葉敏倩， 駱曉慧， 吳 洲， 薛加雯， 包佳潔， 吳莎萍， 何志平， 吳峰華

(浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，杭州 311300)

山核桃(CaryaCathayensisSarg)又名小胡桃，屬胡桃科山核桃屬，生長(zhǎng)在氣候優(yōu)越、土壤肥沃、植被茂盛的自然環(huán)境中，主要分布于浙江臨安、安吉、淳安以及安徽寧國(guó)、績(jī)溪等地，是一種我國(guó)特有的名優(yōu)干果和木本油料作物[1]。其果仁不僅含有豐富的蛋白質(zhì)和油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，還富含多種人體必需的氨基酸和礦物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。除此之外，山核桃仁含有大量的多酚、維生素E、植物甾醇等活性成分[3]，研究表明這些物質(zhì)對(duì)提升人體抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力有益[4-6]。

山核桃仁原料本身風(fēng)味不足，但烘烤過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、蛋白質(zhì)和氨基酸降解等可產(chǎn)生吡嗪、吡咯等多種揮發(fā)性風(fēng)味成分[7，8]，賦予其特殊的香味。但烘烤也會(huì)使堅(jiān)果中的不飽和脂肪酸加速氧化，積聚對(duì)人體有害的過氧化物[9]。研究表明，溫度和時(shí)間是堅(jiān)果烘烤的最關(guān)鍵因素，不僅決定風(fēng)味品質(zhì)，還能影響堅(jiān)果中維生素E、甾醇等功能成分[10]。目前，貯藏與加工過程對(duì)山核桃品質(zhì)的影響已有文獻(xiàn)報(bào)道[11，12]，但烘烤條件對(duì)山核桃理化品質(zhì)及風(fēng)味成分的影響卻鮮有報(bào)道[13]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)9組溫度和時(shí)間組合的烘烤條件對(duì)山核桃仁進(jìn)行加工，探究烘烤條件對(duì)生育酚、植物甾醇、色澤等理化指標(biāo)的影響，同時(shí)利用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)結(jié)合偏最小二乘判別分析(partial least square-discrimination analysis, PLS-DA)建立不同烘烤條件的山核桃仁風(fēng)味物質(zhì)的判別模型，以期為優(yōu)化山核桃的烘烤條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山核桃于2019年9月中旬采自浙江省杭州市臨安區(qū)的昌化山區(qū)，挑選直徑為1.95～2.05 cm且顆粒飽滿、無病害山核桃，于20～30 ℃下自然晾曬4 d，裝袋備用。

α、β、γ、δ-生育酚和膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)品為色譜級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器)，GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，MB45紅外快速水分測(cè)定儀，HD-3A智能水分活度測(cè)量?jī)x，CR-10色差儀。

1.3 方法

1.3.1 山核桃仁的烘烤

手工剝出山核桃仁后，挑選顆粒完整的核桃仁進(jìn)行烘烤。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)價(jià)為依據(jù)，設(shè)計(jì)9組烘烤條件：130 ℃(低溫，LT)烤40 min(LT1)、50 min(LT2)、60 min(LT3)；145 ℃(中溫，MT)烤30 min(MT1)、35 min(MT2)、40 min(MT3)；160 ℃(高溫，HT)烤20 min(HT1)、23 min(HT2)、26 min(HT3)。將未烘烤的山核桃仁樣品設(shè)置為對(duì)照組。

1.3.2 含水量和水分活度的測(cè)定

含水量和水分活度分別采用水分活度儀和遠(yuǎn)紅外水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 顏色分析

將完整山核桃仁用色差儀進(jìn)行測(cè)量，將未烘烤過的山核桃作為參照(L，a，b=0)，計(jì)算得處理組山核桃的ΔL、Δa、Δb值。

1.3.4 甾醇的測(cè)定

樣品預(yù)處理[14，15]：稱取1.5 g山核桃仁粉末，加入1 mL 0.5 mg/mL膽甾醇內(nèi)標(biāo)，在80 ℃下用15 mL 1 mol/L甲醇-氫氧化鉀冷凝回流1 h。冷卻后，將不皂化物用25 mL蒸餾水和150 mL石油醚洗滌。然后，45 ℃減壓濃縮，揮干石油醚，將殘留物溶于8 mL正己烷中并用氮?dú)獯蹈?。最后，? mL正己烷溶解提取物，過0.45 μm濾膜，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：SH-Rtx-Wax色譜柱(30.0 m× 0.25 mm, 0.25 μm)，柱溫升溫程序：230 ℃保持2 min，以5 ℃ min/L的速率升至250 ℃，保持74 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣流速1 mL/min；載氣∶氦氣；分流比為15∶1。MS條件：離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，掃描質(zhì)量范圍50～500m/z。

1.3.5 生育酚測(cè)定

生育酚測(cè)定的前處理參考GB 5009.82—2016[16]的方法。

液相色譜條件：C18-WP色譜柱(4.6 m×250 mm, 5 μm)，等度洗脫(甲醇∶水= 98∶2 )，流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm。通過外標(biāo)法，確定生育酚組分與含量。

1.3.6 SPME-GC-MS測(cè)定揮發(fā)性成分[17-19]

SPME條件: 分別取0.5 g 山核桃仁粉末置于頂空瓶中，用隔墊密封。將頂空瓶置于 60 ℃平衡 20 min，插入已活化好的SPME萃取頭 ( 270 ℃，30 min) ，在60 ℃ 下吸附40 min，在250 ℃ 下解析5 min。

GC條件：Rxi-5 MS色譜柱(30.0 m×0.25 mm, 0.25 μm)，柱溫升溫程序：初始溫度30 ℃ ，保持1 min，以7 ℃/min升到130 ℃，以3 ℃/min升到180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min升到 240 ℃，保持5 min; 進(jìn)樣口溫度250 ℃; 載氣流速 1 mL/min; 載氣：氦氣；進(jìn)樣方式: 不分流。

MS條件：電子轟擊離子源 ( EI) ，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍33～373m/z。

通過GC-MS，利用全掃描模式對(duì)各樣品的香氣成分進(jìn)行測(cè)定，得到總離子流圖。采用NIST08和NIST08S標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進(jìn)行檢索鑒定，篩選匹配度達(dá)到90%以上的化合物。根據(jù)峰面積歸一法得到各香氣成分的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P=0.05)；采用SIMCA-P 11.5對(duì)山核桃仁揮發(fā)性成分進(jìn)行PLS-DA。

2 結(jié)果與討論

2.1 烘烤條件山核桃仁水分、水分活度和顏色的影響

如表1所示，烘烤前山核桃仁的平均含水量為4.72%，水分活度為0.53。山核桃仁含水量和活度會(huì)隨烘烤時(shí)間和溫度的增加而降低，但在長(zhǎng)時(shí)間的烘烤下，含水量和水分活度最終趨于穩(wěn)定且無顯著差異(P>0.05)。顏色是評(píng)價(jià)堅(jiān)果品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[19，20]。山核桃高溫烘烤后顏色由亮紅色變成暗紅色，ΔL、Δa、Δb均為負(fù)值，烘烤溫度和時(shí)間對(duì)山核桃仁亮度有顯著影響。這是因?yàn)樵诤婵具^程中，山核桃易發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生棕色的新化合物[18]。澳洲堅(jiān)果果仁[21]和波蘭榛子[18]在焙烤過程中也會(huì)發(fā)生類似的變化。

表1 烘烤條件對(duì)山核桃仁的水分、水分活度和色澤的影響

2.2 山核桃仁的甾醇組成

如表2所示，山核桃仁中共檢測(cè)出5種植物甾醇，其中β-谷甾醇含量最高，為117.81 mg/100 g，這與Ryan等[21]對(duì)核桃中植物甾醇的研究結(jié)果一致。山核桃原料的總甾醇含量為167.71 mg/100 g，高溫烘烤對(duì)山核桃的總甾醇含量無顯著影響(P>0.05)。徐貴華等[22]對(duì)植物油中甾醇的高溫穩(wěn)定性研究表明，菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇在180 ℃條件下仍具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

表2 烘烤條件對(duì)山核桃仁中甾醇的影響

2.3 生育酚

由表3可知，γ-生育酚是山核桃中主要的生育酚，占總量的80%以上，其次為α-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚。山核桃經(jīng)過高溫烘烤，α、β、γ和δ生育酚含量均顯著下降，并且隨烘烤時(shí)間的增加，其含量呈下降趨勢(shì)。Stuetz等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，

表3 烘烤條件對(duì)山核桃中生育酚的影響

榛子、杏仁和核桃分別在140 ℃和160～170 ℃進(jìn)行低溫長(zhǎng)時(shí)間和高溫短時(shí)間烘烤，α和γ-生育酚含量均顯著下降。生育酚是一類熱穩(wěn)定較好的化合物，烘烤過程中生育酚的損失，可能是由于氧化反應(yīng)引起的[24]。

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析山核桃仁揮發(fā)性成分

2.4.1 烘烤后山核桃仁揮發(fā)性成分分析

本研究共檢測(cè)出山核桃仁中的111種揮發(fā)性成分，在除去含硅化合物、烷烴類和烯烴類化合物后，對(duì)其中主要的65種成分進(jìn)行分析。如表4所示，生山核桃的揮發(fā)性成分主要是醇、醛和酯類；烘烤后的山核桃主要為酯、酮以及雜環(huán)類化合物。有研究表明，蛋白質(zhì)中的蘇氨酸、絲氨酸以及含氮的雜環(huán)類化合物在受熱后能降解生成具有特殊風(fēng)味的揮發(fā)性成分[9]，其中以吡嗪、呋喃和吡咯等最多，而這類揮發(fā)性化合物對(duì)烘烤堅(jiān)果的風(fēng)味具有較大影響[13]。山核桃仁在烘烤過程中產(chǎn)生的吡嗪類化合物主要為2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪等。隨著烘烤溫度的升高和烘烤時(shí)間的增加，烤山核桃的揮發(fā)性成分含量和種類均有顯著的變化，其中MT3和HT3組的吡嗪質(zhì)量分別占總揮發(fā)性成分質(zhì)量的8.71%和12.73%，呋喃質(zhì)量分別占10.79%和18.25%。

2.4.2 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)模型建立

偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)是在預(yù)先分類的條件下，根據(jù)樣本信息建立模型的一種有監(jiān)督的分析模式[25]。本研究對(duì)9種不同烘烤條件下的山核桃仁樣品的65種主要揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，建立不同烘烤條件山核桃仁的PLS-DA模型，圖1a是以主成分1、2為坐標(biāo)，各樣本點(diǎn)在該坐標(biāo)平面的垂直投影的得分圖。圖1b為Hotelling T2分布圖，27個(gè)山核桃仁樣品的相似度在95%的置信區(qū)間內(nèi)且有明顯的分類，說明建立的PLS-DA 模型可對(duì)烘烤的山核桃樣品進(jìn)行分類。

由圖1所示，建立的模型可以將3個(gè)溫度烘烤的山核桃樣品明顯區(qū)分，其中低溫烘烤(LT)在主成分1上可以進(jìn)行有效區(qū)分，而中溫(MT)和高溫(HT)在主成分2上達(dá)到了較好的分離效果。建立的PLS-DA 模型具有良好的擬合參數(shù)：R2(X)=0.637，R2(Y)=0.936，Q2=0.806，說明該模型十分穩(wěn)定且能夠解釋93.6%的原始數(shù)據(jù)，并且具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。

圖1 PLS-DA得分圖和Hotelling T2 分布圖

2.4.3 PLS-DA模型可靠性驗(yàn)證

對(duì)樣本順序進(jìn)行隨機(jī)置換，將建立PLA-DA 模型時(shí)定義分類Y的變量順序隨機(jī)排列100次，得到的Q2和R2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)[26]。結(jié)果表明，該模型的R2和Q2的一元線性回歸曲線在縱軸上的截距分別都小于0.4和0，說明模型均不存在過擬合現(xiàn)象，模型可靠[27]，因此可用于對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同烘烤條件下山核桃中重要揮發(fā)性成分進(jìn)行判別分析。

2.4.4 不同烘烤條件下山核桃仁的特征香氣的鑒定

將PLS-DA 模型的因子載荷圖(圖2)與65種香氣成分的變量重要性(VIP)值圖(圖3)相結(jié)合，離密集區(qū)越遠(yuǎn)，VIP 值越大，該香氣成分的含量在不同烘烤條件下山核桃仁之間的差異越大，對(duì)分類起著越關(guān)鍵的作用。共有24種香氣成分VIP值大于1，分別為1-羥基-2-丁酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、當(dāng)歸酸、己醛、2-醛基吡咯、2-甲基丁酸、2-乙基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、惕各酸甲酯、1-辛烯-3-醇、桉葉醇、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、苯乙醇、辛醇、(E，E)-2,4-癸二烯醛、2(5H)-呋喃酮、苯甲醛、3-呋喃甲醇、2-十一烯醛、DL-泛酰內(nèi)酯、壬酸、糠醛、2,4,4-三甲基丁-2-烯內(nèi)酯、十四酸異丙酯。

圖2 PLS-DA 模型因子載荷圖

圖3 65種香氣成分VIP值圖

對(duì)于VIP>1 的山核桃仁香氣成分進(jìn)行差異性分析和風(fēng)味物質(zhì)分析，結(jié)果如表4所示。不同烘烤條件下山核桃仁的香氣成分均有顯著差異(P<0.05)，與PLS-DA 模型分析結(jié)果相同。不同揮發(fā)性物質(zhì)的風(fēng)味均有所不同，通過對(duì)24種香氣成分進(jìn)行風(fēng)味分析，可以看到，中溫烘烤山核桃中1-羥基-2-丁酮(C7)和2-乙基-6-甲基吡嗪(F3)含量較高，具有烤榛子和烤谷物的風(fēng)味。而高含量的2-醛基吡咯(F7)、2-甲基丁酸(D3)、2-乙基吡嗪(F2)和2-甲基丁酸乙酯(E10)賦予了中溫烘烤山核桃組咖啡、乳脂、可可和果香等風(fēng)味，使中溫烘烤山核桃仁的風(fēng)味更豐富。低溫烘烤山核桃中辛醇(A3)、2-十一烯醛(B9)、壬酸(D2)和糠醛(B15)含量較高，具有蠟質(zhì)味、澀味等氣味。高溫烘烤山核桃仁揮發(fā)性物質(zhì)含量較少，大多為油脂香氣和木質(zhì)香。因此，中溫烘烤山核桃仁后，山核桃仁的風(fēng)味更豐富且具有特征性。

表4 不同烘烤條件下主要揮發(fā)性物質(zhì)的風(fēng)味

3 結(jié)論

溫度和時(shí)間的不同組合能夠顯著影響烘烤山核桃仁的品質(zhì)。隨烘烤時(shí)間和溫度的增加，山核桃仁的含水量、水分活度、亮度指標(biāo)和生育酚含量均顯著下降，顏色變暗。但高溫烘烤對(duì)山核桃仁中甾醇組成和含量無顯著影響。

通過SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)不同溫度和時(shí)間烘烤的山核桃仁的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析，共鑒定出65種揮發(fā)性成分，其中雜環(huán)類成分對(duì)烤山核桃仁的風(fēng)味具有顯著影響。建立基于揮發(fā)性成分判別不同烘烤條件下的山核桃的PLS-DA模型，結(jié)果顯示，27個(gè)樣品中沒有離群點(diǎn)，可以將烘烤山核桃仁在溫度上進(jìn)行區(qū)分，且模型可靠。結(jié)合PLS-DA 模型中VIP>1 的變量和差異顯著性分析結(jié)果，最終鑒定出24種揮發(fā)性成分是不同烘烤條件下山核桃仁風(fēng)味呈現(xiàn)的關(guān)鍵化合物，對(duì)關(guān)鍵揮發(fā)性成分的風(fēng)味鑒定實(shí)現(xiàn)了對(duì)山核桃仁風(fēng)味的準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)。145 ℃烘烤使山核桃仁具有更豐富的果香和烘烤的堅(jiān)果香，而130、160 ℃的烘烤對(duì)香氣的貢獻(xiàn)沒有顯著積極作用。對(duì)顏色指標(biāo)、甾醇含量、生育酚含量和揮發(fā)性成分綜合評(píng)價(jià)，145 ℃/30 min條件烘烤下的山核桃仁營(yíng)養(yǎng)成分含量較高，且風(fēng)味濃郁。