磷酸銨鎂對(duì)羊腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用

劉若楠，鄒東敏，劉茂軍，馬玉忠*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030620；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

羊尿結(jié)石是育肥羊一種常發(fā)的代謝病，近年來(lái)該病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。尿結(jié)石可致腎臟功能障礙，腎小管結(jié)構(gòu)受損，而腎小管上皮細(xì)胞(RTECs)損傷在結(jié)石形成中起著關(guān)鍵的作用，晶體能在受損的RTECs上黏附、聚集[1]。RTECs是腎臟攝取和排泄的主要部位，已被廣泛用于腎臟相關(guān)疾病的研究[2]。磷酸銨鎂(MAP)結(jié)石是羊常見(jiàn)的結(jié)石類型[3]。研究表明，增加飲食中鎂的含量可促進(jìn)MAP結(jié)石的形成，并引起腎損傷[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)MAP對(duì)羊RTECs的損傷作用，以期為臨床防治羊尿路結(jié)石提供啟示和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康小尾寒羊，雄性，3～4月齡，來(lái)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；結(jié)石病羊來(lái)自唐縣試驗(yàn)基地，病羊經(jīng)DR檢查確診。

1.2 試劑磷酸銨鎂(上海伊卡)；細(xì)胞角蛋白18抗體(Abcam公司)；山羊抗小鼠IgG-FITC、5%BSA、DAPI、4%多聚甲醛、Triton X-100、CCK-8試劑盒(Solarbio公司)；DMEM/F12、膠原酶Ⅰ (Gibco公司) ；胎牛血清 (杭州四季青) ；LDH試劑盒、肌酐、尿素氮、磷、鎂測(cè)試盒(南京建成)；IL-6、TNF-α(DG公司)；NBT/BCIP試劑盒、p65 NF-κB、p-NF-κB p65、Caspase-3、Bax、Bcl-2(Bioss公司)；山羊抗兔IgG-AP(北京中杉金橋)IκBα、p-IκBα(碧云天)。

1.3 臨床癥狀觀察及實(shí)驗(yàn)室檢查

1.3.1尿沉渣鏡檢 觀察尿結(jié)石羊癥狀，取20份結(jié)石羊尿沉渣，置于離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min，取沉淀于載玻片上，顯微鏡觀察尿沉渣的形態(tài)，將尿沉渣瑞氏染色后鏡檢。

1.3.2生化指標(biāo)檢測(cè) 采集病羊尿液和血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，觀察血液和尿液中的磷、肌酐、尿素氮、鎂、尿pH值等指標(biāo)的變化。

1.4 病理組織觀察在河北省唐縣試驗(yàn)基地，取結(jié)石羊腎臟，固定于10%甲醛溶液中，經(jīng)脫水、包埋、切片(5 μm)等制作腎組織石蠟切片，HE染色，在顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定取健康小尾寒羊腎臟，PBS清洗，剝離被膜，取腎皮質(zhì)，切成約1 mm3的小塊，加1 g/L膠原酶Ⅰ，37℃水浴消化2 h。將消化液1 000 r/min離心5 min，棄上清，獲取的細(xì)胞于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞鋪于放有蓋玻片的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)取出蓋玻片，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100孵育18 min，PBS洗3次；1% BSA封閉40 min，加Cytokeratin-18抗體，37℃反應(yīng)1 h，PBS洗片3次，滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃避光孵育30 min，PBS洗片3次，DAPI避光孵育5 min，PBS洗5 min×3次，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板中，每組6個(gè)重復(fù)，分別用0,1，3，5，10和15 g/L MAP處理12，24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃培養(yǎng)2 h，測(cè)定450 nm處的吸光度。細(xì)胞存活率(%)=(D試驗(yàn)組-D空白)/(D對(duì)照組-D空白)×100%

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞分組與處理同1.2.4，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)TNF-α、IL-6的含量。

1.8 微板法檢測(cè)LDH含量細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞分組與處理同1.6，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)LDH的含量。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞分組與處理同1.6，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加RIPA裂解液100 μL，反復(fù)吹打，4℃，12 000 r/min離心10 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗4℃過(guò)夜。次日，二抗室溫1 h，洗膜，NBT/BCIP試劑盒顯色。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察發(fā)病羊精神沉郁，食欲減退，不斷呻吟咩叫，站立不穩(wěn)，不斷作排尿姿勢(shì)(圖1)，但只能排出少量尿液或尿液呈點(diǎn)滴狀排出，有時(shí)出現(xiàn)血尿。龜頭處可觸摸到沙粒樣結(jié)石，排尿痛苦且排尿時(shí)間長(zhǎng)。后期出現(xiàn)尿淋漓或無(wú)尿排出，腹部、包皮或陰囊周?chē)[。

2.2 生化檢查由表1，2可知，2組羊尿液pH值均偏堿性，但尿結(jié)石羊尿液pH明顯高于健康組(P<0.01)，尿結(jié)石羊血液鎂離子和磷離子明顯升高，與健康羊相比差異極顯著(P<0.01)，而尿液鎂離子和磷離子出現(xiàn)降低，且鎂離子與健康組相比差異極顯著(P<0.01)，血清肌酐和尿素氮也極顯著高于健康組(P<0.01)。

2.3 尿液鏡檢對(duì)20份結(jié)石羊尿液進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)結(jié)石羊尿沉渣增多，其中14份尿液可發(fā)現(xiàn)磷酸銨鎂晶體(圖2A)。染色后發(fā)現(xiàn)腎上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞(圖2B)。同時(shí)在尿液中觀察到了精子，可能是由于尿石沉積，堵塞尿道，出現(xiàn)精子逆行進(jìn)入膀胱的現(xiàn)象(圖2C)。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察膠原酶Ⅰ消化的腎組織能獲得較多且完整的腎小管節(jié)段(圖3A)，3 d后有細(xì)胞爬出，12 d左右即可鋪滿瓶底。HE染色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，單個(gè)細(xì)胞形狀不規(guī)則，呈三角形或長(zhǎng)梭形(圖3B)。純化后的羊RTECs經(jīng)過(guò)免疫熒光鑒定，細(xì)胞核被染為藍(lán)色(圖3D)，95%以上細(xì)胞胞漿均出現(xiàn)綠色熒光(圖3C)，說(shuō)明細(xì)胞角蛋白18抗體反應(yīng)陽(yáng)性(圖3E)，證實(shí)純化得到的細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞。

1.消化2 h獲得的腎小管節(jié)段；B.羊RTECs HE染色；C.細(xì)胞角蛋白18的分布；D.DAPI核染；E.C與D合成圖

2.5 腎臟HE染色健康羊腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管排列有序，形態(tài)清晰(圖4A)。結(jié)石羊腎臟結(jié)構(gòu)破壞，并伴有出血、淤血。腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)有脫落的上皮細(xì)胞和白細(xì)胞(圖4B)；腎小球腫脹，腎小管上皮細(xì)胞變性脫落，毛細(xì)血管擴(kuò)張(圖4C)；腎間質(zhì)充血出血，腎小管上皮細(xì)胞水泡變性(圖4D)。

1.健康腎臟；B～D.結(jié)石羊腎臟

2.6 細(xì)胞活力由圖5可知，隨著時(shí)間和MAP質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢(shì)。5，10和15 g/L MAP對(duì)羊RTECs活力抑制作用最明顯(P<0.05，P<0.01)。

圖5 MAP對(duì)羊RTECs活力的影響

2.7 炎性因子檢測(cè)結(jié)果顯示，MAP可誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達(dá) (圖6)。5，10和15 g/L MAP對(duì)羊RTECs IL-6和TNF-α表達(dá)水平與對(duì)照組相比有顯著性升高(P<0.05，P<0.01)。

圖6 MAP對(duì)羊RTECs IL-6(左)、TNF-α(右)表達(dá)水平的影響

2.8 LDH含量測(cè)定由圖7可知，隨著MAP濃度的增加，細(xì)胞上清LDH含量上升趨勢(shì)(P<0.01)，說(shuō)明細(xì)胞出現(xiàn)了損傷。

圖7 MAP對(duì)羊RTECs LDH表達(dá)的影響

2.9 NF-κB信號(hào)通路變化由圖8可知，羊RTECs在MAP處理不同時(shí)間后，p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加，表明MAP可激活羊RTECs NF-κB炎性通路。

2.10 Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)MAP處理后，羊RTECs中Caspase-3的表達(dá)水平極顯著性升高(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)水平逐漸降低，Bax水平明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05,P<0.01)。

A.12 h蛋白條帶；B,C.圖A灰度值分析；D.24 h蛋白條帶；E,F.圖D灰度值分析；G.48 h蛋白條帶；H,I.圖G灰度值分析

3 討 論

羊尿結(jié)石作為一種常發(fā)的代謝疾病，受多種因素影響和調(diào)控，治療效果不甚理想，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)不少損失，因此合理的防控成為預(yù)防該病發(fā)生的重要手段。迄今為止，其確切機(jī)制尚不明確。大量研究表明，結(jié)石形成過(guò)程中均與氧化應(yīng)激及腎小管上皮細(xì)胞損傷相關(guān)，并在結(jié)石形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。腎小管上皮細(xì)胞損傷可以促進(jìn)細(xì)胞與晶體的相互作用，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)石的形成[6]。本研究結(jié)合臨床上羊常發(fā)的尿結(jié)石類型，從細(xì)胞水平上探索結(jié)石的形成機(jī)制，為羊尿結(jié)石的防控提供了新思路。

A.12 h蛋白條帶；B,C.圖A相對(duì)定量分析；D.24 h蛋白條帶；E,F.圖D相對(duì)定量分析；G.48 h蛋白條帶；H,I.圖G相對(duì)定量分析

尿結(jié)石的形成與體內(nèi)磷、鎂、鈣等多種離子代謝相關(guān)，他們主要是通過(guò)促進(jìn)或抑制晶體的生長(zhǎng)或聚集；或通過(guò)影響體內(nèi)離子環(huán)境調(diào)控結(jié)石的形成；或影響腎濾過(guò)功能改變尿液理化性質(zhì)等方式直接或間接參與結(jié)石的形成[7]。本研究結(jié)果顯示，尿結(jié)石羊血液鎂離子和磷離子均顯著高于健康羊，而尿液中鎂離子和磷離子卻低于健康羊，可能是由于羊采食過(guò)多含磷的谷物，或飼喂過(guò)多精料，導(dǎo)致血液中磷的含量增加，而尿液中鎂和磷離子形成尿沉渣或參與結(jié)石的形成引起含量降低。血液肌酐和尿素氮水平可作為衡量腎小球?yàn)V過(guò)功能的重要指標(biāo)。當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)功能下降時(shí)，血清尿素氮含量明顯升高[8]。本研究結(jié)果顯示，血清肌酐和尿素氮也明顯高于健康羊，提示尿結(jié)石羊腎臟出現(xiàn)一定的損傷，與閆鴻[9]報(bào)道一致。

NF-κB是一種重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,調(diào)控著細(xì)胞的存活、增殖、凋亡等一系列過(guò)程。正常情況下，NF-κB p65處于非活性狀態(tài)，一旦激活后就調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)氧化炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡[10]。NF-κB信號(hào)通路激活產(chǎn)生炎性因子，導(dǎo)致細(xì)胞基底膜暴露供晶體附著[11]。在多種腎臟疾病中，也檢測(cè)到了NF-κB通路的過(guò)表達(dá)，在草酸鈣處理細(xì)胞時(shí)，也觀察到了NF-κB通路激活，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)石相關(guān)蛋白的表達(dá)[12]。本研究觀察了p-NF-κB p65和p-IκBα的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MAP組中p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有不同程度上調(diào)，說(shuō)明MAP對(duì)羊RTECs的損傷作用與NF-κB通路的激活有關(guān)，通過(guò)激活NF-κB通路促進(jìn)炎性因子表達(dá)，進(jìn)而在結(jié)石形成中發(fā)揮作用。TNF-α和IL-6是常用的氧化應(yīng)激炎癥監(jiān)控指標(biāo)，主要參與炎癥反應(yīng)。本研究中，MAP組IL-6、TNF-α和LDH水平明顯均高于對(duì)照組，說(shuō)明MAP可以促進(jìn)羊RTECs的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，而細(xì)胞損傷又為結(jié)石形成提供了條件。

Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的成員，是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。與Bcl-2相反，Bax是一種重要的促凋亡蛋白，Bcl-2與Bax比值的改變對(duì)判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡具有重要意義[13]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，對(duì)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，其激活被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中的“執(zhí)行者”[14]。腎小管細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是尿路梗阻疾病腎組織損害的重要原因，尿路梗阻使腎小管細(xì)胞凋亡水平明顯增高[15]。本研究結(jié)果顯示，MAP增加Caspase-3和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低Bcl-2/Bax的比值，說(shuō)明高濃度MAP能促進(jìn)RTECs凋亡，導(dǎo)致腎臟損害，從而促進(jìn)晶體在腎臟的黏附聚集。

綜上所述，尿結(jié)石羊尿沉渣主要為磷酸銨鎂晶體，血液和尿液鎂離子和磷離子變化顯著，并伴有腎臟功能受損，可能與長(zhǎng)期飼喂高精料日糧有關(guān)。細(xì)胞試驗(yàn)表明，MAP能抑制羊RTECs的細(xì)胞活力、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，激活NF-κB通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。