牛茵茵， 唐巧玉， 周大寨， 羅興武， 羅 凱， 周毅峰

(生物資源保護與利用湖北省重點實驗室1，恩施 445000)(湖北民族大學生物科學與技術學院2，恩施 445000)

硒是人體所必需的微量元素之一，具有抗癌、抗炎癥等功效，缺硒會對重要的臟器造成功能紊亂、免疫力下降等影響[1-3]，從而引發(fā)多種疾??；David等[4]也證明了補充一定的抗氧化劑對降低心血管疾病有一定的作用，而維持內源性抗氧化活性更重要的是添加硒這樣的微量元素。

壺瓶碎米薺(Cardaminehupingshanensis)，十字花科屬，超聚硒植物,一種可食用的野生蔬菜[5]，其各個部位都含硒，葉片硒含量高達1 437 mg/kg[6,7]，它可參與機體抗氧化過程，作用于某些癌癥等[8]，因其具富硒的優(yōu)勢，使其成為硒研究的熱點。此外，壺瓶碎米薺中可提取分離含硒的組分，硒蛋白具有緩解疲勞的功效，硒黃酮具有抗凝血功能[9,10]；曹斌[11]鑒定分離純化恩施碎米薺中的含硒蛋白以及對該蛋白的結構表征，證實了這種硒蛋白具有抗氧化功效；張春燕等[12]對含硒粗黃酮進行體內體外抗氧化測定，結果表明含硒粗黃酮比普通黃酮的抗氧化性強；壺瓶碎米薺的研究也涉及轉錄組學和蛋白組方面的研究，周毅峰[13]通過轉錄組差異分析了壺瓶碎米薺硒代謝途徑，證明了硒化是壺瓶碎米薺耐硒的重要途徑；羅金華[14]克隆壺瓶碎米薺GST-u4基因，并證明了GST-u4基因表達產(chǎn)物對硒酸根、亞硒酸根和谷胱甘肽具有親和性，推斷谷胱甘肽對硒酸根和亞硒酸根熬合作用也是重要的耐硒機制。這些研究結果為以莖、葉為原料的植物硒產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎。但目前以壺瓶碎米薺種子為原料的硒產(chǎn)品研發(fā)鮮見報道，本研究以壺瓶碎米薺種子為原料，分離提取其油脂，分析其含硒水平及功效，進一步拓寬了超聚硒植物壺瓶碎米薺開發(fā)利用的渠道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：壺瓶碎米薺種子采集于湖北省恩施市，收集后除雜脫水冷藏于-20 ℃冰箱，取用時將其粉碎過60目篩烘干。

試劑：焦性沒食子酸、三氯甲烷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、無水乙醇、乙醚、異丙醇、硫代硫酸鈉、無水硫酸鈉、抗壞血酸、冰乙酸、酚酞、氫氧化鉀，分析純；DPPH(分析純)；硒標準品：GSB-04-1751-2004；碘化鉀(分析純)；環(huán)己烷(分析純)。

1.2 儀器與設備

50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取頭、手動SPME進樣器，頂空瓶(15 mL)，TU-1901紫外可見分光光度計，6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀，MARS 5微波消解儀，AFS-9760雙道原子熒光光度計，080S超聲波清洗機，GZX-9420 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，H2050R離心機。

1.3 方法

1.3.1 壺瓶碎米薺油脂的提取

將保存于冰箱的種子60 ℃烘干后，粉碎過60目篩，稱取一定量粉末采用索氏提取法，加入石油醚至接收瓶的1/2，60 ℃回流提取4～6 h，揮干溶劑，制得種子油，油稱重并置于-4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

式中：m2為圓底接收瓶和所提油脂的總質量/g；m1為烘干恒重的圓底接收瓶的質量/g；m為稱取的壺瓶碎米薺種子粉末的質量/g。

1.3.2 壺瓶碎米薺油脂理化特征分析

1.3.2.1 壺瓶碎米薺油脂理化特性

過氧化值：參照GB 5009.227—2016；碘值：參照 GB/T 5532—2008；酸價：參照GB 5009.229—2016。

1.3.2.2 硒含量的測定

參考張春燕等[12]采用微波消解-原子熒光分光度法測定硒含量。

1.3.2.3 壺瓶碎米薺油脂總酚含量測定

取1 mL樣品油分3次，間隔0.5 h，添加甲醇5 mL，超聲提取1.5 h，離心后取上清液用甲醇定容至25 mL得到待測樣品。參考程哲等[15]采用Folin-Ciocalteu法測定油脂中總酚含量。

1.3.2.4 壺瓶碎米薺油脂組成成分分析

樣品甲酯化參考崔永寧等[16]的方法。

GC條件:進樣口溫度250 ℃，分流比：20∶1，載氣為氦氣，恒定流速為1.2 mL/min，升溫程序：初始溫度60 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min。

MS條件：全掃描模式，掃描范圍為35～440 u，離子源為EI源，電子能量70 eV，四級桿：150 ℃，離子源溫度為230 ℃。

1.3.2.5 壺瓶碎米薺油脂的揮發(fā)性成分測定

參考牟迪等[5]的方法，采用 HS-SPME-GC-MS法進行測定。

GC條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，純度>99.999 %，流速為1 mL/min。升溫程序：起始溫度為40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，以10 ℃升溫至250 ℃，保持5 min。

MS條件：接口溫度250 ℃，離子源為EI，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四級桿150 ℃，掃描范圍35～450 amu。

1.3.3 壺瓶碎米薺油脂抗氧化活性的測定

參考曾琳等[17]和顏飛翔等[18]的方法測定對DPPH、超氧陰離子自由基清除率。

1.3.4 統(tǒng)計分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0和Excel 2016分析統(tǒng)計數(shù)據(jù),用OriginPro 9.1對數(shù)據(jù)進行圖形處理分析。

2 結果與分析

2.1 壺瓶碎米薺油理化特征

壺瓶碎米薺油脂理化特征見表1，出油率(31.00±2.85)%，與大豆出油率(18.00%～22.00%)和橄欖出油率(18.22%～23.50%)相比，可發(fā)展為油料作物。碘值為(112.04±2.40) g/100 g，為半干性油，可知其油脂含不飽和脂肪酸高；壺瓶碎米薺種子油的過氧化值為(0.12±0.02) g/100 g，符合國家標準，有研究表明含硒可提高其抗氧化性能，使得過氧化值降低[19]；酸價為(4.83±0.30) mgKOH/g，略高于國家標準，可能是由于油脂未經(jīng)過精煉而導致酸價偏高，需進行加工處理；硒含量為(8.439±1.12) mg/kg，符合湖北省地方富硒標準，相比較普通植物油，含硒油抗氧化性強具備廣闊的市場前景；總酚含量為(1.428±0.032) mg/mL，高于橄欖油中總酚的含量[20]。

表1 壺瓶碎米薺油理化特征

2.2 壺瓶碎米薺油脂成分分析

壺瓶碎米薺油脂總離子流圖如圖1所示，組成成分見表2，主要含脂肪酸類8種、醇類1種，質量分數(shù)分別為97.88%、2.12%，不飽和脂肪酸質量分數(shù)達到了92.49%， 略高于花生油(74.9%)和大豆油(81.17%)，略低于菜籽油(94.98%)[21]，且不飽和脂肪酸可以調節(jié)血脂，改善心血管疾病[22]，此外壺瓶碎米薺油脂中亞油酸、亞麻酸質量分數(shù)為27.89%。宋亞蕊[23]的研究表明，硒量增加時，茶油不飽和脂肪酸含量增加，當硒質量分數(shù)達到0.074 5 mg/kg時，亞油酸、亞麻酸的含量顯著增加；由此可推斷壺瓶碎米薺油脂中所含的不飽和脂肪酸質量分數(shù)高于90%可能與硒含量有關。其中植物甾醇(2.12%)質量分數(shù)高于菜籽油(0.73%)，它是一種天然存在的活性成分[24]，相關報道顯示富硒可能對植物甾醇含量造成影響。壺瓶碎米薺油脂芥酸含量過高，高芥酸能引起心肌脂肪沉積, 引發(fā)心肌炎疾病。

圖1 壺瓶碎米薺油脂總離子流圖

表2 壺瓶碎米薺油脂GC-MS鑒定結果

2.3 壺瓶碎米薺油脂揮發(fā)性成分分析

壺瓶碎米薺油脂揮發(fā)性物質總離子流圖見圖2，共檢測到56種揮發(fā)性物質見表3，主要包括苯類(13種)、烴類(26種)、酯類(5類)、醇類(3種)、其他(9種)，質量分數(shù)分別為14.35%、29.06%、32.15%、3.20%。酯類含量最高，其次是烴類，占總揮發(fā)性成分的29.06%；同時其中所含的異硫代氰酸酯類化合物是一類重要的植物化學物質，有不同程度的抗癌作用, 能夠有效地預防飲食中多種致癌物(多環(huán)芳烴、雜環(huán)胺和亞硝胺)引起的DNA損傷和癌癥，此外對真菌攝取氧有一定影響，從而影響ATP的合成[25]；紫羅蘭酮類化合物也有較強的抗腫瘤活性[26]。

圖2 壺瓶碎米薺油脂揮發(fā)性物質總離子流圖

表3 壺瓶碎米薺油脂揮發(fā)成分分析結果

續(xù)表3

2.4 壺瓶碎米薺油脂的體外抗氧化活性分析

2.4.1 清除超氧陰離子自由基能力

由圖3可知，壺瓶碎米薺油脂對超氧陰離子自由基有明顯的清除效果，存在劑量效應關系；壺瓶碎米薺油脂與維生素C兩者質量濃度較小時，清除效果有顯著性差異(P<0.05)，當壺瓶碎米薺油脂的質量濃度達到2.5 mg/mL，維生素C質量濃度達到1.25 mg/mL時，沒有顯著性差異。在0.156～1.250 mg/mL質量濃度時，壺瓶碎米薺油脂的濃度與超氧陰離子自由基清除率呈顯著的線性相關，線性相關系數(shù)為0.990 2，線性相關回歸方程為y=58.040x-7.527(x為壺瓶碎米薺油脂質量濃度，y為超氧陰離子自由基

注：不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。圖3 不同濃度壺瓶碎米薺油脂和維生素C對超氧陰離子清除率比較

清除率)?？傮w上看，在質量濃度為0.156～5.000 mg/mL時，呈非線性的二次函數(shù)相關關系，方程為y=-8.027x2+60.442x-5.910(R2=0.982 7，x為壺瓶碎米薺油脂質量濃度，y為超氧陰離子自由基清除率)。這與維生素C對超氧陰離子自由基清除率基本一致，維生素C在0.156～2.5 mg/mL時，方程為y=-11.208x2+40.518x+65.08(R2=0.957 9)，x為維生素C質量濃度，y為超氧陰離子自由基清除率。

2.4.2 清除DPPH自由基能力

由圖4可知，壺瓶碎米薺油脂質量濃度在2～40 mg/mL時對DPPH自由基的清除率有顯著性差異(P<0.05)，質量濃度高于40 mg/mL時，清除率趨于平緩與質量濃度為80 mg/mL的清除效果沒有顯著性差異，達到了94%。在質量濃度為2.5～20 mg/mL時，壺瓶碎米薺油脂的質量濃度與DPPH自由基清除率呈顯著的線性相關，線性相關系數(shù)為0.998 7，線性相關回歸方程為y=3.315x-2.592x為壺瓶碎米薺油脂質量濃度，y為DPPH自由基清除率；總體上看，在質量濃度為2.5～80 mg/mL時，呈非線性的二次函數(shù)相關關系，方程為y=-0.031 7x2+3.747 2x-3.014 5(R2=0.995 9)，x為壺瓶碎米薺油脂質量濃度，y為DPPH自由基清除率。在供試濃度范圍內，維生素C對DPPH自由基的清除率幾乎接近定值，壺瓶碎米薺油脂對DPPH自由基的清除率逐漸接近維生素C清除率。

圖4 不同濃度壺瓶碎米薺油脂和維生素C對DPPH清除率比較

3 討論

實驗結果表明壺瓶碎米薺油脂的酸價高于國家標準，后續(xù)研究可將樣品油進行脫酸、脫蠟、脫臭等精煉工藝，改善品質，若理化指標達到國家標準即可作為未來開發(fā)利用新對象；實驗所得油脂達到了富硒要求，可作為一種功能性油脂。但對于富硒油脂的抗癌，抗炎功能以及硒含量對壺瓶碎米薺油脂成分的影響需要深入探索；油脂脂肪酸主要成分中不飽和脂肪酸含量達到了92.49%，亞油酸和亞麻酸含量較高，這兩種必需脂肪酸可維持毛細血管的正常以及保證正常生殖機能[27]，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等功能[28,29]；一些研究也證實了硒的存在會對油脂的理化特性造成影響，會降低酸價以及過氧化值[23]，提高油脂中不飽和脂肪酸的含量，使得油脂的品質提升，可見硒含量的攝入可改善油脂質量，未來可作為一種優(yōu)化油脂的方法途徑。針對壺瓶碎米薺油脂芥酸質量分數(shù)高達26.34%，可采用冷凍結晶預處理和尿素包合法降低芥酸含量[30]，也可采用基因調控干預培育轉基因株[31]；HS-SPME-GC-MS檢測到富硒油56種揮發(fā)性物質，其中所含的異硫氰酸芐酯(18.23%)，異硫氰酸異丁酯(8.96%)與分析超聚硒壺瓶碎米薺不同時期葉片揮發(fā)性物質所得到的主要成分一致[1]。

不飽和脂肪酸含量較高容易氧化，而壺瓶碎米薺油脂中雖然不飽和脂肪酸含量高，但其所含天然抗氧化成分(植物甾醇，總酚)高于其他植物油；此外研究表明，硒可參與新陳代謝，對作物的品質及其組成成分、功能性產(chǎn)生影響，劉娟等[32]研究證實了硒的存在會增加油脂天然抗氧化活性成分的積累，馬小靈[33]證實硒含量增加提高茶油的抗癌、抗氧化性能；除此以外，硒本身具有抗氧化功能，兩者結合協(xié)同作用，使得壺瓶碎米薺油脂抗氧化性能提高。對于硒在脂肪酸中存在的形態(tài)鮮見報道，只有早期出現(xiàn)硒化脂肪酸相關研究[34]，此方面還需繼續(xù)探索。

4 結論

壺瓶碎米薺油脂出油率達到了(31.00±2.85)%，酸價為(4.83±0.30) mgKOH/g，過氧化值為(0.12±0.02) g/100 g，碘值為(112.04±2.40) g/100 g，硒含量為(8.439±1.120) mg/kg，總酚含量為(1.428±0.032) mg/mL油；油脂成分主要成分有9種，主要由不飽和脂肪酸構成，質量分數(shù)達到了92.49%，亞油酸、亞麻酸質量分數(shù)超過了20.00%；油脂揮發(fā)性物質主要包括苯類、烴類、酯類、醇類等?？芍獕仄克槊姿j油脂是一種富硒、高不飽和脂肪酸的功能性油脂。

壺瓶碎米薺油脂具有較強體外抗氧化活性壺瓶碎米薺油脂質量濃度為0.156～1.250 mg/mL時，與超氧陰離子自由基清除率呈顯著的線性相關，在質量濃度為0.156～5.000 mg/mL時，呈非線性的二次函數(shù)相關關系，這與維生素C清除率增長趨勢相似；油脂質量濃度為2.5～20 mg/mL時，與DPPH自由基清除率呈顯著的線性相關，質量濃度為2.5～80 mg/mL時，呈非線性的二次函數(shù)相關關系，且隨著濃度的增大清除率逐漸趨于維生素C。由此可見，壺瓶碎米薺油脂對超氧陰離子自由基和DPPH自由基有較好的清除效果，具有較強的體外抗氧化活性。對于該富硒油脂的功能性研究以及安全性評價需要進一步地探索研究。