香蕉切小段，椰子取椰子水），分別煮制20 min，冷卻至室溫，用8 層紗布過濾，加入1/2 MS 基本培養(yǎng)基中，用1 mol·L-1KOH 調(diào)節(jié)pH 值至5.8，加入8 g·L-1瓊脂，于121 ℃、20 min條件下高壓滅菌。

液體培養(yǎng)基：方法同固體培養(yǎng)基，不加瓊脂。

1.2.2 在不同固體培養(yǎng)基中印度梨形孢的形態(tài)和生長速度

將印度梨形孢活化后，用直徑5 mm 的打孔器打孔，獲得均勻一致的含有印度梨形孢的菌餅。每個直徑90 mm的平板培養(yǎng)基接入一個直徑5 mm的菌餅，于28 ℃避光培養(yǎng)，分別觀察印度梨形孢的菌斑、氣生菌絲、菌絲體和孢子形態(tài)。借助正置顯微鏡觀察并拍攝氣生菌絲和孢子形態(tài)，測定接種后4、6、7、8、10 d的菌斑直徑大小，用“生長速度=菌斑直徑/培養(yǎng)時間”計算印度梨形孢菌斑生長速度，生長速度、菌斑直徑、培養(yǎng)時間單位分別為cm·d-1、cm、d。

1.2.3 在不同液體培養(yǎng)基中印度梨形孢的形態(tài)和生長速度

將印度梨形孢活化后，用直徑5 mm的打孔器打孔，獲得均勻一致的含有印度梨形孢的菌餅。在盛裝50 mL液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶內(nèi)接入2個直徑5 mm的菌餅，于28 ℃，200 r·min-1避光培養(yǎng)。分別從宏觀和微觀層面觀察接種后7 d 印度梨形孢菌絲的菌落和孢子形態(tài)，借助正置顯微鏡觀察和進行微觀拍攝；產(chǎn)孢量采用血球計數(shù)板計數(shù)；離心去上清液，取沉淀物（菌絲體）稱量鮮重，烘干（60 ℃、72 h）稱量干重，測定用天平為萬分之一精確天平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)重復(fù)測定3 次。采用Excel 2019 收集并處理數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0 進行方差分析，用Duncan 新復(fù)極差法分析不同組之間的差異顯著性（顯著性水平P＜0.05），用Adobe Photoshop 2020處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加物固體培養(yǎng)基對印度梨形孢形態(tài)和生長速度的影響

印度梨形孢在不同天然有機添加物的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌斑和氣生菌絲均有差異，無添加物和添加芹菜的培養(yǎng)基上可見稀疏透明的菌斑，而添加白菜、椰子水和香蕉的培養(yǎng)基上可見粘附性強的菌斑（見圖1a）。

在正置顯微鏡下觀察，相比于無添加物的培養(yǎng)基中的印度梨形孢氣生菌絲，添加椰子水、香蕉和白菜的培養(yǎng)基中印度梨形孢氣生菌絲分支最多、菌絲最密集，其中添加椰子水和白菜培養(yǎng)基中的氣生菌絲比添加香蕉的細(xì)長，有部分氣生菌絲彎曲現(xiàn)象，添加香蕉的培養(yǎng)基中氣生菌絲最短小、粗壯、挺直。無添加物和添加芹菜的培養(yǎng)基中印度梨形孢氣生菌絲細(xì)長且稀疏，均有部分氣生菌絲彎曲現(xiàn)象，無添加物的培養(yǎng)基中的氣生菌絲彎曲程度大于添加芹菜培養(yǎng)基（見圖1a）。

不同添加物均能不同程度地促進印度梨形孢菌斑的生長（見圖2a），培養(yǎng)7 d 時，相比于其他添加物，添加白菜和椰子水的培養(yǎng)基中印度梨形孢菌斑生長速度最高，分別為0.77、0.75 cm·d-1。

用接種后4、6、8、10 d 的菌斑直徑繪制生長速度曲線（見圖2b），可見在添加了不同有機物后，印度梨形孢生長速度有不同程度的提高，隨培養(yǎng)時間增加，菌斑的生長速度有差異，其中以添加椰子水的培養(yǎng)基中印度梨形孢菌斑在不同時間內(nèi)生長速度均為最高?？傮w而言，印度梨形孢菌斑的生長速度為添加椰子水＞白菜＞香蕉＞芹菜＞無添加物，椰子水、白菜及香蕉是比較適合印度梨形孢生長的添加物，印度梨形孢最適合在添加椰子水的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

圖2 印度梨形孢的生長指標(biāo)

2.2 不同添加物液體培養(yǎng)基對印度梨形孢形態(tài)和生長速度的影響

印度梨形孢在不同添加物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌絲體和孢子均有差異（見圖1b）。取接種后7 d液體培養(yǎng)基中的印度梨形孢觀察菌絲體，發(fā)現(xiàn)無添加物和添加椰子水培養(yǎng)基中的菌絲體均呈現(xiàn)白色，其他添加物的培養(yǎng)基中菌絲體為褐色。相較于無添加物，在添加芹菜的培養(yǎng)基中印度梨形孢菌絲球大小不一，呈現(xiàn)海膽放射狀；在添加椰子水的培養(yǎng)基中印度梨形孢菌絲體呈現(xiàn)圓而緊密的球狀菌絲球，并且數(shù)量最多；添加白菜和香蕉的培養(yǎng)基中菌絲體介于海膽狀和球狀之間，菌絲球數(shù)量添加香蕉培養(yǎng)基中的比添加白菜培養(yǎng)基中的多，且多呈條狀。取液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢觀察孢子的形態(tài)，其中添加椰子水和香蕉培養(yǎng)基中的印度梨形孢的孢子形態(tài)分布情況是孢子在液體培養(yǎng)基原濃度下稀釋10倍獲得的，其他培養(yǎng)基的孢子分布情況不經(jīng)過稀釋。觀察發(fā)現(xiàn)，五種培養(yǎng)基均含有印度梨形孢成熟的厚垣孢子。添加椰子水、白菜、香蕉培養(yǎng)基中的孢子圓潤，大小均勻一致，添加椰子水的培養(yǎng)基中孢子數(shù)量最多；添加芹菜的培養(yǎng)基含有少量典型特征的梨形孢子；無添加物的培養(yǎng)基中的孢子大小不一，含有大量小孢子。

圖1 在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上印度梨形孢的形態(tài)

不同添加物均能不同程度地促進印度梨形孢的生長。印度梨形孢的菌鮮重在添加椰子水的培養(yǎng)基中最大，為2.396 g，添加香蕉的培養(yǎng)基其次，為1.673 g，添加白菜、芹菜、無添加物的培養(yǎng)基最小且之間沒有差異（見圖2c）；干重在添加椰子水培養(yǎng)基中最大，為0.077 g，添加香蕉的培養(yǎng)基其次，為0.058 g，添加白菜、芹菜的培養(yǎng)基較小且之間沒有差異，無添加物的培養(yǎng)基最?。ㄒ妶D2d）；產(chǎn)孢量在添加椰子水的培養(yǎng)基中最大，為3.8×106個·mL-1，添加香蕉的培養(yǎng)基其次，為2.87×106個·mL-1，添加白菜、芹菜的培養(yǎng)基較小且之間沒有差異，無添加物的培養(yǎng)基最?。ㄒ妶D2e），表明印度梨形孢最適合在添加椰子水的培養(yǎng)液中生長。

3 討論與結(jié)論

由于天然有機添加物富含氨基酸、生長調(diào)節(jié)劑、酶和其他有機物，影響印度梨形孢培養(yǎng)的生長速度，而天然有機添加物獲取方便、價格便宜，因此通過篩選適宜的天然有機添加物來促進印度梨形孢的培養(yǎng)成為可能。本試驗結(jié)果，添加白菜，在固體培養(yǎng)基中印度梨形孢的生長速度大于添加香蕉培養(yǎng)基，但在液體培養(yǎng)基中印度梨形孢的菌鮮重、產(chǎn)孢量、菌干重均小于添加香蕉培養(yǎng)基，原因不明，這或許是由于印度梨形孢在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌絲速率不同[12]。Lu 等認(rèn)為多個凝聚的孢子只能形成一個菌絲球，一方面降低了成球率，另一方面由于其直徑較大的菌絲球中心形成致密區(qū)，隔絕了液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的接觸和有效轉(zhuǎn)化，最終降低了菌體的轉(zhuǎn)化速率[13]。金賽等通過在液體培養(yǎng)基中添加有機顆粒玉米粒和振蕩分散兩種方法顯著減低黑曲霉菌絲球聚集，調(diào)控了形態(tài)均一性，同時研究發(fā)現(xiàn)，無論種子培養(yǎng)基中是否含有顆粒物，分散的發(fā)芽孢子均能形成大量的小菌絲球，進而提高成球率和產(chǎn)檸檬酸速率[14]。在本研究中，只有添加香蕉培養(yǎng)基發(fā)酵液呈稀釋的果凍狀，這個差異可能起到了分散孢子間的聚集作用，最終導(dǎo)致添加香蕉培養(yǎng)基中存在大量的小菌落和較大的干重、鮮重和孢子數(shù)。本試驗采用的去皮香蕉，對促進印度梨形孢生長的效果僅次于椰子水，表明去皮香蕉是促進印度梨形孢生長的備選天然物。

在固體培養(yǎng)基中，添加椰子水的印度梨形孢菌絲密集、細(xì)長、分叉多，菌斑生長速度最快，表明椰子水最適合印度梨形孢的生長；在液體培養(yǎng)基中，添加椰子水的印度梨形孢菌落圓潤、緊密，形成大小一致的菌絲球，鮮重、干重、產(chǎn)孢量最大，分別為2.396 g、0.077 g、3.8×106個·mL-1。微生物利用單糖和二糖，桂青等研究表明，椰子水在椰子中含糖量最高，其中主要為蔗糖、果糖和葡萄糖[15]，這可能是本試驗的印度梨形孢在添加椰子水的培養(yǎng)基中比在其余四種培養(yǎng)基中生長更好的原因，另外值得一提的是，椰花序汁含有蔗糖，椰肉含有不同糖類，也可能成為印度梨形孢培養(yǎng)基的備選天然有機添加物。El-Ganiny 等研究發(fā)現(xiàn)，缺陷型煙曲霉菌菌株的分生孢子不能在作為唯一碳源的半乳糖上形成菌落，種類多樣的糖類可能有利于微生物糖類的利用，而椰子含有的豐富糖類或許是印度梨形孢最佳培養(yǎng)基的候選天然有機添加物[11]，這或?qū)⒂欣谔岣咭拥睦脙r值。該研究觀察到菌絲和孢子的差異，但未觀察超微結(jié)構(gòu)的差距，有待借助掃描電鏡進一步觀察菌絲寬度、細(xì)胞長度等的差異，借助透射電鏡觀察細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁厚度。潘越等檢測到斑玉蕈隨培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液的pH 值和電導(dǎo)率均升高，還原糖含量降低[16]，這表明蔗糖被利用了。本試驗使用的四種天然添加物成分復(fù)雜，例如添加物中的糖類種類及其含量的差異可能在培養(yǎng)過程中被印度梨形孢利用的程度會有差異，進而影響發(fā)酵液的pH、電導(dǎo)率和還原糖等，是否會間接反作用印度梨形孢的生長，有待進一步驗證。

印度梨形孢菌斑的生長速度依次為添加椰子水＞白菜＞香蕉＞芹菜＞無添加物，鮮重、干重、產(chǎn)孢量均為椰子水＞香蕉＞白菜＞芹菜＞無添加物，說明菌斑生長速度和其鮮重、干重、產(chǎn)孢量大小基本一致。本研究結(jié)合菌落直徑與鮮重、干重、產(chǎn)孢量生長指標(biāo)，全面地反映了印度梨形孢的生長情況，也回答了菌落直徑與其生物量和產(chǎn)孢量相關(guān)的問題[8]。

綜合固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，添加椰子水對印度梨形孢的形態(tài)和生長影響顯著，椰子水是在五種培養(yǎng)基中最適合印度梨形孢生長的添加物，本結(jié)論可為天然有機添加物對印度梨形孢生長的影響提供理論依據(jù)。