周仕霞 李曉明 唐君玲

關(guān)鍵詞淋巴瘤細(xì)胞;耐藥性;miRNA-18a;miRNA-4802;自噬;機(jī)制

淋巴瘤尤其非霍奇金淋巴瘤是危害人類健康的重大疾病[1]。淋巴瘤患者在臨床上常使用環(huán)磷酰胺、阿霉素（adriamycin，ADR）、長春新堿（vincristine，VCR）和博來霉素等的聯(lián)合化療方案進(jìn)行治療;近年來，單克隆抗體靶向藥物的發(fā)展也大大改善了淋巴瘤患者的臨床治療現(xiàn)狀[2-3]。然而，在臨床治療過程中，淋巴瘤細(xì)胞的耐藥性會(huì)嚴(yán)重威脅化療效果和患者預(yù)后[4-6]。所以，闡明淋巴瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

自噬是細(xì)胞在環(huán)境壓力條件下進(jìn)行的一種非常重要的細(xì)胞代謝機(jī)制，呈現(xiàn)高度的進(jìn)化保守性[7]。相關(guān)研究表明，在淋巴瘤中，自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是多種化療藥物的重要作用機(jī)制[8-10];然而，也有研究表明，自噬可以顯著增強(qiáng)淋巴瘤細(xì)胞對(duì)特定單一化療藥物或多種化療藥物的耐藥性[11-14]，但其具體分子機(jī)制尚不明確。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小分子RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域中起著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-18a、miRNA-4802 與細(xì)胞耐藥性之間存在相關(guān)性?；诖?，本研究以人Burkitt’s 淋巴瘤細(xì)胞和人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，使用ADR和VCR 進(jìn)行處理，再以miRNA-18a、miRNA-4802 以及細(xì)胞自噬作為研究切入點(diǎn)，探討2 個(gè)miRNA對(duì)淋巴瘤細(xì)胞耐藥性的影響及調(diào)控機(jī)制，以期為淋巴瘤耐藥性的機(jī)制闡明及淋巴瘤治療藥物開發(fā)提供參考，同時(shí)也為淋巴瘤的臨床治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HR40-ⅡA2 型生物安全柜（海爾集團(tuán)公司），GX53 型倒置熒光顯微鏡、BX53M型正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），SCO6AD-2 型二氧化碳培養(yǎng)箱、Milli-Q 型水純化系統(tǒng)、ST 40R型低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），TGL-16M型常溫離心機(jī)、DK 8D型恒溫水浴鍋（湖南湘儀科教儀器有限公司），TriStar2LB942 型多功能微孔板酶標(biāo)儀（北京科瑞恩特科技有限公司），12kV HT7800 型透射電鏡[柜谷科技發(fā)展（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（批號(hào)分別為11875-093、26010066）購于美國Thermo Fisher Scientific公司;細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CK04）購于北仁化學(xué)科技（北京）有限公司;細(xì)胞裂解液、Ad-mCherry-GFP-LC3 腺病毒（批號(hào)分別為20200407、CA100008M）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）單克隆抗體、兔抗人p62 單克隆抗體、兔抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)分別為14600-1-AP、KHC0058、23660-1-AP）均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔抗人unc-51 樣激酶（ULK1）單克隆抗體、兔抗人自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）單克隆抗體、兔抗人活化型胱天蛋白酶9（cleaved caspase-9）單克隆抗體、兔抗人cleaved caspase-6單克隆抗體（批號(hào)分別為A7481、A2856、SAB4503337、SAB4500330）均購于美國Sigma 公司;模擬生物體內(nèi)源的miRNAs（miRNA mimics，批號(hào)AF04-20201004）購于上海生工生物工程有限公司。其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人Burkitt’s 淋巴瘤細(xì)胞Daudi 和人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞JeKo-1 均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Daudi 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，JeKo-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含20% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中。2 種細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞呈單個(gè)懸浮生長。

2.2 Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞對(duì)ADR和VCR耐藥性的考察將Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞以2 000 個(gè)/孔接種于96孔板中，分別分為對(duì)照組、ADR組（1 μg/mL，質(zhì)量濃度設(shè)置參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）、VCR組（1 μg/mL，質(zhì)量濃度設(shè)置參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），另設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)10 個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液100 μL，其余各給藥組加入相應(yīng)藥液100 μL，培養(yǎng)72 h后，各組加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測(cè)各組吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性[相對(duì)活性=（給藥組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）]。

相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)束后，采用Western blot 法進(jìn)行2 種凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。取ADR組、VCR組細(xì)胞適量，以細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳，然后進(jìn)行封閉、孵育抗體、顯影等操作，以檢測(cè)2 種細(xì)胞中cleavedcaspase-9 和cleaved caspase-6 的表達(dá)水平（以β-actin 蛋白為內(nèi)參）。

2.3 Daudi細(xì)胞和JeKo-1細(xì)胞自噬活性的考察

2.3.1 2 種自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)取Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞適量，以細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按“2.2”

項(xiàng)下Western blot 法操作，檢測(cè)2 種細(xì)胞中LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達(dá)水平（以β-actin蛋白為內(nèi)參）。

2.3.2 自噬流實(shí)驗(yàn)取Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞適量，接種于裝有細(xì)胞爬片（已經(jīng)多聚賴氨酸處理）的24 孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)，將培養(yǎng)基換成不含雙抗的完全培養(yǎng)基，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳感染復(fù)數(shù)值加入適量Ad-mCherry-GFP-LC3腺病毒溶液，感染48 h后，取出細(xì)胞爬片，并以磷酸鹽緩沖液清洗3 次;于載玻片上滴加適量防熒光猝滅劑，并將細(xì)胞爬片（有細(xì)胞的一面）覆于其之上，再采用熒光顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白的分布和形態(tài)。

2.3.3 透射電鏡觀察取Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞適量，經(jīng)消化、離心后收集細(xì)胞，以2.5%戊二醛溶液固定24 h，再以1%鋨酸溶液固定3 h 后，于4 ℃條件下進(jìn)行梯度脫水、包埋、固化、切片（厚度為70 nm）;將切片以3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛溶液染色6 h 后，采用透射電鏡觀察2種細(xì)胞中的自噬溶酶體并計(jì)數(shù)。

2.4 Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞中miRNA-18a、miRNA-4802和ULK1、ATG7的表達(dá)差異考察

取Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞適量，使用試劑盒提取2種細(xì)胞的總RNA，再分別使用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行miRNA-18a 和miRNA-4802、ULK1 和ATG7 的逆轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)cDNA;再以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR），具體引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系（共10 μL）：TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，水3.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)39 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-18a、miRNA-4802 和ULK1、Atg7 mRNA的表達(dá)水平。另外，取Daudi細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞適量，以細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按“2.2”項(xiàng)下Western blot 法操作，檢測(cè)2 種細(xì)胞中ULK1、ATG7蛋白的表達(dá)水平（以β-actin蛋白為內(nèi)參）。

2.5 JeKo-1 細(xì)胞經(jīng)miRNA-18a mimics 處理后自噬活性的變化考察

將JeKo-1細(xì)胞分為Control mimics處理組和miRNA-18a mimics 處理組，miRNA-18a mimics 處理組細(xì)胞加入miRNA-18a mimics 適量進(jìn)行轉(zhuǎn)染（Control mimics 處理組不作任何處理）。然后取2 組細(xì)胞適量，分別進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)（以檢測(cè)各組細(xì)胞中ULK1、LC3-Ⅱ、p62 蛋白的表達(dá)水平）、自噬流實(shí)驗(yàn)（以檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的分布和形態(tài)）、透射電鏡觀察（以檢測(cè)各組細(xì)胞中自噬溶酶體的數(shù)量）。

2.6 JeKo-1 細(xì)胞經(jīng)miRNA-4802 mimics 處理后自噬活性的變化考察將JeKo-1細(xì)胞分為Control mimics處理組和miRNA-4802 mimics 處理組，同“2.5”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)（其中Western blot 實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)ATG7、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達(dá)水平）。

2.7 JeKo-1 細(xì)胞經(jīng)miRNA-18a mimics 和miRNA-4802mimics處理后耐藥性的變化考察取JeKo-1 細(xì)胞適量，以ADR（1 μg/mL）干預(yù)后，分為Control mimics 處理組、miRNA-18a mimics 處理組、miRNA-4802 mimics 處理組。另取JeKo-1 細(xì)胞適量，以VCR（1 μg/mL）干預(yù)后，同樣分為上述3 組。各組細(xì)胞按“2.5”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活性和凋亡標(biāo)志蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞對(duì)ADR和VCR的耐藥性考察結(jié)果

經(jīng)ADR處理后，Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞的相對(duì)活性與其各自的對(duì)照組相比分別降低至51%和70%（P<0.001）;經(jīng)VCR處理后，Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞的相對(duì)活性分別降低至41%和72%（P<0.001）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)ADR、VCR處理后，Daudi 細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達(dá)水平均顯著高于JeKo-1 細(xì)胞（P<0.01 或P<0.001）。結(jié)果見圖1。這表明，與Daudi 細(xì)胞相比，JeKo-1 細(xì)胞對(duì)ADR和VCR具有更強(qiáng)的耐藥性。

3.2 Daudi細(xì)胞和JeKo-1細(xì)胞自噬活性的考察結(jié)果Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Daudi 細(xì)胞相比，JeKo-1 細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p62 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.001）。自噬流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JeKo-1 細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的熒光斑塊明顯，自噬活性較強(qiáng);Daudi 細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊不明顯，自噬活性較弱。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與Daudi 細(xì)胞[自噬溶酶體數(shù)量為（0.2±0.1）個(gè)]相比，JeKo-1細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量[（2.4±0.1）個(gè)]顯著增多（P<0.01）。結(jié)果見圖2。這表明，JeKo-1細(xì)胞的自噬活性顯著高于Daudi細(xì)胞。

3.3 Daudi 細(xì)胞和JeKo-1 細(xì)胞中miRNA-18a、miRNA-4802和ULK1、ATG7的表達(dá)差異考察結(jié)果qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Daudi 細(xì)胞中miRNA-18a和miRNA-4802 的表達(dá)水平均顯著高于JeKo-1 細(xì)胞，JeKo-1 細(xì)胞中ULK1、ATG7 mRNA 的表達(dá)水平均顯著高于Daudi 細(xì)胞（P<0.001）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JeKo-1 細(xì)胞中ULK1、ATG7 蛋白的表達(dá)水平均顯著高于Daudi 細(xì)胞（P<0.001）。結(jié)果見圖3。這提示miRNA-18a、miRNA-4802 可能對(duì)自噬啟動(dòng)基因ULK1、ATG7 起負(fù)調(diào)控作用。

3.4 miRNA-18a mimics 處理JeKo-1 細(xì)胞后自噬活性的變化Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細(xì)胞中ULK1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p62 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）。自噬流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細(xì)胞中無明顯LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與Control mimics 處理組[自噬溶酶體數(shù)量為（2.9 ± 0.1）個(gè)] 相比，miRNA-18a mimics 處理組JeKo-1 細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量[（0.2±0.1）個(gè)]顯著減少（P<0.01）。結(jié)果見圖4。這表明，經(jīng)miRNA-18a mimics處理后，JeKo-1 細(xì)胞的自噬活性降低。

3.5 miRNA-4802 mimics 處理JeKo-1 細(xì)胞后自噬活性的變化Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control mimics 處理組相比，miRNA-4802 mimics 處理組JeKo-1 細(xì)胞中ATG7、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著降低，p62 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）。自噬流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Controlmimics 處理組相比，miRNA-4802 mimics 處理組JeKo-1 細(xì)胞中無明顯LC3-Ⅱ蛋白熒光斑塊。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與Control mimics處理組[自噬溶酶體數(shù)量為（3.6±0.1）個(gè)]相比，miRNA-4802 mimics處理組JeKo-1細(xì)胞自噬溶酶體數(shù)量[（0.3 ± 0.1）個(gè)] 顯著減少（P<0.01）。結(jié)果見圖5。這表明，經(jīng)miRNA-4802 mimics 處理后，JeKo-1 細(xì)胞的自噬活性降低。

3.6 JeKo-1 細(xì)胞經(jīng)miRNA-18a mimics 和miRNA-4802mimics處理后耐藥性的變化細(xì)胞相對(duì)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用miRNA-18amimics 和miRNA-4802 mimics 處理后，JeKo-1 細(xì)胞對(duì)ADR、VCR 的耐藥性均顯著降低（P<0.001）。Westernblot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)miRNA-18a mimics 和miRNA-4802 mimics 處理后，ADR、VCR均可顯著升高JeKo-1 細(xì)胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表達(dá)水平（P<0.001）。結(jié)果見圖6。這表明，miRNA-18a mimics和miRNA-4802 mimics 很可能通過抑制淋巴瘤細(xì)胞的自噬活性來抑制其對(duì)ADR和VCR的耐藥性。

4 討論

淋巴瘤細(xì)胞的耐藥性一直是淋巴瘤基礎(chǔ)研究和臨床診療的重要關(guān)注點(diǎn)[15]。淋巴瘤細(xì)胞的耐藥性是指淋巴瘤細(xì)胞通過多種途徑實(shí)現(xiàn)減少或者阻止化療藥物的殺傷力，從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)自身生存的目的。一般情況下，淋巴瘤細(xì)胞常通過以下途徑實(shí)現(xiàn)耐藥性：減少化療藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);增加化療藥物排出細(xì)胞外;改變細(xì)胞代謝途徑;增強(qiáng)化療藥物致DNA損傷的修復(fù);抑制化療藥物引起的細(xì)胞凋亡[16-18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，上述多種途徑均有細(xì)胞自噬過程的參與，尤其在增強(qiáng)DNA修復(fù)和抑制細(xì)胞凋亡過程中，自噬發(fā)揮著重要作用[19-22]。

自噬在細(xì)胞內(nèi)受多種途徑的分子調(diào)控，其核心調(diào)控機(jī)制主要包括雷帕霉素信號(hào)通路和腺苷酸活化蛋白激酶通路[23 - 25]。值得注意的是，某些非編碼RNA，如miRNA 已被證實(shí)廣泛參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)過程[26-27]。

基于此，本研究聚焦miRNA 對(duì)淋巴瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控過程。自噬小體的觸發(fā)和延展是成熟的分子調(diào)控過程，該過程中涉及3 個(gè)關(guān)鍵的自噬小體起始蛋白復(fù)合物，其中ULK1 基因編碼的蛋白質(zhì)與ATG13 蛋白、200 kDa 的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinasefamily interacting protein of 200 kDa，F(xiàn)IP200）形成的蛋白復(fù)合物則是其中之一[28-29]。ULK1 不僅是自噬小體起始蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，還對(duì)Beclin1、ATG14L和VPS34 復(fù)合物等自噬關(guān)鍵起始因子具有磷酸化作用，也對(duì)自噬小體的順利延展起到不可替代的作用[30]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，自噬的激活和自噬小體的延展需要依靠細(xì)胞內(nèi)多種自噬相關(guān)蛋白參與的類泛素化調(diào)控系統(tǒng)，其中，ATG7 蛋白可以發(fā)揮類泛素化激活酶E1 的作用，與ATG12 蛋白結(jié)合后轉(zhuǎn)運(yùn)至ATG5 蛋白;另外，ATG10 蛋白可以發(fā)揮類泛素化結(jié)合酶E2 的作用，促進(jìn)ATG12-ATG5 蛋白復(fù)合物的形成，進(jìn)而發(fā)揮類泛素化連接酶E3 的作用，最終完成ATG8 蛋白的酯化作用，形成ATG8-PE 蛋白復(fù)合物。ATG8-PE 蛋白復(fù)合物對(duì)招募自噬小體延展成分和自噬底物具有重要作用[31-32]。由此可見，ULK1 和ATG7 基因均為自噬進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)水平與細(xì)胞自噬活性直接相關(guān)。

本研究以人Burkitt’s 淋巴瘤細(xì)胞Daudi 和人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞JeKo-1 為研究對(duì)象，從ADR和VCR這2 種具有代表性的化療藥物入手，探索上述2 種細(xì)胞的耐藥性。經(jīng)ADR和VCR處理后，與Daudi 細(xì)胞相比，JeKo-1細(xì)胞活性更高、凋亡水平更低。JeKo-1 細(xì)胞比Daudi 細(xì)胞具有更強(qiáng)的自噬活性，并且JeKo-1 細(xì)胞中miRNA-18a和miRNA-4802 的表達(dá)水平更低，ULK1、Atg7 mRNA表達(dá)水平更高;進(jìn)一步使用miRNA-18a mimics 和miRNA-4802 mimics 處理JeKo-1 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬水平受到顯著抑制，且對(duì)ADR和VCR的耐藥性顯著降低。由此推測(cè)，miRNA-18a 和miRNA-4802 很可能是通過靶向負(fù)調(diào)控ULK1、ATG7 mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制淋巴瘤細(xì)胞的自噬和耐藥性。

綜上所述，miRNA-18a 和miRNA-4802 分別通過降低自噬啟動(dòng)基因ULK1 和Atg7 的表達(dá)，抑制淋巴瘤細(xì)胞的自噬活性，從而降低淋巴瘤細(xì)胞對(duì)ADR和VCR的耐藥性。