淺談非洲豬瘟病毒基因

章燕紅，龔志成，周波，張其彬，蔣兵

摘要：非洲豬瘟病毒（ASFV）具有雙鏈、線性的DNA基因組，基因可多達(dá)200多個(gè)。雖然ASFV基因組整體突變率很低，但是ASFV的可變區(qū)基因和基因間區(qū)域不僅可能發(fā)生多個(gè)單核苷酸變化，部分基因可能發(fā)生基因重組、基因缺失、基因復(fù)制、序列分化等，表現(xiàn)為基因多樣性。本文就ASFV基因組、主要基因等進(jìn)行綜述，以期為科學(xué)防控非洲豬瘟提供參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒;基因組;基因;多樣性

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科的DNA病毒，病毒顆粒較大，直徑為200～300nm，有囊膜，呈二十面體，具有五層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外依次為基因組、內(nèi)核心殼、內(nèi)囊膜、衣殼、外囊膜[1，2]。根據(jù)衣殼蛋白（p72）編碼基因B646L序列的差異，可將ASFV分為24種基因型，不同基因型ASFV交叉保護(hù)率低，且基因組大小差異較大[1]。

1 基因組

基因組（genome）是指一個(gè)生命單元（細(xì)胞或病毒等）所擁有的全部遺傳物質(zhì)（包括核內(nèi)和核外遺傳信息），其本質(zhì)是DNA或RNA。各種生物體基因組大小、所包含的基因數(shù)和種類有所不同。病毒基因組可看作游離的基因，變化較大，可能是單鏈或雙鏈，線狀或環(huán)狀，有些病毒基因可相互重疊，而ASFV的基因組是雙鏈、線性的DNA基因組[3]。根據(jù)NCBI（National Center for Biotech

-nology Information）公布的ASFV基因組數(shù)據(jù)顯示，ASFV基因組長度為169.931～193.886kb，最小的是2019年在越南河內(nèi)市分離的毒株ASFV/Hanoi/2019，長度為169.931kb，最大的是1950年在肯尼亞分離的毒株ASFV/Kenya/1950，長度為193.886kb，大部分毒株基因組長度在189.37kb左右。

ASFV基因組大致可分為中央保守區(qū)、左右兩側(cè)可變區(qū)，以及末端發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（包含反向重復(fù)序列）[3]。在繁殖過程中，ASFV基因組兩端的可變區(qū)基因（特別是可變區(qū)的多基因家族）序列容易出現(xiàn)丟失或變異，造成不同毒株或同一毒株不同代次的基因組呈現(xiàn)的多樣性[2，4]。于婷婷等[5]對NCBI公布的ASFV全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，并結(jié)合區(qū)域分布、傳染信息使用MAFFT、MEGAR軟件進(jìn)行ASFV全基因組序列系統(tǒng)生物學(xué)分析，篩選出35株ASFV全基因組并成功構(gòu)建進(jìn)化樹，分析表明基因型Ⅷ型可能為最早的原始株，其他基因型可能是由基因型Ⅷ型突變衍生出，基因型Ⅰ型與Ⅳ型被劃分在同一分支中，表明二者在全基因組上相近，基因型Ⅳ型可能是由Ⅰ型突變或重組得到，基因型Ⅱ型與部分Ⅰ型、Ⅸ型分在同一分支，可能是部分Ⅰ型與Ⅸ型重組得到，分支最遠(yuǎn)的兩個(gè)基因型是基因型Ⅱ型與Ⅷ型，基因組Ⅷ型與基因型Ⅱ型相比存在很多缺失、差異片段，主要缺失片段為V110、MGF360、MGF505/530，而基因型Ⅱ型MGF505/530-7R、MGF360-1L出現(xiàn)的重復(fù)片段可能是早期基因型出現(xiàn)重組的結(jié)果。

2 基因

基因（gene）是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，1909年約翰森（W.L.Johannsen）最早提出基因這個(gè)名詞。病毒通常只有幾個(gè)至幾十個(gè)基因，而ASFV的大部分毒株基因多達(dá)200多個(gè)。據(jù)NCBI公布數(shù)據(jù)顯示基因組最小毒株ASFV/Hanoi/2019（169.931kb），含有140個(gè)基因，而2016年在烏克蘭基輔分離毒株ASFV/Kyiv/2016/131（191.911kb），基因多達(dá)246個(gè)。

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因

ASFV可編碼50種以上結(jié)構(gòu)蛋白，按位置可將結(jié)構(gòu)蛋白劃分為內(nèi)核心殼蛋白、內(nèi)囊膜蛋白、衣殼蛋白、外囊膜蛋白，其中核心殼蛋白中親和結(jié)構(gòu)蛋白P10編碼基因是pk78R，多聚蛋白前體pp220、pp62編碼基因分別是CP2475L、CP530R;內(nèi)囊膜蛋白P17、P30、P54編碼基因分別是E248R、CP204L、E183L;衣殼蛋白P72、M1249L、P49編碼基因分別是B646L、M1249L、B438L;外囊膜蛋白CD2v、P24、P12編碼基因分別是Ep402R、KP177R、O61R[3]。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因

ASFV可編碼100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，主要包括與病毒復(fù)制、病毒毒力、免疫逃逸相關(guān)蛋白，其中為ASFV復(fù)制提供能量蛋白pK196R、dUTPase（pE165R）、pA240L編碼基因的是K196R、E165R、A240L;參與病毒DNA復(fù)制和修復(fù)的蛋白TopoⅡ（pP1192R）、DNA polX（pO174L）、AP endonuclease（pE296R）、DNA ligase（pNP419L）編碼基因分別是P1192R（i7R）、O174L、E296R、NP419L（g3L）;啟動(dòng)ASFV基因轉(zhuǎn)錄的pC315R編碼基因是C315R;參與ASFV基因轉(zhuǎn)錄的pNP145L、pH359L、pD205R、pC147L、pD339L、pCP80R 等蛋白編碼基因分別是NP145L、H359L、D205R、C147L、D339L、CP80R;解旋酶蛋白

pA859L、pF105L、pB92L、pD133L（g10L）、pQ706L（j10L）、pQP509L（j11L）編碼基因分別是A859L、F105L、B92L、D133L、Q706L、QP509L;ASFV主要毒力蛋白pDP148R、pI177L、9GL（pB119L）、UK和pDP71L編碼基因分別是DP148R、I177L、9GL（B119L）、UK（DP96R）和DP71L[6]。此外，MGF360、MGF505等多個(gè)多基因家族基因也與毒力相關(guān)。pA238L可抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、T細(xì)胞核因子（Nuclear factor of activated T cells，NFAT）和其他因子調(diào)控的宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，其編碼基因A238L作為免疫逃逸基因，缺失該基因的疫苗接種豬無明顯不良反應(yīng)，但不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力[6]。參與病毒感染細(xì)胞后誘導(dǎo)的血細(xì)胞吸附過程C型凝集素樣蛋白（C-type lectin）編碼基因?yàn)镋P153R，而與紅細(xì)胞吸附特性相關(guān)基因包括EP153R、Ep402R[4]。

2.3 多基因家族

多基因家族（Multigene families，MGF）位于ASFV基因組可變區(qū)，具有相似的序列特征，主要包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505、MGF530，MGF基因中后面的數(shù)值表示其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸平均數(shù)量，如MGF360可編碼氨基酸的平均數(shù)量為360個(gè)[6，7]。MGF110除KIR69毒株完全缺失，其余毒株中均有發(fā)現(xiàn);MGF110在Malawi LIL20/1毒株基因組右側(cè)，其余均位于左側(cè)，MGF110家族包括14個(gè)同源基因，其同源基因在BA71V毒株中含有5個(gè)、在LIS57毒株中含有12個(gè)、在BA60毒株中含有12個(gè)、在LIS60毒株中含有5個(gè)、在ASFV Vero細(xì)胞適應(yīng)株L60含有3個(gè);MGF110編碼的蛋白具有一個(gè)共同結(jié)構(gòu)，即1個(gè)顯著保守的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，并存在高度疏水的NH2-末端序列;MGF100是在分離株LIS57基因組左側(cè)中發(fā)現(xiàn)的;MGF300、MGF530均是在對Malawi LIL20/1毒株基因組測序中發(fā)現(xiàn)的，在Malawi LIL20/1毒株他們的同源基因數(shù)分別是3個(gè)、6個(gè);MGF530有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域和4個(gè)保守的半胱氨酸殘基;MGF360基因拷貝數(shù)最多，變異性最大，共包含22個(gè)同源基因;另外，Georgia2007/1基因組最左邊（MGF360-1L基因）和最右邊（MGF360-21R基因）相似度最高，同源性達(dá)69%，可能是基因轉(zhuǎn)座從基因組一端復(fù)制到另一端的;MGF505在BA71V毒株基因組中有7個(gè)同源且串聯(lián)排列的基因，在ASFV感染過程中均表達(dá)，且多肽的氨基酸末端發(fā)現(xiàn)了3個(gè)顯著保守區(qū)域[7]。

MGF與ASFV噬性、毒力等相關(guān)，MS16和BA71V毒株由于MGF360和MGF530的區(qū)域明顯缺失，均不能在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制;且缺失MGF360、MGF505的特定成員可以使有毒力的野外分離株完全減毒;刪除或中斷MGF360、MGF530、MGF505基因?qū)е聫?qiáng)毒力的Benin97/1毒株毒性減弱并誘導(dǎo)高水平的保護(hù)，并能抵抗強(qiáng)毒親本病毒攻擊;缺失MGF360-3HL、311和3LL可以使ASFV在蜱體內(nèi)生長顯著減慢[7]。

3 基因多樣性的原因

DNA作為遺傳物質(zhì)，具有保守性、變異性和流動(dòng)性。與其他病毒相比，ASFV基因組整體突變率很低，但是ASFV的可變區(qū)基因和基因間區(qū)域不僅可能發(fā)生多個(gè)單核苷酸變化，部分基因（特別是MGF）可能發(fā)生基因重組、基因缺失、基因復(fù)制、序列分化等，表現(xiàn)為基因多樣性[2，4]。ASFV基因多樣性主要同ASFV的DNA聚合酶（AsfvPolX）和DNA連接酶AsfvLIG的保真率低有關(guān)，AsfvPolX是已知最小的DNA聚合酶，缺少同源蛋白中保守的拇指結(jié)構(gòu)域和8kD結(jié)構(gòu)域，AsfvPolX催化ASFV病毒基因組DNA修復(fù)過程中的空隙填充反應(yīng)，具有高度的錯(cuò)誤傾向，而AsfvLIG是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的DNA連接酶之一，由419個(gè)氨基酸組成，與其他DNA連接酶的DNA結(jié)合域（DBD）的結(jié)構(gòu)域沒有相似之處，是最容易出錯(cuò)的連接酶之一[2，6]。此外，DNA重組是病毒遺傳變異的重要來源，增加了基因和基因組的多樣性，有研究者從42個(gè)ASFV對齊基因組中發(fā)現(xiàn)了152個(gè)重組事件的可靠證據(jù)，以及系統(tǒng)發(fā)育重建表明在MGF、E183L、B602L、EP153和EP402R基因中均有發(fā)生基因重組[2]。

4 基因與疫苗研究

基因缺失疫苗是目前ASFV疫苗研究的熱點(diǎn)，張艷艷等[8]通過基因工程方法在ASFV流行株SY18株構(gòu)建CD2v、MGF單基因和雙基因缺失株，缺失CD2v單基因毒株毒力無致弱，缺失MGF單基因毒株毒力顯著降低，缺失CD2v、MGF雙基因毒株的不僅具有很好的安全性，而且具有良好的攻毒保護(hù)效果，可作為良好的疫苗候選株。此外，流行毒株Georgia2007/1敲除9GL和MGF360/505基因后毒力減弱，但保護(hù)效果不理想，而9GL和UK基因缺失時(shí)，具有很好的免疫原性，能有效抵抗同源強(qiáng)毒株的感染，并對不同基因型強(qiáng)毒株有一定的交叉保護(hù)效果[9]。

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