王 亮， 韋繼光， 葛春峰， 於 虹， 姜燕琴， 楊曙方， 曾其龍， 田亮亮，①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 浙江藍(lán)美技術(shù)股份有限公司， 浙江 紹興 312000〕

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(VacciniumLinn.)落葉灌木，其果實中花青素含量較高，具有保護(hù)視力和增強(qiáng)人體免疫力等功效[1-3]。藍(lán)莓原產(chǎn)北美，雜交育種是其品種培育的主要手段。目前，科研工作者已經(jīng)選育出一批品質(zhì)優(yōu)良的品種[4-6]，并從生理特性[7]和化學(xué)成分[8]等方面對藍(lán)莓進(jìn)行了研究，促進(jìn)了藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但是，目前絕大多數(shù)藍(lán)莓品種對中國的黏重土壤和夏季高溫適應(yīng)性較差，不能達(dá)到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)；且國內(nèi)現(xiàn)有引進(jìn)栽培品種的遺傳多樣性較低、遺傳基礎(chǔ)較狹窄[9-11]，應(yīng)該加強(qiáng)野生資源在育種中的利用。中國越橘屬種質(zhì)資源豐富，特有種有51種[12]，但缺少可以直接利用的品種，特別是現(xiàn)有栽培品種所屬的藍(lán)漿果組(Sect．Cyanococcus)在中國沒有分布。因此，除了引進(jìn)野生資源，在現(xiàn)有栽培品種中發(fā)掘遺傳背景相對復(fù)雜的品種為育種材料，開展針對中國生態(tài)特點(diǎn)的育種工作對中國藍(lán)莓的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

藍(lán)莓品種‘藍(lán)美1號’(Vacciniumcorymbosum‘Lanmei 1’)是目前國內(nèi)利用引進(jìn)育種材料選育出的惟一一個國家級林木良種(編號：國R-ETS-VC-006-2018)，該品種源自20世紀(jì)90年代引入的美國藍(lán)莓育種體系的育種資源，是復(fù)雜的種間雜交實生子代，除了藍(lán)莓品種常含有的遺傳基礎(chǔ)外，還含有常綠越橘(V.darrowiiCamp)和依利越橘(V.elliottiiChapm.)的遺傳基礎(chǔ)[13]。該品種既繼承了野生越橘抗旱、耐熱和耐瘠薄的優(yōu)點(diǎn)，對中國長江流域黏重土壤和夏季高溫有較好的適應(yīng)性，又有野生越橘的高級保健功能，果實花青素含量高[14]，是良好的加工品種。因此，充分開發(fā)利用‘藍(lán)美1號’的抗性基因資源，對中國藍(lán)莓種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。

SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有良好的保守性、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，且實驗過程中所需樣本量少、分辨率高、可重復(fù)性強(qiáng)[15]。目前，SSR標(biāo)記在藍(lán)莓遺傳多樣性、親緣關(guān)系、指紋圖譜構(gòu)建以及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面得到廣泛應(yīng)用，如：崔建民等[9]利用22對SSR引物，明確了93份藍(lán)莓材料的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有栽培品種遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)狹窄；劉有春等[10]采用EST-SSR標(biāo)記對越橘屬84份材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)藍(lán)莓品種的遺傳背景較單一；徐國輝等[16]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了藍(lán)莓優(yōu)良品系的父本，并通過2對引物構(gòu)建了8個藍(lán)莓優(yōu)良品系的指紋圖譜；張春紅等[17]利用25對SSR引物對66個藍(lán)莓品種進(jìn)行了分析，揭示了不同栽培類型藍(lán)莓種質(zhì)的差異。

本研究以‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代為研究材料，采用SSR分子標(biāo)記分析自由授粉子代的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，以期為‘藍(lán)美1號’自由授粉子代選育、評價及育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代和26個現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種，共243份材料?！{(lán)美1號’217個自由授粉子代由浙江省諸暨市青山村青山基地苗圃(東經(jīng)120.07°、北緯29.65°，海拔103 m)中‘藍(lán)美1號’自由授粉獲得的種實經(jīng)播種育苗后得到，子代種植于青山基地苗圃，苗圃周圍無其他藍(lán)莓品種存在。26個品種包括：‘粉藍(lán)’(‘Powderblue’)、‘巨豐’(‘Delite’)、‘園藍(lán)’(‘Gardenblue’)、‘精華’(‘Choice’)和‘奧斯汀’(‘Austin’)5個兔眼藍(lán)莓品種；‘綠寶石’(‘Emerald’)、‘春高’(‘Springhigh’)、‘奧尼爾’(‘O’Neal’)、‘陽光藍(lán)’(‘Sunshine Blue’)、‘薄霧’(‘Misty’)、‘夏普藍(lán)’(‘Sharpblue’)、‘明星’(‘Star’)、‘珠寶’(‘Jewel’)和‘庫帕’(‘Cooper’)9個南高叢藍(lán)莓品種；‘日出’(‘Sunrise’)、‘藍(lán)金’(‘Bluegold’)、‘康維爾’(‘Coville’)、‘公爵’(‘Duke’)、‘伯克利’(‘Berkeley’)、‘齊佩瓦’(‘Chippewa’)、‘布里吉塔’(‘Brigitta’)、‘達(dá)柔’(‘Darrow’)、‘錢德勒’(‘Chandler’)、‘萊格西’(‘Legacy’)、‘晚藍(lán)’(‘Lateblue’)和‘藍(lán)豐’(‘Bluecrop’)12個北高叢藍(lán)莓品種。26個品種均種植于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃(東經(jīng)118.84°、北緯32.06°，海拔30 m)。于2020年5月，采集217個自由授粉子代單株和26個品種新梢頂端剛長出的嫩葉，每株采集3～5枚，置于-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用AG501C新型植物基因組DNA提取試劑盒(上海浦迪生物科技有限公司)提取217個自由授粉子代和26個品種植株葉片的基因組DNA，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，用Berthold Colibri超微量分光光度計(德國Berthold Technology公司)測定DNA的濃度和純度，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 SSR引物的擴(kuò)增篩選 用TC1000-G PCR儀(美國Scilogex公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系總體積10.0 μL，包括50 ng·μL-1DNA 1.0 μL、2×3GTaqMaster Mix for PAGE (Red Dye)混合液5.0 μL、100 μmol·L-1上游和下游引物各0.1 μL以及ddH2O 3.8 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2%AgNO3染色后置于燈箱上拍照。從200對SSR引物中，篩選出23對多態(tài)性好的引物用于供試材料基因組DNA的PCR擴(kuò)增，根據(jù)條帶擴(kuò)增情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

1.3.1 遺傳多樣性分析 記錄引物的多態(tài)性位點(diǎn)，某一位點(diǎn)上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，使用EXCEL 2013軟件構(gòu)建“1”“0”矩陣?；诙鄳B(tài)性條帶，使用POPGENE軟件計算Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)；使用PIC-CALC軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)，PIC值越高，表明SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性越豐富，PIC>0.50表示引物有高度多態(tài)性[18,19]；使用NTSYS-pc Ver.2.10e軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

1.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 參照黃宇寧[20]的方法，使用STRUCTURE 2.3.4軟件對217個自由授粉子代進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，分組數(shù)(K)設(shè)置為2～10，每個K值重復(fù)運(yùn)算10次，100 000次馬爾科夫鏈蒙特卡羅(MC)重復(fù)之后進(jìn)行100 000次burn-in，使用STRUCTURE Harvester在線工具[21]對獲得的結(jié)果進(jìn)行分析。參照Evanno等[22]的方法，用ΔK確定合適的K值。ΔK為|L″(K)|的平均數(shù)除以L′(K)的標(biāo)準(zhǔn)差，其中L′(K)=L(K)-L(K-1)，|L″(K)|=|L′(K+1)-L′(K)|，L(K)是STRUCTURE 2.3.4運(yùn)行結(jié)果中的最大似然值對數(shù)lnP(K)。使用CLUMPP 2.0軟件[23]將運(yùn)算結(jié)果合并，繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)分析圖。計算各子代相應(yīng)的Qi值(各子代歸入某一亞群的概率，i為子代所屬亞群)，對子代的遺傳背景進(jìn)行分析，其中，Qi≥0.6表示遺傳來源單一，Qi<0.6表示具有混合遺傳來源[24,25]。

2 結(jié)果和分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性分析

基于SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代和26個藍(lán)莓品種的遺傳多樣性分析結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：23對引物在243個供試材料中共檢測出113個等位基因，等位基因數(shù)均值為4.9，其中，引物FLS-3和GVC-C179_213擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最多(8)，引物CHI-2、KAN-1007、KAN-2133、KAN-453和KAN-628擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最少(3)；有效等位基因數(shù)(Ne)為2.6～6.7，均值為4.4；多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)為0.507 5～0.833 0，均值為0.686 6。23對引物的PIC值均在0.5以上，表明篩選出的SSR引物的多態(tài)性高，其中引物FLS-3、GVC-C179_213、GVC-C66a_306、KAN-2584和PrO32475744b的PIC值均高于0.8。

217個自由授粉子代的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.591 1～0.850 9，均值為0.733 4；Shannon’s 多態(tài)性信息指數(shù)(I)為0.968 5～1.978 9，均值為1.439 4。26個品種的H值為0.195 8～0.813 0，均值為0.479 1；I值為0.346 5～1.728 0，均值為0.851 8。217個自由授粉子代的H和I值均大于26個品種，表明自由授粉子代群體存在豐富的遺傳多樣性，且遺傳多樣性優(yōu)于現(xiàn)有栽培品種。

表1 供試SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果及‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代和26個藍(lán)莓品種的遺傳多樣性分析1)

2.2 聚類分析

根據(jù)各材料間的遺傳相似系數(shù)，對‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代和26個藍(lán)莓品種進(jìn)行聚類分析，使用1～217對217個自由授粉子代進(jìn)行編號，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：243個供試材料的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.99，在遺傳相似系數(shù)0.58處，217個自由授粉子代與26個品種被明顯分為2大類，表明‘藍(lán)美1號’自由授粉子代同現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。217個自由授粉子代的遺傳相似系數(shù)為0.70～0.99，相似程度較高。217個自由授粉子代可聚為5個類群，其中，除編號1、15、49、50、56、59、65、113、124和168外，其余207個子代分為3類：編號2、3、9、10、16、26、27、29、34、37、38、41、61、62、64、67、69、71、73、75、77、83、89、93、94、97、99、105、107、109、112、114、115、119、128、133、143、155、160、162、170、172、181、186、193、194、196、207、208、209、210、213和214共53個子代聚為類群Ⅱ，編號11、13、21、40、118、122、123、129、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、178、179、182、183和211共32個子代聚為類群Ⅳ，其余122個子代聚為類群Ⅰ。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用STRUCTURE 2.3.4軟件分析‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代的群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖2-A)顯示：當(dāng)K=4時，ΔK出現(xiàn)峰值，此時各亞群內(nèi)相似性最大；且K=4時，217個自由授粉子代的群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類清晰(圖2-B)，表明最適亞群數(shù)為4，217個自由授粉子代可劃分為4個亞群。

Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ： 217個子代217 progenies; Ⅵ: 26個品種26 cultivars.

圖2 ‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代的分組分析(A)和K=4時的群體遺傳結(jié)構(gòu)(B)

基于上述結(jié)果，繪制各子代歸入4個亞群的概率(Qi)圖，結(jié)果(圖3)顯示：每個子代有4個Qi值，以最大值為分類依據(jù)，可得出各亞群中包含子代的編號及數(shù)量。亞群Ⅰ包括編號21、113、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、160、165、166、175、177、182、183和211共26個子代。亞群Ⅱ包括編號1、7、8、11、12、13、14、17、18、25、30、31、32、35、39、48、49、51、52、56、59、65、72、80、81、82、85、86、89、91、100、103、106、110、111、120、124、125、127、129、132、134、137、143、153、156、164、171、173、174、176、178、180、188、189、190、199、200、201、202、204、205和216共63個子代。亞群Ⅲ包括編號2、3、9、10、15、16、26、27、29、34、37、41、50、53、60、61、62、64、67、69、71、73、75、83、92、93、94、97、99、105、107、109、114、115、116、118、119、128、133、155、162、170、172、186、193、194、196、207、208、209、210、212、213、214和217共55個子代。亞群Ⅳ包括編號4、5、6、19、20、22、23、24、28、33、36、38、40、42、43、44、45、46、47、54、55、57、58、63、66、68、70、74、76、77、78、79、84、87、88、90、95、96、98、101、102、104、108、112、117、121、123、126、131、136、138、144、147、157、158、161、163、167、168、169、179、181、184、185、187、191、192、195、197、198、203、206和215共73個子代。

比較各子代歸入所屬亞群的概率(表2)發(fā)現(xiàn)，‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代中，192個自由授粉子代的Qi值大于0.6，占總數(shù)的88.5%。亞群Ⅰ中26個自由授粉子代Qi值均在0.6以上；亞群Ⅱ中有11個自由授粉子代(編號1、32、39、49、51、129、143、164、176、188和200)Qi值在0.6以下，占亞群Ⅱ子代數(shù)的17.5%；亞群Ⅲ中有3個自由授粉子代(編號15、50和212)Qi值在0.6以下，占亞群Ⅲ子代數(shù)的5.4%；亞群Ⅳ中有11個自由授粉子代(編號4、23、40、77、87、90、98、123、138、168和169)Qi值在0.6以下，占亞群Ⅳ子代數(shù)的15.1%。表明亞群Ⅰ子代遺傳來源單一，遺傳背景不復(fù)雜，而亞群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中雖具有混合遺傳來源的子代，但具有混合遺傳來源的子代占比不高，亞群內(nèi)子代相似程度高。

： 亞群Ⅰ Subgroup Ⅰ; ： 亞群Ⅱ Subgroup Ⅱ; ： 亞群Ⅲ Subgroup Ⅲ; ： 亞群Ⅳ Subgroup Ⅳ.

表2 ‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代歸入所屬亞群的概率(Qi)

2.4 2種分類方法的比較

比較UPGMA聚類分析和STRUCTURE分析的劃分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種劃分結(jié)果有相似之處，如編號21、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、182、183和211在STRUCTURE分析中劃分到亞群Ⅰ，在UPGMA聚類分析中聚為類群Ⅳ；STRUCTURE分析中劃分到亞群Ⅲ中的子代在UPGMA聚類分析中大部分被聚為類群Ⅱ。

用POPGENE軟件比較2種方法劃分的亞群內(nèi)子代遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：STRUCTURE分析中得到的亞群內(nèi)子代Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差均低于UPGMA聚類分析，表明STRUCTURE分析劃分亞群內(nèi)子代遺傳多樣性水平低、相似程度高，STRUCTURE分析的分群效果優(yōu)于UPGMA聚類分析。

表 3 2種分類方法中各群體內(nèi)子代遺傳多樣性分析

3 討論和結(jié)論

遺傳標(biāo)記在自然群體中的等位基因數(shù)越多，該基因座的多態(tài)性越高，而當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)大于等于70個時，得到的遺傳信息較為可靠[26]。此外，多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)越高，SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性越豐富，更利于區(qū)分供試材料。本研究中共檢測出113個多態(tài)性位點(diǎn)，引物的PIC均值達(dá)0.686 6，可見試驗選用的SSR引物能為本研究提供可靠的遺傳信息?！{(lán)美1號’217個自由授粉子代與26個藍(lán)莓品種在遺傳相似系數(shù)0.58處分為2大類，表明‘藍(lán)美1號’自由授粉子代和現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與現(xiàn)有結(jié)論相符，即‘藍(lán)美1號’除通常藍(lán)莓品種含有的遺傳基礎(chǔ)外，還含有來自野生種的遺傳基礎(chǔ)。

遺傳多樣性是物種遺傳潛力和適應(yīng)環(huán)境變化能力的重要指標(biāo)，可從基因水平上反映出群體的變異性，對親本選配及優(yōu)良子代初步篩選具有重要的指導(dǎo)意義[27]。本研究中，‘藍(lán)美1號’217個自由授粉子代具有較高水平的遺傳多樣性，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)均值為0.733 4，Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)均值為1.439 4，而26個藍(lán)莓品種的遺傳多樣性較低，與崔建民等[9]的研究結(jié)果相一致?，F(xiàn)有栽培品種遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)狹窄，而‘藍(lán)美1號’自由授粉子代具有較高水平的遺傳多樣性，還含有野生種的遺傳基礎(chǔ)，是非常好的育種材料，通過后期選育，篩選出優(yōu)良單株，可以作為國內(nèi)藍(lán)莓品種改良的優(yōu)質(zhì)基因庫。

在品種遺傳多樣性、品種進(jìn)化和品種標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析等研究中，品種資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究是一項最基礎(chǔ)的工作[28]。已有研究中劃分群體遺傳結(jié)構(gòu)的方法主要為STRUCTURE分析和UPGMA聚類分析[29，30]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于UPGMA聚類分析，STRUCTURE分析中亞群內(nèi)子代間遺傳相似性更高，分類效果更好，利于解決群體分類對后期關(guān)聯(lián)分析的影響，降低偽關(guān)聯(lián)出現(xiàn)的概率。‘藍(lán)美1號’192個自由授粉子代的Qi值大于0.6，可見供試的絕大多數(shù)子代遺傳來源單一，且亞群內(nèi)子代相似程度高，有利于后期優(yōu)良單株篩選。

綜上所述，現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)狹窄，供試‘藍(lán)美1號’自由授粉子代與現(xiàn)有藍(lán)莓栽培品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，含有野生種的遺傳基礎(chǔ)，遺傳多樣性優(yōu)于現(xiàn)有栽培品種，有利于優(yōu)良單株的篩選。進(jìn)一步研究‘藍(lán)美1號’自由授粉子代，從中篩選優(yōu)良單株，挖掘‘藍(lán)美1號’的抗性基因資源，對實現(xiàn)藍(lán)莓種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳基礎(chǔ)拓寬具有重要意義。