張興鎧， 趙金發(fā)， 王瑩， 周常勇， 周彥

西南大學(xué) 柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712

柑橘作為世界第一大水果，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.自加入世貿(mào)組織以來，中國柑橘種植面積和產(chǎn)量增長迅速.截至2019年，中國柑橘栽培面積為277萬hm2，產(chǎn)量達(dá)4 584萬t(2020年國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù))，均位列世界首位，柑橘已成為全面實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的重要支柱產(chǎn)業(yè).柑橘在生產(chǎn)過程中受到多種因素的影響，其中由柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)引起的柑橘衰退病是制約世界柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素.

CTV為長線形病毒科(Closteroviridae)長線形病毒屬(Closterovirus)成員，主要通過嫁接和蚜蟲進(jìn)行傳播.CTV基因組為一條約19 260 nt的正義單鏈RNA，包含兩個(gè)非編碼區(qū)和12個(gè)開放閱讀框(ORFs)，是已知最大的植物病毒[1].CTV在田間具有復(fù)雜的株系分化現(xiàn)象，根據(jù)其癥狀差異，分為苗黃、速衰和莖陷點(diǎn)3種主要類型[2-4].同時(shí)，根據(jù)其基因組序列的變異被分為T36，VT，T30，T3，RB，T68，HA16-5和S1等多個(gè)基因型[1，5-8].其中，T36與VT基因型通常與速衰癥狀相關(guān)，T3，VT，RB和T68基因型與莖陷點(diǎn)癥狀相關(guān)聯(lián)[9-14]，而S1和T30基因型通常不引起明顯的癥狀[6，15].由于CTV全序列測(cè)定的難度較大，因此ORF1a，5’UTR，RdRp等區(qū)域常被作為CTV分型的重要靶標(biāo)，其中因ORF1a的多樣性最為豐富，是目前使用較多的CTV分型依據(jù)[5，16-18].

雖然CTV在中國的分布極為廣泛，但由于長期以來大量使用枳、酸橙、紅橘等抗耐砧木，速衰型衰退病僅在云南的賓川、建水等地有過少量發(fā)生[19].莖陷點(diǎn)型衰退病對(duì)中國柑橘產(chǎn)業(yè)為害較為嚴(yán)重，曾對(duì)四川、重慶等地的甜橙品種造成了嚴(yán)重?fù)p失[20].近年來莖陷點(diǎn)型衰退病在我國最重要的臍橙產(chǎn)區(qū)——江西贛州暴發(fā)，導(dǎo)致臍橙生長緩慢、樹勢(shì)減弱、產(chǎn)量和品質(zhì)降低，損失嚴(yán)重.前期研究顯示，贛州CTV發(fā)生較為普遍，雖多為VT和T36基因型混合發(fā)生，但未曾對(duì)臍橙產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害[21-23].因此，本研究擬通過研究贛州CTV種群的基因型構(gòu)成及變化，以期為進(jìn)一步探明江西贛州莖陷點(diǎn)型衰退病暴發(fā)的原因提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019-2020年，在江西贛州大余、尋烏、章貢、南康等10個(gè)縣(區(qū))的臍橙園采集了199個(gè)疑似感染CTV的紐荷爾臍橙樣品.此外，于2004-2007年從贛州尋烏、信豐、南康紐荷爾臍橙上采集的9個(gè)CTV毒株由西南大學(xué)柑桔研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 CTV檢測(cè)

從每棵植株的3個(gè)不同方向上共選取100 mg嫩葉，混合后使用RNAisoplus(TaKaRa，日本)抽提總RNA.利用引物CP1：5’-ATGGACGACGAAACAAAG-3’，CP3：5’-TCAACGTGTGTTGAATTT-3’，進(jìn)行PCR檢測(cè).

1.2.2 基因型鑒定

樣品有試驗(yàn)獲得的112份陽性樣品及9份課題組前期保存的試驗(yàn)樣品，使用前期報(bào)道的特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行基因型鑒定[5，16-18].

1.2.3 癥狀觀察

將CTV陽性樣品剝皮后觀察莖陷點(diǎn)癥狀，并參考Garnsey等[2]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)莖陷點(diǎn)癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí).其中，0代表無癥狀，1代表輕微癥狀，2代表中度癥狀，3代表嚴(yán)重癥狀.

1.2.4 指示植物鑒定

選取39個(gè)代表性的CTV陽性樣品，使用墨西哥萊檬、symons甜橙、代代酸橙和琯溪蜜柚作為指示植物進(jìn)行鑒定，接種1年后觀察癥狀.

2 結(jié)果與分析

2.1 CTV檢測(cè)結(jié)果

采集的199份柑橘樣品中，有112份感染了CTV.所調(diào)查的區(qū)縣均有CTV發(fā)生，CTV在各區(qū)縣的發(fā)生率為22.2%～86.0%，平均發(fā)生率為56.3%，其中發(fā)生率最高的地區(qū)為會(huì)昌(86.0%)，其次為章貢(75.0%)，最低是崇義(22.2%)，表明CTV在贛州臍橙果園普遍發(fā)生(表1).

表1 江西贛州臍橙上柑橘衰退病毒檢出率

2.2 基因型鑒定

2019-2020年采集的112份陽性樣品中能檢測(cè)到T36，VT，T3，T68，T30，RB，HA16-5和S1等8個(gè)基因型，其中T36基因型檢出率最高(99.1%)，其次是T3(95.5%)和VT(94.6%)基因型，HA16-5基因型檢出率最低(18.8%).課題組前期保存的贛州CTV樣品中，只能檢測(cè)到T36，VT，T3，T68和S1等5個(gè)基因型.所有樣品中均能檢測(cè)出T3和VT基因型，此外，T68，S1和T36基因型的檢出率分別為33.3%，22.2%和11.1%.相比于2004-2007年采集的樣品，2019-2020年采集的樣品中除了VT與T3基因型外，其余6個(gè)基因型檢出率均有所上升，其中T36和RB基因型增漲最為顯著(表2).

表2 江西贛州臍橙上柑橘衰退病毒基因型種類

2019-2020年采集的112份樣品中均為多基因型混合發(fā)生.以6種基因型混合發(fā)生最為常見，其次為4種基因型混合侵染，分別占總數(shù)的31.3%和26.8%.最常見的基因型組合為T36+VT+T3+T30+S1+RB，有15個(gè)，占總數(shù)的13.4%；其次依次為T36+VT+T3+T68，T36+VT+T3+RB基因型，分別占總數(shù)的9.8%和8.0%.2004-2007年采集的CTV樣品中，也以多基因型混合發(fā)生.其中，以VT+T3+T68和VT+T3基因型混合感染最為常見，均占其總數(shù)的33.3%，其次是VT+T3+S1基因型(22.2%)，T36+VT+T3基因型混合發(fā)生的情況最少(11.1%)(表3).

表3 江西贛州臍橙上柑橘衰退病毒基因型構(gòu)成情況

2.3 癥狀與基因型的相關(guān)性

2004-2007年采集的9份樣品莖陷點(diǎn)癥狀不明顯或癥狀輕微.2019-2020年采集的112份陽性樣品中，有58份樣品無明顯的莖陷點(diǎn)癥狀或癥狀輕微，10份樣品出現(xiàn)中等強(qiáng)度的莖陷點(diǎn)癥狀，其余44份樣品均有嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀.在2019年調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，莖陷點(diǎn)癥狀嚴(yán)重的植株較癥狀輕微的植株，其感染CTV的基因型構(gòu)成更為復(fù)雜.此外，植株感染HA16-5基因型后，多表現(xiàn)出嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀，而一旦檢測(cè)出T30基因型，植株的莖陷點(diǎn)癥狀多為輕微.

2.4 指示植物鑒定

在進(jìn)行指示植物鑒定的39個(gè)CTV毒株中，有34個(gè)CTV毒株在墨西哥萊檬上產(chǎn)生了嚴(yán)重的脈明和莖陷點(diǎn)癥狀，在symons甜橙上表現(xiàn)出嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀，在代代酸橙上沒有觀察到明顯癥狀，在琯溪蜜柚上出現(xiàn)了輕度至中等的莖陷點(diǎn)癥狀.其余5個(gè)CTV毒株只在墨西哥來檬上產(chǎn)生了輕微脈明和莖陷點(diǎn)癥狀.結(jié)果再次表明，贛州紐荷爾臍橙上流行的CTV毒株以甜橙莖陷點(diǎn)毒株為主.

3 討論

近年來，由于我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，優(yōu)質(zhì)無病毒苗木供應(yīng)不足，部分地區(qū)無序繁育、調(diào)運(yùn)苗木，造成多種危險(xiǎn)性柑橘病毒病隨苗木擴(kuò)散，并在部分柑橘產(chǎn)區(qū)的發(fā)生為害日益嚴(yán)重[19].江西贛州作為世界上著名的臍橙產(chǎn)區(qū)之一，截至2019年，臍橙種植面積約11萬hm2，產(chǎn)量125萬t，其主要栽培品種為紐荷爾臍橙.雖然CTV長期以來在贛州分布廣泛，但均未引起嚴(yán)重?fù)p失，但是近年來，莖陷點(diǎn)型衰退病在贛州多地陸續(xù)暴發(fā)，損失嚴(yán)重.因此掌握贛州CTV種群構(gòu)成變化，將有助于闡明莖陷點(diǎn)型衰退病在贛州暴發(fā)的原因.

CTV存在復(fù)雜的株系分化現(xiàn)象，在不同柑橘品種上的癥狀差異較大.前期研究發(fā)現(xiàn)莖陷點(diǎn)癥狀的產(chǎn)生與p33，p13，p18基因的表達(dá)比例有關(guān)[24]，p23基因可誘導(dǎo)酸橙和葡萄柚幼苗出現(xiàn)苗黃癥狀[25-26]，但決定癥狀強(qiáng)弱的關(guān)鍵序列區(qū)域仍不清楚.為快速鑒定不同的CTV類型，國內(nèi)外學(xué)者建立了多種分別基于血清學(xué)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性法(RFLP)、基因型和全序列差異的檢測(cè)方法.其中，基因型檢測(cè)因其具備快捷、且與毒株生物學(xué)性狀符合度較高的特點(diǎn)而被廣泛運(yùn)用.最初根據(jù)5’UTR，ORF1，RdRp區(qū)域的序列差異，將CTV分為了VT，T3，T30和T36等4個(gè)基因型，其中T36與VT基因型通常與速衰癥狀相關(guān)，T3和VT基因型與莖陷點(diǎn)癥狀相關(guān)聯(lián)，而T30基因型通常不引起明顯的癥狀[9-14].隨后又鑒定出RB，HA16-5，S1等多個(gè)基因型[6-8].

本研究結(jié)果顯示，與2004-2007年采集的贛州CTV樣品，以及夏宜林[22]、劉志芳[23]的前期研究結(jié)果相比，2019和2020年采集的樣品中新出現(xiàn)了RB，T30和HA16-5基因型，且T36和RB基因型的檢出率顯著上升.由于RB基因型作為強(qiáng)毒株可以在耐病品種枳上引起嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀，這也許是贛州莖陷點(diǎn)型衰退病近年來發(fā)生嚴(yán)重的原因.本研究還發(fā)現(xiàn)，在引起輕微莖陷點(diǎn)癥狀的CTV毒株中也存在RB基因型.由于本研究分析的靶標(biāo)僅占CTV基因組約3.6%的區(qū)域，且重組是導(dǎo)致CTV變異的重要因素[27]，因此下一步將選取代表性強(qiáng)弱毒株進(jìn)行全序列分析，以期從分子水平上闡明贛州莖陷點(diǎn)型衰退病暴發(fā)的原因.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)紐荷爾臍橙感染HA16-5基因型后，多表現(xiàn)出嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀.前期研究暗示，HA16-5基因型不會(huì)在葡萄柚上引起嚴(yán)重的莖陷點(diǎn)癥狀[14].由于CTV具有寄主專化性的特點(diǎn)，因此還需要進(jìn)一步明確HA16-5基因型對(duì)甜橙、柚、雜柑等中國主要柑橘栽培類型的為害特點(diǎn).

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，江西贛州田間CTV的種群構(gòu)成發(fā)生了改變，2019-2020年在紐荷爾臍橙園采集的CTV毒株的種群構(gòu)成較2004-2007年更為復(fù)雜，強(qiáng)毒株相關(guān)基因型的比例顯著增高，近年來贛州暴發(fā)的莖陷點(diǎn)型衰退病可能與RB和HA16-5基因型的出現(xiàn)有關(guān).

感謝江西省贛州市果業(yè)局果樹植保站站長陳慈相研究員為本研究提供的幫助.