宋崇崇, 張瑾 , 周娜娜, 駱縱縱, 馬添翼

安徽建筑大學環(huán)境與能源工程學院,安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室,合肥 230601

全球新型冠狀病毒爆發(fā)以來,消毒劑已經成為了人們生產生活的必需品。 據報道,2020年2月武漢市消毒劑的居民使用量高達1 900 多t,此外,污水處理廠的消毒劑投放量高達1 700 多t[1]。 至今,國外疫情依舊沒有得到全面控制。 可想而知,全球消毒劑的使用量將是一個極為龐大的數字。 大量消毒劑的使用導致生態(tài)環(huán)境面臨較大的潛在危險。Tong 等[2]研究發(fā)現含氯消毒劑的大量使用會造成菌的耐藥性。 此外,在消毒劑使用的過程中會伴隨有消毒副產物的生成[3],對生態(tài)環(huán)境造成了更為嚴重的影響。 有調查甚至發(fā)現,新冠疫情后有98.6%的人在使用消毒劑的時候會將多余的消毒劑遺棄到環(huán)境中,這勢必會導致水生生態(tài)環(huán)境被直接或是間接的污染[4]。 消毒劑的過量使用會使水生生態(tài)系統(tǒng)遭遇極大的破壞,影響水質進而增加動物和人類的間接風險[5-6]。 相比于一般重金屬、抗生素和離子液體等污染物而言,消毒劑易揮發(fā),更易對人體健康產生危害。 Park 等[7]發(fā)現加濕器消毒劑的主要成分(聚六亞甲基胍)會造成孕婦和兒童肺部發(fā)生病變。Herron 等[8]研究發(fā)現苯扎氯銨消毒劑會對膽固醇生物合成產生影響從而破壞神經發(fā)育。 在眾多消毒劑中,季銨鹽類消毒劑(quaternary ammonium salt disinfectant, QASD)是在衛(wèi)生、養(yǎng)殖業(yè)和工業(yè)等各個領域中廣泛被使用的一種消毒劑[9],目前,對消毒劑毒性風險評估的研究較少,對QASD 的毒性風險評估則更少,因此有必要對QASD 進行毒性研究。

在自然環(huán)境中,污染物常以混合物形式存在[10-12],這就勢必會造成污染物的復合污染。 混合物可能會產生比單個污染物風險更大、更復雜的毒性相互作用,采用適當的模型客觀和準確地評估混合物對環(huán)境的危害和風險是非常關鍵的。 濃度加和(concentration addition, CA)模型[11-14]是目前眾多評估模型中應用最為廣泛的一種,然而,CA 模型只能定性評估混合物毒性相互作用。 在環(huán)境風險評估時,需要關注到混合污染物對環(huán)境產生最大風險的程度[15],因此,需要對混合物毒性相互作用的強度進行定量評估。 基于CA 模型的擬合歸零法[16]將擬合的濃度劑量效應曲線(concentration-response curves,CRCs)上的各個效應歸一化到同一尺度,并對CA 模型預測線和CRCs 做偏差分析,可對毒性相互作用進行定量表征。

綜上所述,本文擬以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)為受試生物,以生活中常用的3 種季銨鹽類消毒劑雙十二烷基二甲基溴化銨(didodecyl dimethyl ammonium bromide, DAB)、 苯 扎 溴 銨(benzalkonium bromide, BKB)和度米芬(domiphen bromide, DOM)為研究對象,采用均勻設計射線法(uniform design ray, UD-ray)設計消毒劑的三元混合物體系。 應用時間依賴微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis, t-MTA)考察消毒劑及其三元混合體系對C. pyrenoidosa的毒性效應。分別應用CA 模型和擬合歸零法對三元消毒劑混合物的毒性相互作用進行定性和定量評估,以此為其環(huán)境風險評估提供數據和方法參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

選取3 種常用的季銨鹽類消毒劑(QASD)作為實驗對象,其中雙十二烷基二甲基溴化銨(DAB)為分析純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,苯扎溴銨(BKB)和度米芬(DOM)為分析純,購自上海麥克林生化科技有限公司,它們的理化性質如表1所示。 為避免消毒劑濃度在儲存過程中發(fā)生變化,3種消毒劑的溶液均是當天現配現用,且采用Milli-Q水配制,并儲存于棕色瓶中,放置于4oC 的冰箱內。

表1 3 種消毒劑的理化性質和儲備液濃度Table 1 Physical and chemical properties of the three disinfectants and concentration of stocks

1.2 藻種與培養(yǎng)方法

蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB),編號為FACHB-5,采用BG11 培養(yǎng)基[17]進行培養(yǎng),藻液按1 ∶5 的比例進行轉接,為防止C. pyrenoidosa聚于瓶底,也為了藻液受光均勻,需要每天定時搖晃錐形瓶,藻的詳細培養(yǎng)過程參考文獻[18]。

1.3 混合物設計

均勻設計射線法(UD-Ray)是一種可用于全面表征三元及以上多元混合物的方法[12,19],在此,采用UD-Ray 設計QASD 的三元混合物體系,其中包括5條射線 U1、U2、U3、U4 和 U5,每條射線中各組分的濃度比例(pi)如表2 所示。

表2 三元混合體系中季銨鹽類消毒劑(QASD)的濃度比(pi)Table 2 Concentration ratio (pi) of quaternary ammonium salt disinfectant (QASD) of the ternary mixture system

1.4 時間依賴微板毒性分析法

通過時間依賴微板毒性分析法(t-MTA)[20-21]獲得單個消毒劑及其三元混合物的濃度-效應數據。選擇透明的96 孔板為實驗載體,在其四周共36個微孔中加入200 μL 超純水以避免邊緣效應。 在第6、7 列剩余的 12 孔中加入 100 μL 超純水作為空白對照組,其余列按預實驗的稀釋因子設置12個濃度梯度,最終在每個微孔中加入100 μL 處于對數生長期(0.2＜OD690＜0.3)的藻液使得每個孔的總體積為200 μL。 為減少實驗誤差,每個實驗組均設置3個平行樣。 此外,為了避免蒸發(fā),每個透明的96 孔板都加蓋,并放置在(25±1)℃、光暗比14 h ∶10 h、光照強度為5 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天定時交換板的位置以確保受光均勻,在12、24、48、72 和96 h 時取出,放置于酶標儀中讀取OD690值。 毒性效應(E)計算公式如下:

1.5 數據擬合

毒性數據采用兩參數非線性模型 Logit 函數[22-23]來進行擬合,數據擬合通過APTox 軟件[24]來實現。 Logit 函數公式如下:

式中:E表示效應(0≤E≤1),α和β是模型參數,c是污染物的濃度。

為了描述實驗數據的精密程度,采用觀測值置信區(qū)間(confidence interval based on the observation,OCI)[25-26]來表征數據的不確定度。

1.6 混合物毒性相互作用分析

常采用CA 模型[13-14]來評估混合物的毒性相互作用,其公式如下:

式中:n表示組分的個數;ci表示當混合體系表現出效應x時所對應的第i個組分的濃度;ECx,i表示第i個組分所對應的等效應濃度。 當CA 模型擬合線與95% OCI 的相對位置不同時,代表了不同的相互作用規(guī)律,詳細見判別示意圖1(a)。

為了進一步對混合物毒性相互作用進行定量評估,采用基于濃度加和偏離指數(deviation from CA model, dCA)[15,27]和95% OCI 的擬合歸零法對毒性相互作用實現動態(tài)定量表征,其公式如下:

式中:dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度,ECAx表示CA 模型預測的效應,Ex表示Logit 函數擬合的效應。 毒性相互作用見判別示意圖1(b)。

圖1 毒性相互作用判別示意圖注:dCA 表示濃度加和偏離指數,dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度。Fig.1 Schematic diagram of toxicity interaction identificationNote: dCA represents deviation from concentration addition model, and dOCI represents the degree of deviation of confidence interval based on the observation.

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 3 種 QASD 對 C. pyrenoidosa 的單元毒性

采用兩參數非線性函數(Logit 函數)對由t-MTA法測得的3 種QASD 的單元毒性數據進行擬合,擬合的參數(α和β)和統(tǒng)計學參數(RMSE 和R)如表 3所示。 此外,將不同時間點下的CRCs 繪制于圖2。

由表 3 可知,3 種 QASD 對C. pyrenoidosa的單元毒性數據可以較好地被Logit 函數擬合(RMSE＜0.070,R＞0.8700)。 其中,初始時間(12 h)的擬合情況比后面時間點(24 ~96 h)的擬合情況稍差,這可能是藻在初始時間下存在適應性差異的原因[28]。 半數效應濃度(median effect concentration, EC50)由 Logit 函數(公式 2)的反函數計算而來。 3 種 QASD 對C. pyrenoidosa的EC50值比離子液體對發(fā)光菌[29]、農藥對發(fā)光菌[30]和重金屬對C. pyrenoidosa[31]的EC50值分別小3個、2個和 2個數量級。 已有研究表明,發(fā)光菌比C. pyrenoidosa對毒性響應更加敏感[32],如以pEC50值(EC50的負對數)為毒性大小指標[33-34],可知,3 種QASD 的毒性遠大于文獻中所報道的離子液體、農藥和重金屬的毒性。 這也表明在自然環(huán)境下對消毒劑進行風險評估尤為重要。 一般藻類的測試終點是96 h,此時的毒性順序是:DOM＞BKB＞DAB。 但是越來越多的研究表明,時間是毒性研究中的一個重要因素[20,35]。 由表3 和圖2 可知,3種消毒劑對C.pyrenoidosa呈顯著的時間依賴毒性效應,但在48 h 后毒性不再明顯增加。 這也說明,在對污染物的毒性進行研究時,需要關注時間這一因素,不同污染物隨時間變化的毒性效應規(guī)律有所不同。

表3 Logit 函數對3 種 QASD 在不同暴露時間下毒性數據的擬合參數(α 和 β)、統(tǒng)計學參數(RMSE 和R)、EC50 和 pEC50 值Table 3 The fitting parameters (α and β), statistical parameters (RMSE and R), EC50, and pEC50 values of the three QASD toxicity data of the Logit function at different exposure times

2.2 3 種QASD 對C. pyrenoidosa 的三元混合毒性效應

5 條三元混合射線的毒性效應數據可以較好地被 Logit 函數擬合(RMSE＜0.050,R＞0.8600)。 擬合的參數(α和β)和統(tǒng)計學參數(RMSE 和R)如表 4 所示。 因三元混合物的時間-毒性-效應數據在效應0~1 范圍內分布比單個消毒劑的均勻,為了更好地分析消毒劑毒性隨暴露濃度和時間的變化規(guī)律,在三維曲線圖(圖2)的基礎上繪制了濃度時間效應三維曲面圖,如圖3 所示。

圖2 不同暴露時間下3 種QASD 對C. pyrenoidosa 的擬合濃度劑量效應曲線(CRCs)Fig.2 Fitted concentration-response curves (CRCs) of three QASD to C. pyrenoidosa at different exposure times

由圖3 可知,三維曲面圖的顏色映射情況可以很好地呈現出污染物毒性與濃度和時間因素的變化規(guī)律。 同一暴露時間下,5 條QASD 三元混合射線對C. pyrenoidosa的抑制率隨混合濃度增加而逐漸變大,即具有濃度依賴毒性效應。 張瑾等[33]在研究氨基甲酸酯類農藥對青海弧菌毒性特點時也發(fā)現了該規(guī)律。 同一濃度下,5 條QASD 三元混合射線對C. pyrenoidosa的抑制率隨時間的延長而逐漸變大,即具有時間依賴毒性效應,丁婷婷等[32]發(fā)現氨基糖苷類抗生素對發(fā)光菌和C. pyrenoidosa也具有時間依賴毒性效應。 將0.1 ~0.9 的效應用紅色實線在三維曲面上標注出來,可知不同的效應濃度隨時間的變化規(guī)律有所不同。 12 ~48 h 時,EC10、EC20、EC30和EC40在逐漸減小,而在48 ~96 h 時則逐漸變大,但每個效應濃度隨時間的變化程度有所不同。 由紅色實線的彎曲程度可知,48 ~96 h 的效應濃度變化的程度在逐漸變小。 圖3 中5 條射線的 EC50值在12 ~48 h 快速減小,在48 ~72 h 緩慢減小,而在72~96 h 則緩慢增大,這和表4 中EC50值的變化規(guī)律一致。

圖3 3 種QASD 對C. pyrenoidosa 的濃度-時間-效應三維曲面圖Fig.3 Three dimensional surface diagram of concentration-time-effect of three QASD on C. pyrenoidosa

表4 Logit 函數對三元混合物的5 條射線在不同暴露時間下毒性數據的擬合參數(α 和β)、統(tǒng)計學參數(RMSE 和 R)、EC50 和 pEC50 值Table 4 The fitting parameters (α and β), statistical parameters (RMSE and R), EC50, and pEC50 values of the ternary mixture toxicity data of the Logit function at different exposure times

2.3 QASD 三元混合體系的時間依賴協(xié)同作用

5 條QASD 三元混合射線的實驗數據點、擬合的CRCs、95% OCI 和 CA 模型預測線如圖4 所示。由圖4 可知,在12 h 時,5 條射線在低濃度區(qū)間的CA 模型預測線落于95% OCI 內,呈加和作用,但隨暴露濃度的加大CA 模型預測線逐漸低于95%OCI 下限,呈協(xié)同作用。 在 24 h 時,U1 和 U2 在中濃度區(qū)間的CA 模型預測線低于95% OCI 下限,呈協(xié)同作用,而低濃度和高濃度區(qū)卻呈加和作用,U3、U4 和U5 在整個濃度區(qū)間的CA 模型預測線幾乎都在 95% OCI 內,呈加和作用。 在 48 h 時,U1 和 U2中濃度區(qū)的CA 模型預測線和95% OCI 下限的偏離程度加大,即協(xié)同作用變強,而 U3、U4 和 U5 在中濃度區(qū)也逐漸表現出弱協(xié)同作用。 在72 h 和96 h 時,低濃度下5 條射線都呈加和作用,隨暴露濃度的增加,CA 模型預測線逐漸低于95% OCI 下限,呈協(xié)同作用。 當暴露時間從24 h 到96 h 的過程中,5 條射線的協(xié)同作用都在逐漸變強,呈現時間依賴協(xié)同作用規(guī)律。

盡管CA 模型可以很好地評估混合毒性相互作用,但在不同濃度水平下,協(xié)同作用(圖4)強度無法由CA 模型進行定量表征。 結合置信區(qū)間的擬合歸零法將各個濃度水平的效應歸一化到同一尺度,可以對毒性相互作用進行定量表征,擬合歸零指數如圖5 所示。

與CA(圖4)相比,擬合歸零指數圖(圖5)可以很清晰地看出協(xié)同作用隨濃度的變化存在有非常明顯的差異。 在12 h 時,隨濃度變大,5 條射線的協(xié)同作用強度逐漸變強。 雖然濃度會改變混合物毒性相互作用的強度,但并不是濃度越大毒性相互作用強度就越強。 在24 ~96 h 時,隨濃度變大,每條射線的協(xié)同作用強度在逐漸變強,當到達最大協(xié)同作用強度后,濃度繼續(xù)變大,協(xié)同作用強度則在不斷減弱(除U3-24 h 在整個濃度水平下都是加和作用外)。Zhang 等[15]在研究氨基糖苷類抗生素對青?；【拘韵嗷プ饔靡?guī)律時,也發(fā)現混合物體系的協(xié)同作用強度隨濃度呈先變強后變弱的現象。 此外,隨暴露時間的延長,5 條射線具有最大協(xié)同作用強度所對應的濃度都逐漸變大。 值得注意的是,在24 ~96 h的過程中,5 條射線的最大協(xié)同作用強度都在逐漸變強。 在96 h,最大協(xié)同作用強度達到最大,此時,U1、U2、U3、U4 和 U5 的最大協(xié)同作用強度分別為0.3227、0.3507、0.3105、0.2804 和 0.2626。 陳敏等[36]在研究抗生素與重金屬混合物對C. pyrenoidosa的毒性效應時也發(fā)現了部分混合射線具有時間依賴協(xié)同作用。 上述研究結果表明,疫情后大量使用的消毒劑可能會導致自然水體環(huán)境受到嚴重污染,而消毒劑之間所產生的協(xié)同毒性作用,且隨時間的延長而增強,這很可能會對環(huán)境健康產生更大的威脅,值得我們密切關注消毒劑的潛在生態(tài)環(huán)境風險。

圖5 不同暴露時間下QASD 三元混合體系的5 條射線的擬合歸零指數圖注:dCA 表示濃度加和偏離指數,dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度。Fig.5 Fitting zero index diagram of five mixture rays of QASD ternary mixture systems at different exposure timesNote: dCA represents deviation from concentration addition model, and dOCI represents the degree of deviation of confidence interval based on the observation.

綜上所述:

(1) Logit 函數可以較好地對 DAB、BKB、DOM及其三元混合射線進行擬合。

(2)3 種消毒劑對C. pyrenoidosa呈顯著的時間依賴毒性效應,即隨暴露時間的延長,毒性逐漸增強,但在48 h 后毒性不再明顯增加。

(3) 時間-濃度-效應三維曲面圖適合描述效應在空間濃度分布較為均勻的毒性隨時間變化規(guī)律,在同一暴露時間,QASD 三元混合物對C. pyrenoidosa的抑制率隨混合濃度增加而逐漸變大,同一暴露濃度,QASD 三元混合物對C. pyrenoidosa的抑制率隨時間的延長而逐漸變大。

(4) 依據 CA 模型,QASD 三元混合體系的5 條射線對C. pyrenoidosa的毒性相互作用幾乎都是協(xié)同作用,且在24 ~96 h 具有時間依賴協(xié)同作用。

(5) 基于擬合歸零法,可以實現協(xié)同作用強度的定量表征。 隨暴露濃度增加,協(xié)同作用強度先變強后變弱,隨暴露時間的延長,5 條射線具有最大協(xié)同作用,強度都逐漸變大。