洪瑩　毛建越　趙樹蘭　多立安

摘要：為探討不同濃度氧化石墨烯（GO）對多年生黑麥草生長、生理及光合特征的影響，該文采用盆栽試驗，在土壤中添加0、10、20、30、40、50 mg·g1GO進行多年生黑麥草培養(yǎng)，并測定植物生長指標、光合色素含量、保護酶活性、丙二醛（MDA）含量、葉片質(zhì)膜透性、可溶性蛋白含量和光合參數(shù)。結(jié)果表明：（1）10、20 mg·g1GO處理對多年生黑麥草生長無顯著影響;30～50 mg·g1GO處理對多年生黑麥草生長具有抑制作用，在50 mg·g1 GO濃度下多年生黑麥草株高和生物量均最小，較對照分別降低了16.8%和27.1%。（2）當(dāng)GO濃度達到30 mg·g1時，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量顯著降低，在50 mg·g1 GO處理時達到最低。（3）高濃度的GO處理（40、50 mg·g1）雖降低了多年生黑麥草的葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr），但增加了胞間CO2濃度（Ci）。（4）低濃度的GO處理（10、20 mg·g1）對保護酶活性、丙二醛含量、葉片質(zhì)膜透性和可溶性蛋白含量無顯著影響，而高濃度的GO處理（40、50 mg·g1）使多年生黑麥草的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性、MDA含量和葉片質(zhì)膜透性顯著升高，而可溶性蛋白含量則下降，植物葉片受到損傷。綜上認為，高濃度的GO處理（40、50 mg·g1）會對多年生黑麥草產(chǎn)生氧化脅迫，從而抑制了植物的生長。

關(guān)鍵詞： 多年生黑麥草， 氧化石墨烯， 逆境生理， 氧化脅迫， 光合參數(shù)

中圖分類號：Q945

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2022）05088608

Effects of graphene oxide on stress physiological and

photosynthetic characteristics of Lolium perenne

Abstract：In order to explore the effects of graphene oxide （GO） with different concentrations on the growth， physiological and photosynthetic characteristics of perennial ryegrass （Lolium perenne） seedlings， a pot experiment was conducted by culturing perennial ryegrass in soil with treatments of GO in 0， 10， 20， 30， 40， 50 mg·g1GO respectively. Parameters including plant growth， photosynthetic pigment contents， protective enzyme activity， malondialdehyde （MDA） content， leaf membrane permeability， soluble protein content as well as photosynthetic parameters were measured. The results were as follows： （1） No significant effects were detected on the growth of perennial ryegrass under 10， 20 mg·g1 GO treatments， however， 30-50 mg·g1 GO inhibited the perennial ryegrass growth. Under the 50 mg·g1 GO treatment， plant height and biomass of perennial ryegrass were the minimum in value， which were decreased by 16.8% and 27.1% compared with the control. （2） The contents of total chlorophyll and carotenoid decreased significantly when the concentration of GO reached 30 mg·g1， and the lowest value was found in 50 mg·g1 GO treatment. （3） High concentrations of GO （40， 50 mg·g1） decreased net photosynthetic rate （Pn）， stomatal conductance （Gs） and transpiration rate （Tr）， but increased the intercellular CO2 concentration （Ci）. （4） Low concentrations of GO （10， 20 mg·g1） had no significant effects on protective enzyme activity， MDA content， plasma membrane permeability and soluble protein content， while high concentrations of GO （40， 50 mg·g1） significantly increased superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT） activities， MDA content and plasma membrane permeability， decreased soluble protein content and damaged plant leaves. All the above results indicate that the addition of GO with high concentrations （40， 50 mg·g1） constitutes a stress on the growth of perennial ryegrass， thus inhibited plant growth.0C587D43-4708-4A27-8875-DD0D965A5D18

Key words： perennial ryegrass （Lolium perenne）， graphene oxide （GO）， stress physiology， oxidative stress， photosynthetic parameters

作為石墨烯的一種重要衍生物，氧化石墨烯（GO）含有大量的含氧活性基團，如羧基、羥基與環(huán)氧基團等（Martín et al.， 2019）。由于GO具有良好的熱、電傳導(dǎo)和親水性，因此使其在很多領(lǐng)域都具有應(yīng)用價值（Chen Z et al.， 2020），如在污染物吸附、能源發(fā)展和生物醫(yī)學(xué)等方面。然而，隨著納米新技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料使用量不斷增加，GO等納米材料會直接或間接被排放到環(huán)境中，給生物體和環(huán)境帶來難以預(yù)測的安全隱患（Fadeel et al.， 2018）。

近年來，GO對植物逆境生理及光合特征的影響已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，GO對植物有著正面的積極作用，低劑量可以促進菠菜和韭菜的發(fā)芽和生長（He et al.， 2018）;GO高的比表面積使其具有很強的吸附性，在低濃度下可以降低Cd2+對玉米生長的抑制作用（Yin et al.， 2018）。但是，更多的研究發(fā)現(xiàn)，GO對植物具有負面影響（Chen M et al.， 2018;Du et al.， 2020;Weng et al.， 2020）。GO具有大的比表面積，可使細胞活性氧（ROS）增加，攻擊DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜，導(dǎo)致細胞損傷進而產(chǎn)生毒性（Hu et al.， 2014a;Jia et al.， 2019）;GO具有尖銳的邊緣，通過與細胞的相互碰撞，會造成細胞表面受損（Sengupta et al.， 2019）。Hao等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，濃度為50、500 mg·kg1的還原氧化石墨烯（rGO）均顯著降低了水稻地上部干重。GO對植物的影響隨著其劑量、尺寸、接觸時間和植物種類的不同而不同。由于植物在生態(tài)系統(tǒng)的組成成分中起著主導(dǎo)作用，因此研究GO對植物生長、生理和光合特征影響具有重要意義。

目前，關(guān)于GO對陸生植物影響研究常常采用水培試驗，土培盆栽試驗鮮有報道（Hao et al.， 2018），而后者能夠更好地模擬土壤中輸入GO對植物生長的影響。鑒于此，本研究選擇多年生黑麥草作為試驗植物，將不同濃度GO添加到盆栽土壤中，以探討GO對多年生黑麥草生長和生理光合特性的影響，以期為GO的風(fēng)險評價及安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

多年生黑麥草種子購自宿遷卉藝種業(yè)有限公司，品種名為愛森特（Accent）。試驗用土壤為天津師范大學(xué)校園內(nèi)0～20 cm的表層土壤。其基本性質(zhì)如下：pH 7.45，含鹽量0.1%，有機質(zhì)含量4.68%，堿解氮137.42 mg·kg1，速效鉀71.63 mg·kg1，有效磷22.03 mg·kg1，飽和含水量0.56 mL·g1，容重0.87 g·cm3。GO購自蘇州恒球石墨烯科技有限公司，為褐黃色粉末，平均厚度為3.4～7 nm，片層直徑為10～50 μm，比表面積為100～300 m2·g1。

1.2 植物培養(yǎng)

植物培養(yǎng)于2019年7月1日進行，將多年生黑麥草種子放于鋪有蒸餾水潤濕托盤中，于室溫下進行催芽處理，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到添加不同GO濃度的土壤中進行培養(yǎng)，每盆播種100粒。

首先，將一定量的GO（4.2、8.4、12.6、16.8、21 g）分別加入到420 g未滅菌處理的土壤中，用小抹刀充分混合均勻20 min;然后，裝入塑料花盆（直徑7 cm、高8 cm）中，得到濃度分別為10、20、30、40、50 mg·g1GO處理，以不添加GO（0 mg·g1）為對照，每個處理4次重復(fù)。植物在室內(nèi)培養(yǎng)，期間保證水分供應(yīng)，使土壤含水量保持在最大持水量的60%。光照為透入室內(nèi)的自然光（623～33 020 lx）。在培養(yǎng)過程中，定期調(diào)換花盆位置，以確保每個花盆處于一致的光照條件下。培養(yǎng)期間的環(huán)境溫度為20～27 ℃，相對濕度為17%～54%;培養(yǎng)時間40 d，在多年生黑麥草的分蘗期進行指標測定。

1.3 指標測定

1.3.1 生長指標的測定株高的測定，即播種40 d測量多年生黑麥草株高，從盆中隨機選取5株植株，取其平均值。地上生物量的測定，即在播種40 d時，將多年生黑麥草地上部分齊地面刈割，于108 ℃下殺青20 min，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱重。

1.3.2 葉綠素與類胡蘿卜素含量的測定取0.2 g新鮮葉片，剪成1～2 mm碎片，浸泡于20 mL丙酮、乙醇體積比為1∶1的提取溶液中，避光浸提24 h，至葉片完全脫色。將1 mL浸提液與4 mL提取液稀釋后，在波長663、645、470 nm下測量吸光度，并計算葉綠素與類胡蘿卜素含量。

1.3.3 保護酶活性和丙二醛含量的測定酶提取液的制備，即取0.5 g新鮮葉片，加入3 mL提取液（由pH 7.0、50 mmol·L1磷酸緩沖液和1 mmol·L1EDTA配制而成）和石英砂，研磨完全后將研磨液倒入離心管中，在4 ℃，10 000 r·min1下離心20 min。取上清液并放置在4 ℃冰箱中，待測。過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定（Omran et al.， 1980）;過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定（Singh et al.， 2010）;超氧化物歧化酶（SOD）活性采用比色法測定（Wang et al.， 2014）;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定（Sundar et al.， 2004）。

1.3.4 葉片質(zhì)膜透性和可溶性蛋白含量測定葉片質(zhì)膜透性采用相對電導(dǎo)率法測定（Guo et al.， 2019）。稱取0.2 g葉片，剪碎后置于10 mL去離子水的試管中，室溫下浸泡12 h，用電導(dǎo)率儀測定浸提液電導(dǎo)率（R1）。然后沸水浴30 min，冷卻至室溫后搖勻，測定浸提液電導(dǎo)率（R2）。按下式計算相對電導(dǎo)率（REC，%）：0C587D43-4708-4A27-8875-DD0D965A5D18

REC（%）=R1/R2×100。

可溶性蛋白的測量采用考馬斯亮藍法（Zou et al.， 2020） 。將0.2 g新鮮葉片放入有2 mL蒸餾水的研缽中，研磨成勻漿后，將其置于離心管中，放置0.5～1.0 h充分提取，在4 000 r·min1條件下離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL刻度試管中，并用蒸餾水定容，為待測樣品的提取液。吸取1 mL提取液放入10 mL試管中，再加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，充分混合，靜置后在波長595 nm下測定吸光值，并計算蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 光合參數(shù)的測定光合參數(shù)的測定于播種后的35 d進行。9：00—11：30用LI6400便攜式光合作用系統(tǒng)（LI6400XT，Lincoln，Nebraska）對第二片完全展開的葉子（從上到下）進行測量。主要參數(shù)包括凈光合速率（Pn，μmol CO2· m2·s1），氣孔導(dǎo)度（Gs，μmol H2O· m2·s1），蒸騰速率（Tr，mmol H2O·m1·s1）和胞間CO2濃度（Ci，μmol CO2·s1）。光照設(shè)定為1 000 μmol·m2·s1，溫度為28～30 ℃，CO2濃度為360 μmol·mol1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析不同GO濃度處理間的差異，并采用Tukey法，在P=0.05水平進行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化石墨烯對多年生黑麥草株高和生物量的影響

GO對多年生黑麥草株高和生物量的影響如圖1所示。從圖1可以看出，生長40 d時，10 mg·g1 GO處理株高為最大值，且與對照差異不顯著（P>0.05）;GO濃度大于10 mg·g1時，株高隨GO濃度的增大呈下降趨勢;濃度超過30 mg·g1時，株高則顯著低于對照組（P<0.05），50 mg·g1 GO處理株高為最低。與株高的結(jié)果相類似，10、20 mg·g1GO處理對生物量的影響不大，但GO濃度達到30 mg·g1時，則顯著抑制了生物量的積累（P<0.05），且抑制作用隨GO濃度增大而增加。

2.2 氧化石墨烯對多年生黑麥草葉綠素與類胡蘿卜素含量的影響

如表1所示，10 mg·g1 GO處理多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素與類胡蘿卜素含量

為最高，且與對照差異不顯著（P>0.05）。GO濃度超過20 mg·g1時，葉綠素b、總?cè)~綠素與類胡蘿卜素含量均顯著低于對照組（P<0.05）;濃度超過30 mg·g1時，葉綠素a含量顯著低于對照組（P<0.05）;之后，隨著GO濃度的增大，葉綠素與類胡蘿卜素的含量呈顯著下降趨勢。

2.3 氧化石墨烯對多年生黑麥草保護酶活性和MDA含量的影響

GO對多年生黑麥草保護酶活性和MDA含量有顯著影響。從圖2可以看出，與對照相比，10、20 mg·g1 GO處理對POD活性無顯著影響（P>0.05），隨著GO濃度增加表現(xiàn)出升高趨勢;濃度超過20 mg·g1的處理，POD活性顯著高于對照組（P<0.05）;50 mg·g1 GO處理組POD活性最大，較對照增加45.59%。10 mg·g1 GO處理，SOD活性較對照組無明顯差異（P>0.05），GO濃度超過10 mg·g1的處理，SOD活性均顯著高于對照（P<0.05）。CAT活性隨著GO濃度的增加表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，除10 mg·g1處理與對照差異不顯著（P>0.05）外，其他GO處理CAT活性均顯著高于對照（P<0.05），在30 mg·g1GO處理下CAT活性最大，較對照增加了90.72%。

與對照相比，10、20 mg·g1 GO處理沒有顯著增加MDA含量（P>0.05），但GO濃度達到30 mg·g1時，MDA含量顯著增加（P<0.05），在50 mg·g1處理達到最大，較對照增加了37.33%。

2.4 氧化石墨烯對多年生黑麥草葉片質(zhì)膜透性和可溶性蛋白含量的影響

GO對多年生黑麥草葉片質(zhì)膜透性和可溶性蛋白含量的影響如圖3所示。從圖3可以看出，10、20 mg·g1 GO處理多年生黑麥草葉片相對電導(dǎo)率與對照均無明顯差異（P>0.05），隨著氧化石墨烯濃度的增加表現(xiàn)出升高趨勢;超過20 mg·g1的GO處理顯著高于對照組（P<0.05），50 mg·g1處理葉片質(zhì)膜透性最大，較對照增加了28.49%。

多年生黑麥草可溶性蛋白含量隨著GO濃度的增加表現(xiàn)出降低趨勢，大于20 mg·g1的GO處理顯著低于對照（P<0.05）;50 mg·g1 GO處理最小，與對照相比，降低了16.23%。

2.5 氧化石墨烯對多年生黑麥草光合參數(shù)的影響

如表2所示，10 mg·g1 GO處理組多年生黑麥草的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率均為最大值，胞間二氧化碳濃度為最小值，但與對照組沒有顯著性差異（P>0.05）。與對照相比，GO濃度高于20 mg·g1時，氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率受到抑制;濃度高于30 mg·g1時，多年生黑麥草凈光合速率受到明顯抑制（P<0.05），胞間二氧化碳濃度顯著增加（P<0.05）。

3討論與結(jié)論

植物株高與生物量是反映植物地上生長狀況的重要指標。本研究中，10、20 mg·g1 GO對多年生黑麥草的株高與生物量沒有顯著影響;GO濃度高于30 mg·g1時，株高與生物量受到顯著抑制，且隨著GO濃度增大抑制作用增加。Begum等（2011）發(fā)現(xiàn)，500～2 000 mg·L1的石墨烯對甘藍（Brassica oleracea ）、番茄（Solanum lycopersicum）和紅菠菜（Senecio fuluipes）的幼苗苗長、苗重和葉面積均有明顯的抑制作用，且隨著石墨烯劑量的增加抑制作用更加顯著。Chen LY等 （2018）的研究表明低濃度GO （0.04 g·L1）下裸燕麥 （Avena sativa）0C587D43-4708-4A27-8875-DD0D965A5D18

地上部分干重較對照增加，而在高濃度GO（0.2 g·L1）時則顯著減少，與本研究結(jié)果相一致。可能的原因是GO能夠進入或附著于植物細胞，阻礙植物細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收而抑制其生長;此外，GO還會影響植物代謝途徑，從而導(dǎo)致生物產(chǎn)量的降低（Hu et al.， 2014b）。

葉綠素是植物光合作用中的主要色素，其含量可以反映植物光合作用的強弱與生長情況（Zhang et al.， 2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，GO濃度達到30 mg·g1時，多年生黑麥草葉綠素及類胡蘿卜素的含量均顯著下降。Gao等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，濃度大于20 mg·L1的GO明顯降低小麥（Triticum aestivum）葉綠素含量;Hu等（2014b）研究發(fā)現(xiàn)，GO能在小麥細胞內(nèi)積累，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，可以推測GO在黑麥草細胞內(nèi)積累，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素的合成，從而導(dǎo)致其含量降低。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除生物體內(nèi)O2-自由基。本研究中，GO處理使多年生黑麥草SOD活性增加，它的誘導(dǎo)說明植物體內(nèi)產(chǎn)生了大量活性氧;GO處理使POD和CAT的活性有所增加，它們能夠有效清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2。MDA含量可間接反映植物細胞膜脂過氧化程度，其含量越高，表明膜透性越大，膜脂過氧化程度越高（Chen HH et al.， 2020）。相對電導(dǎo)率既可反映細胞外滲物質(zhì)的多少，也可作為膜受損程度的辨別指標（Guo et al.， 2019）。本研究中，GO處理MDA含量和相對電導(dǎo)率升高，表明多年生黑麥草受到了氧化脅迫。Chen等（2017）利用13C標記GO處理小麥發(fā)現(xiàn)，小麥CAT、POD酶活性升高，MDA含量增加。Vochita等（2019）的研究發(fā)現(xiàn)，500～2 000 mg·L1 GO處理小麥時，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)，500 mg·L1 GO濃度時SOD、POD、CAT的活性達到最大值，對小麥產(chǎn)生氧化脅迫;在1 000、2 000 mg·L1 GO濃度，抑制了酶活性，加劇氧化損傷。因為GO的主要毒性機制是通過產(chǎn)生大量的ROS而誘導(dǎo)氧化脅迫，所以當(dāng)抗氧化酶不足以清除ROS時，就會攻擊DNA、蛋白質(zhì)和細胞膜，促使膜質(zhì)過氧化、MDA含量增加，最終導(dǎo)致細胞死亡（Tan et al.，2009;胡俊杰等，2017）。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，在植物代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用。本研究結(jié)果表明，濃度大于30 mg·g1GO處理可溶性蛋白含量顯著降低，袁剛強等（2015）的研究也發(fā)現(xiàn)，水稻（Oryza sativa）可溶性蛋白含量隨單壁碳納米管劑量的增加而下降?？赡艿脑蚴荊O阻礙了多年生黑麥草根系對礦質(zhì)離子的吸收，蛋白質(zhì)合成缺少所需的元素P、S、Fe等（黃溦溦等，2012）。

光合作用將CO2轉(zhuǎn)變成有機物積累在植物體內(nèi)，是植物生長發(fā)育的重要生理過程（范七君等，2020）。本研究中，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度與葉綠素的變化趨勢基本一致，GO濃度大于30 mg·g1時，植物氣孔導(dǎo)度顯著減小，蒸騰速率和凈光合速率顯著降低。Zhang等（2016）的研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯降低了小麥的葉綠素含量，同時抑制光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）活性。Chen等（2019）發(fā)現(xiàn)，積累在豌豆（Pisum sativum）根部的還原GO轉(zhuǎn)移到葉片，由于產(chǎn)生氧化脅迫，因此破壞供體側(cè)的含氧復(fù)合物而直接抑制PS Ⅱ的活性。凈光合速率的下降說明GO阻礙了CO2的固定，生物量減少;蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度降低表明水分和其他物質(zhì)的傳輸受到影響（Chen LY et al.， 2018）。高濃度GO處理下多年生黑麥草葉綠素含量減少、凈光合速率降低和生物量減少相一致，說明GO對幼苗生長產(chǎn)生脅迫，使葉綠素合成受阻，影響植物光合作用，進而抑制植物生長。

綜上所述，低濃度的GO對多年生黑麥草的生長、光合、保護酶活性、MDA含量、葉片質(zhì)膜透性和可溶性蛋白含量沒有顯著影響，40、50 mg·g1GO處理使保護酶活性、MDA含量和葉片質(zhì)膜透性升高，而可溶性蛋白含量卻下降，從而對多年生黑麥草產(chǎn)生氧化脅迫，使植物葉片受到損傷。因此，植物可以通過提高保護酶活性，來抵御GO的脅迫。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛）

收稿日期：2021-02-03

基金項目：國家自然科學(xué)基金（31870484） [Supported by National Natural Science Foundation of China （31870484） ]。

第一作者： 洪瑩（1995-），碩士研究生，主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究，（Email）904673307@qq.com。

通信作者：多立安，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究，（Email）duolian_tjnu@163.com。0C587D43-4708-4A27-8875-DD0D965A5D18