周相男，胡凱文，李志明，高 磊，周 天

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院腫瘤科，北京 100078）

肺癌是全球最常見的癌癥和死亡率最高的惡性腫瘤，2018 年GLOBOCAN 估算，肺癌新增209萬病例，占癌癥病例總數(shù)的11.6%，死亡病例新增176 萬，占比18.4%。中國肺癌發(fā)病比例和死亡比例分別占全球病例的36.98%和39.21%，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，總體5 年生存率約為19.7%，中位生存時間不超過2 年，嚴重危害人類健康［1，2］。肺癌傳統(tǒng)治療模式主要有手術、放療或化療等，但由于確診時70%處于晚期［3］，加之放化療不良反應等不足，使很多病人失去治療機會，因此，亟需為年老體弱、中晚期及常規(guī)療法失敗的患者提供新的治療策略。

惡性腫瘤是一種以局部病變?yōu)樘卣鞯娜砑膊。[瘤“體為陰，用為陽”，具有生命屬性，易耗血奪氣，使機體全身與局部不平衡，出現(xiàn)整體多虛多寒、局部多實多熱的表現(xiàn)［4］。醒消丸出自清代王維德《外科證治全生集》，全方由雄黃、麝香、乳香、沒藥組成，功擅消腫散結、活血止痛，具有促進機體代謝、調(diào)和機體氣血陰陽功效，與綠色治療模式中第三階段“帝道”的調(diào)整體質理念相契合［5］。臨床研究表明，雄黃敗毒抗癌，配伍干漆有效治療肺部之癌瘤積聚［6］，六神丸（含麝香與雄黃）有效改善惡性腫瘤患者臨床癥狀［7］，西黃丸（含麝香、乳香、沒藥）可顯著提高臨床獲益率，穩(wěn)定病情，提高生活質量［8］。

臨床中發(fā)現(xiàn)，醒消丸憑借雄黃溫熱之性，有助于改善肺癌患者怕冷、便秘等癥狀，提高患者生活質量。然而，目前尚缺乏醫(yī)學證據(jù)支持，因此本文擬通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接，預測醒消丸治療肺癌的靶點及通路，填補其分子機制層面的研究，從而為后續(xù)基礎實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 醒消丸有效成分收集及潛在靶點篩選

雄黃屬于礦石藥，查閱中醫(yī)數(shù)據(jù)庫平臺，尚無雄黃的有效成分及靶點，查閱文獻其有效成分為As2S2和As4S4［9，10］，根 據(jù)SwissADME 和SwissTar‐getPrediction 預測無法得到有效靶點，靶點預測工具或平臺尚待開發(fā)，因此，本文擬進行麝香、乳香和沒藥的相關研究，初步對醒消丸治療肺癌的靶點進行 預 測 和 分 析。BATMAN‐TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman‐tcm）［11］是中藥分子機制的在線分析平臺，本文通過BATMAN‐TCM 平臺獲得醒消丸 化 合 物 成 分。 PubChem 數(shù) 據(jù) 庫（https：//pub‐chem.ncbi.nlm.nih.gov/）是NCBI 旗下有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫，包括結構、活性、來源及實驗等多種數(shù)據(jù)［12］，通過PubChem 分別查找麝香、乳香、沒藥各成分的化學結構式，并經(jīng)SwissADME（www.SwissADME.ch）［13］篩選獲取有效成分，運用SwissTar‐getPrediction（www.SwissTargetPrediction.ch）［14］預測各有效成分的靶點，整合為EXCEL 文件。篩選結束后，以“reviewed”“homo sapiens”為條件，運用Uni‐prot 蛋 白 質 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org）［15，16］對潛在靶點進行篩選，并統(tǒng)一將蛋白質靶點信息標準化，命名為gene symbol。

1.2 肺癌相關靶點篩選

以“l(fā)ung cancer”為關鍵詞，尋找OMIM 數(shù)據(jù)庫（OMIM‐Gene‐Map‐Retrieval）（https：//www.omim.org）［17］、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http：//bidd. nus. edu. sg/group/cjttd）［18］、DRUGBANK 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www. drugbank.ca）［19］中 肺 癌 的 潛 在 靶 點，并 挖 掘GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）相關靶點，合并4 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復值得到肺癌蛋白質靶點。

1.3 醒消丸‐肺癌交集靶點PPI 網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

利用Venn 工具將麝香、乳香、沒藥3 藥與肺癌靶點取交集并繪制韋恩圖。進而將交集靶點提交至Sting 平臺，構建交集靶點PPI 網(wǎng)絡。運用Biso‐Genet3.0 插件，分別構建醒消丸與肺癌靶點PPI 網(wǎng)絡的Merged 網(wǎng)絡，根據(jù)連接度（Degree）、介度（Be‐tweenness Centrality，BC）、緊密度（Closeness Cen‐trality，CC）、平均連接度（Local Average Connectivi‐ty，LAC）［20］4 個屬性值進行中位數(shù)篩選，得到核心靶點。

1.4 醒消丸‐肺癌靶點功能與通路的富集分析

Metascape 數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/）［21］是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，提供全面的基因列表注釋及分析資源，主要用于差異基因的功能和通路富集分析。在線登錄Metascape 平臺，導入交集靶點，對其主要的生物學過程與代謝通路進行富集分析，并用Hiplot 在線網(wǎng)站繪制靶點生物過程（GO Biological Processes，GO BP）、靶點所在細胞組分（GO Cellu‐lar Components，GO CC）、靶點分子功能（GO Mo‐lecular Functions，GO MF）及靶點信號通路（KEGG Pathway）圖［22］。

1.5 醒消丸有效成分‐靶點‐通路網(wǎng)絡圖構建

Cytoscape3.7.2 是一款圖形化顯示網(wǎng)絡并進行分析和編輯的軟件，通過將麝香、乳香、沒藥的活性成分及其治療肺癌靶點、信號通路等數(shù)據(jù)整合，導入軟件，構建網(wǎng)絡圖，進行可視化分析。

1.6 分子對接驗證

PDB 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.rcsb.org/）［23］是一種蛋白質晶體結構數(shù)據(jù)庫，提供蛋白靶點的晶體復合物結構信息。PyMOL 軟件是一款分子可視化軟件，用于查看蛋白三維結構，分離蛋白和小分子。 Open Babel GUI 軟件用來轉換格式。AutoDock4.2.6 用于預測配體和生物大分子靶標之間相互作用，包含AutoGrid 和AutoDock 兩個程序，AutoDock Tools1.5.6 是將分子在結構圖形化、可視化對接的輔助軟件。通過Autodock Tools 將麝香、乳香、沒藥的核心成分和靶點進行對接并驗證。

2 結果

2.1 獲取麝香、乳香、沒藥活性成分及潛在靶點

在BATMAN‐TCM 平臺“ Cluster name”中，分別 輸 入“ SHE XIANG”、“RU XIANG”和“MO YAO”，并將“ Score cutoff”值設置為20，P值調(diào)整為0.05 以獲得麝香、乳香、沒藥的化合物成分，其中，麝香、乳香和沒藥的成分分別有30、19、15 種，統(tǒng)一以“SX1～SX30，RX1～RX19，MY1～MY15”簡稱，如表1 所示，其中，部分化合物尚無統(tǒng)一標準名稱及屬性值，故未標注。通過PubChem 獲得麝香、乳香、沒藥化合物的化學結構式，導入SwissADME 平臺篩選，符合“胃腸吸收度”為“high”，以及“類藥性”的五個過濾器屬性值中有兩項或以上為“yes”的通過篩選，結果獲取麝香有效化學成分20 種、乳香有效化學成分8 種、沒藥有效化學成分13 種，見表1。通過SwissTargetPrediction 預測各有效成分的靶點，設置“probability>0”的為有效靶點，并整合為EXCEL文件。其中，麝香有效成分作用靶點769 個、乳香273 個、沒藥469 個，合并成分靶點，刪除重復值，并經(jīng)UniProt 篩選后得到121 個靶點。

表1 醒消丸有效成分及SwissADME 屬性值Tab 1 Active ingredients and SwissADME attribute values of Xingxiao Pill

2.2 篩選肺癌相關靶點

從GeneCards 篩選疾病相關靶點，并設定Score大于中位數(shù)的目標靶點為疾病潛在靶點，根據(jù)肺癌相關靶點，取中位數(shù)為16.855，得到1 449 個靶點，并結合OMIM（OMIM‐Gene‐Map‐Retrieval）、DRUG‐BANK、TTD 數(shù)據(jù)庫，合并所有肺癌靶點后刪除重復值得到1 914 個相關靶點。

2.3 構建醒消丸‐肺癌交集靶點PPI 網(wǎng)絡并篩選核心靶點

運用Venn 為肺癌相關靶點與醒消丸的活性成分靶點取交集，得到交集靶點50 個，見圖1。String平臺構建交集靶點PPI 網(wǎng)絡，見圖2，圖中節(jié)點大小和顏色、連線粗細和顏色反映了靶點之間相互關聯(lián)，節(jié)點越大，顏色越亮，節(jié)點之間連線越粗、顏色越暗，代表此靶點連接越關鍵。交集靶點及所屬成分見表2。應用BisoGne3.0 分別得到醒消丸成分靶點與肺癌靶點的PPI 網(wǎng)絡，二者融合得到Merged 網(wǎng)絡，根據(jù)Degree 篩選2 倍中位數(shù)后，提取Hithubs 核心網(wǎng)絡，并根據(jù)Degree、BC、CC、LAC 等參數(shù)進行中位數(shù)篩選，得到核心網(wǎng)絡，見圖3，獲取核心靶點18 個，選取與肺癌機制相關且有較多文獻支持的8個靶點用來后續(xù)預測與研究，具體見表3。

表2 交集靶點對應醒消丸成分Tab 2 The intersection targets corresponding to the composition of Xingxiao Pill

表3 醒消丸治療肺癌的核心靶點Tab 3 Core targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

圖1 醒消丸治療肺癌交集靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of intersection targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

圖2 醒消丸治療肺癌交集靶點PPI 網(wǎng)絡圖Fig 2 PPI network diagram of intersection targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

圖3 醒消丸治療肺癌核心靶點的篩選流程圖Fig 3 Screening flowchart of core targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

2.4 靶點生物學功能與通路的富集分析

將麝香、乳香、沒藥與肺癌交集靶點提交至Metascape 平臺，進行富集、聚類分析，并對結果進行可視化。靶點信號通路結果顯示醒消丸治療肺癌的核心靶點在細胞中主要涉及EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、PI3K‐Akt、蛋白聚糖、MAPK、細胞周期、Th17 細胞分化、轉錄失調(diào)、MicroRNA、MTOR、非小細胞肺癌、中心碳代謝等信號通路，見表4 和圖4。GO 功能注釋顯示其主要參與的生物過程為RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、上皮細胞發(fā)育、細胞對氮化合物的反應、細胞分化的負調(diào)控、神經(jīng)過程正向調(diào)節(jié)、細胞成熟、細胞黏附調(diào)節(jié)、神經(jīng)膠質細胞分化、自噬調(diào)節(jié)、細胞分解代謝正向調(diào)控、激素水平調(diào)節(jié)等；主要細胞組分即靶點所在的細胞位置為微管組織中心、中心體、染色體區(qū)域、樹突、細胞膜區(qū)域、細胞質囊腔、紡錘軸等；主要靶點分子功能為調(diào)控蛋白激酶、磷酸轉移酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、跨膜受體蛋白激酶、細胞周期依賴性蛋白、組蛋白激酶、氧化還原酶等的活性，轉錄因子、RNA 聚合酶II 轉錄因子、生長因子、激素等，見圖5。

圖4 醒消丸治療肺癌靶點信號通路富集分析Fig 4 Enrichment analysis of the signal pathways of the targets of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

圖5 醒消丸治療肺癌靶點生物過程、細胞組分、分子功能富集分析Fig 5 Enrichment analysis of biological process，cell com?ponent and molecular function of the targets of Xingxiao Pill in treatment of lung cancer

表4 醒消丸與肺癌交集靶點的信號通路Tab 4 signaling pathways of targets of Xingxiao pill in treatment of lung cancer

2.5 醒消丸有效成分‐靶點‐通路網(wǎng)絡圖的構建

運用Cytoscape3.7.2 構建醒消丸有效成分‐靶點‐通路網(wǎng)絡，運用Network Analysis 分析，依據(jù)De‐gree、BC、CC 篩選醒消丸調(diào)治肺癌的核心成分，預測核心成分為桑色素、沒藥萜醇、蛻皮激素、睪酮、乙酸辛酯、二苯基環(huán)丙烯酮、甲基丁香酚、α‐雌二醇、雌二醇、丁香酚、麝香酮等，見表5。有效成分‐靶點—通路網(wǎng)絡中，藍色方形代表靶點，紫色菱形代表通路，粉色、黃色、綠色六邊形分別代表麝香、乳香、沒藥核心成分，黃色方形代表乳香沒藥共有成分，藥物成分、通路與靶點之間的相互網(wǎng)絡見圖6。

表5 醒消丸治療肺癌的核心成分Tab 5 Core components of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

圖6 醒消丸有效成分‐靶點‐通路網(wǎng)絡圖Fig 6 Active ingredients，targets and pathways network diagram of Xingxiao Pill in the treatment of lung cancer

2.6 醒消丸核心成分與靶點的分子對接結果

運用Open Babel GUI 軟件將麝香、乳香、沒藥的核心成分的化合物結構轉換為pdb 文件。應用PyMOL 軟件對核心蛋白結構修飾，選取可以查到結構的核心成分與交集靶點及核心靶點（表6），運用Autodock 進行對接分析。分子對接結合能（Binding energy，BE）結果如表6 所示，以BE≤?5.5（kJ·mol‐1）為穩(wěn)定結合構象，表6 中加粗部分為穩(wěn)定結合構象，圖7 為部分構象結合圖。運用R 語言繪制熱圖（heatmap）以直觀反映藥物與靶點對接情況，見圖8，熱圖的顏色明暗反映了結合能的大小，顏色越暗，結合能越小，結合構象越穩(wěn)定。因而得出睪酮分別與SIRT7、AKT1、VEGFA 和MDM2，以及雌二醇分別與AR、AKT1、SIRT7、MDM2 和XPO1 的結合構象較穩(wěn)定。

圖8 醒消丸核心成分與靶點對接的熱圖Fig 8 Heatmap of core components of Xingxiao Pill dock?ing with targets

表6 醒消丸核心成分與靶點對接結合能表Tab 6 Docking and binding energy table between main components of Xingxiao Pill and the targets

圖7 醒消丸核心成分與靶點對接的結構圖Fig 7 Docking structure diagram between main components of Xingxiao Pill and targets

3 討論

醒消丸原是治療外科癰疽腫毒效驗方，現(xiàn)臨床發(fā)現(xiàn)其在肺癌治療中起到一定療效，具有打擊局部邪氣，維護全身正氣作用，遂擴大其應用范圍至肺癌，以求老藥新用，通過網(wǎng)絡藥理學整合大量數(shù)據(jù)庫資源［24］，研究其治療靶點及通路，具有傳承創(chuàng)新；在肺癌臨床應用中，醒消丸君藥雄黃豁痰解毒，臣藥麝香活血通絡，佐以乳香、沒藥活血化瘀止痛，全方共奏活血化瘀、以通為補，進而促進機體代謝，調(diào)和陰陽、平衡寒熱，符合“帝道”階段以調(diào)整體質、調(diào)和氣血陰陽為主的“綠色治療”理念，具有理論創(chuàng)新，值得進一步研究。

本研究初步篩選出醒消丸治療肺癌多種活性成分。其中，桑色素［25］和乙酸辛酯［26］具有調(diào)控癌細胞周期作用，雌二醇［27］、麝香酮［28，29］和丁香酚［30］與誘導腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成相關，睪酮激素水平升高與肺癌風險增加呈正相關［31，32］。研究表明，醒消丸中雄黃具有誘導肺癌細胞凋亡及抑制腫瘤生長效應［33］，麝香通過調(diào)控IL‐24、TNF 家族基因、MAPK 通路等發(fā)揮抗癌效應［34］，乳香與肺癌細胞凋亡、自噬、調(diào)控細胞周期相關［35］，沒藥或乳香沒藥配伍具有多種抗腫瘤活性，如抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化和凋亡、產(chǎn)生細胞毒性、抑制腫瘤血管生成等［35，36］，進一步佐證了本文上述核心成分的抗瘤機制和功效。

本研究通過構建交集靶點PPI 網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，麝香有10 種成分映射于AR，有1 種與IL‐6 有關。乳香活性成分靶向HSP90AA1、STAT3 和AR，沒藥與VEGFA、IL‐6、MTOR 和AR 相關。AR 是一種雄激素受體，與癌癥風險顯著相關。HSP90AA1 與肺癌細胞增殖或凋亡、信號傳導相關［37］。STAT3［38，39］和VEGFA 在腫瘤血管生成、腫瘤轉移中扮演重要角色［40］。 IL‐6 調(diào) 控 腫 瘤 免 疫 和 炎 癥 微 環(huán) 境［41］。MTOR 可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、代謝、衰老和自噬等過程，已被作為治療靶標用于免疫療法中［42］。通過BisoGenet3.0 插件篩選核心靶點，映射于醒消丸各成分發(fā)現(xiàn)AKT1 為核心要素，具有調(diào)控癌細胞存活、細胞周期、核糖體生物發(fā)生、蛋白質合成等作用，目前已成為癌癥治療靶標［43］。

KEGG 結果顯示，PI3K/Akt/mTOR［44，45］、蛋白聚 糖［46］、MAPK［47］、MicroRNA 和 中 心 碳 代 謝［48］在癌細胞生長、代謝重編程中占有重要地位。蛋白聚糖、MAPK 信 號 通 路［49］具 有 調(diào) 控 腫 瘤 血 管 生 成 功能。EGFR［50］、PI3K/Akt［51］在克服多藥耐藥方面具有重要貢獻。MicroRNA［52］、細胞周期、Th17 細胞途徑在腫瘤細胞周期、凋亡、炎癥、衰老中發(fā)揮重要作用。

綜上，本文根據(jù)網(wǎng)絡藥理學初步挖掘了醒消丸治療肺癌的抗癌靶點和通路，綜合分子對接和文獻研究結果，初步預測醒消丸抗癌機制涉及調(diào)控肺癌細胞凋亡、周期、血管生成、代謝重編程等途徑，MTOR、AKT1、VEGFA、SIRT7 及PI3K/AKT/mTOR、MAPK 為可能的靶點和通路。基于此，后續(xù)將進一步進行實驗研究，探究醒消丸調(diào)治肺癌的機制。

作者貢獻度說明：

周相男：統(tǒng)計數(shù)據(jù)、制作圖表并撰寫；胡凱文：中醫(yī)理論指導；周天：全文審核與指導；李志明：指導并修改前言與討論部分；高磊：方法指導。