張 蕊， 朱 琳， 李樂(lè)樂(lè)， 王松雪， 張 冰， 葉 金， 郭寶元

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院1，北京 100037)(呂梁學(xué)院2，呂梁 033099)

水稻是我國(guó)三大糧食作物之一，2019年我國(guó)稻谷總產(chǎn)量達(dá)20 961.4萬(wàn)t[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)稻谷約85%用于大米加工，多作為口糧直接食用[2]。水稻種植過(guò)程中，為了降低病蟲(chóng)害的影響，農(nóng)藥必不可少。伴隨著化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用，不可避免地產(chǎn)生了農(nóng)藥殘留問(wèn)題，尤其是不科學(xué)、不規(guī)范的用藥給糧食質(zhì)量安全帶來(lái)了巨大風(fēng)險(xiǎn)隱患[3]。大米中的農(nóng)藥殘留主要來(lái)源于水稻生產(chǎn)中使用的化學(xué)農(nóng)藥，雖然加工可以減少大米中農(nóng)藥殘留水平，但大米中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)依然存在。為保護(hù)消費(fèi)者健康，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)大米中的農(nóng)藥殘留做出了明確的規(guī)定[4]。

有關(guān)大米中農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[5-11]。檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7-9]和氣質(zhì)聯(lián)用法[10-14]。由于三重四極桿質(zhì)譜法具有檢測(cè)下限更低、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘分析中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)得到了廣泛的應(yīng)用。目前大米中農(nóng)殘檢測(cè)GC-MS/MS法研究報(bào)道不少，但針對(duì)于GB 2763—2019中大米限定的農(nóng)殘分析研究還很少，關(guān)于保護(hù)劑在大米中農(nóng)殘檢測(cè)的應(yīng)用研究很少?，F(xiàn)基于GC-MS/MS法的農(nóng)殘分析國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅一項(xiàng)[13]，且需要溶劑轉(zhuǎn)化，存在耗時(shí)、容易損失農(nóng)殘目標(biāo)物等問(wèn)題。本研究立足于國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019，以大米中25種農(nóng)藥及其代謝物殘留為檢測(cè)對(duì)象，深入探討了保護(hù)劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立一種基于氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)大米中多農(nóng)藥殘留的快速方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：大米。

實(shí)驗(yàn)耗材：乙腈(色譜純)；乙酸(色譜純)；乙酸乙酯(色譜純)；蒸餾水；PSA；C18(40～60 μm)；無(wú)水硫酸鎂(分析純)；氯化鈉(分析純)；50 mL和15mL離心管；0.2 μm濾膜；L-古洛糖酸內(nèi)酯(分析純)；D-山梨醇(分析純)。

標(biāo)準(zhǔn)品: 丙草胺、稻豐散、稻瘟靈、敵稗、敵瘟磷、丁草胺、氟酰胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲奈威、喹硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、異丙威、艾氏劑、p,p’-滴滴涕、p,p’-滴滴涕、p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴、狄氏劑、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、禾草敵、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氯氰菊酯、三唑磷、溴氰菊酯、順-氯丹、反-氯丹，濃度均為1 000 μg/mL；外環(huán)氧七氯B，質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000氣相色譜三重四極質(zhì)譜聯(lián)用儀，5810R離心機(jī)，TARGIN VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器。

1.3 保護(hù)劑配制

配制含20 mg/mLL-古洛糖酸內(nèi)酯以及10mg/mLD-山梨醇混合溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：配制5 mg/L外環(huán)氧七氯B內(nèi)標(biāo)溶液。

農(nóng)藥混標(biāo)：配制25種農(nóng)藥及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)的儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。使用大米基質(zhì)空白液將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為2.5、5、10、50、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作上機(jī)液：移取上述各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后，再?gòu)闹幸迫?00 μL，加入20 μL保護(hù)劑，備用。

1.5 樣品處理

樣品經(jīng)粉碎過(guò)20目篩后，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶劑，渦旋搖勻20 min，以7 000 r/min離心5 min使固液分離。轉(zhuǎn)移10 mL上清液于50 mL離心管中，加入2.0 g無(wú)水硫酸鎂和0.8 g氯化鈉，振搖后，再次渦旋5 min，7 000 r/min離心5 min。待凈化。

移取上清液2 mL于裝有300 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18的15 mL離心管中，振搖后渦旋混勻5 min，7 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.2 μm濾膜。

移取1 mL上述凈化液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，再?gòu)闹幸迫?00 μL，加入20 μL保護(hù)劑。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱；30 m×0.25 mm×0.25 μm；

色譜柱溫度：50 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升溫至120 ℃，以4 ℃/min升溫至240 ℃，以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.6.2 質(zhì)譜條件

25種農(nóng)藥及其代謝物和內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件為電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線(xiàn)溫度：280 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)：每種農(nóng)藥分別選擇一對(duì)定量離子、一對(duì)定性離子。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞電壓，見(jiàn)表1。

表1 25種農(nóng)藥及其代謝物和內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

25種農(nóng)藥及其代謝物、內(nèi)標(biāo)化合物的沸點(diǎn)各不相同，如果采用恒溫色譜分析，低沸點(diǎn)組分因柱溫太高很快流出，峰形非常尖銳，而高沸點(diǎn)組分因柱溫太低和區(qū)域擴(kuò)散，峰形扁平，影響準(zhǔn)確定量，因此本實(shí)驗(yàn)采用程序升溫。為方便用戶(hù)使用，本實(shí)驗(yàn)選擇了最常見(jiàn)的HP-5MS弱極性色譜柱，而未選擇GB 23200.113—2018推薦的中等極性色譜柱[13]。

實(shí)驗(yàn)中通過(guò)儀器SRM優(yōu)化軟件，確定了25種農(nóng)藥及其代謝物、內(nèi)標(biāo)化合物的母離子、子離子以及碰撞能，并選擇響應(yīng)高、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，另一對(duì)作為定性離子對(duì)，見(jiàn)表1。一般氣質(zhì)離子源溫度設(shè)置在200～300 ℃之間，隨著離子源溫度提高，離子化效率提升，靈敏度增加，特別是沸點(diǎn)高的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中使用100 μg/L 混標(biāo)，采用SRM模式，考察了不同離子源溫度(260、280、300 ℃)對(duì)25種農(nóng)藥及其代謝物、內(nèi)標(biāo)化合物響應(yīng)的影響。在每個(gè)離子源溫度下重復(fù)進(jìn)樣4次，計(jì)算各自相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)不同溫度下質(zhì)譜峰響應(yīng)平均值與300 ℃下質(zhì)譜峰響應(yīng)平均值比較，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。從圖1、圖2可以看出，離子源溫度在260～300 ℃范圍內(nèi)時(shí)，α-六六六及其異構(gòu)體、三唑磷、丙草胺、喹硫磷、氟酰胺、氯氰菊酯、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、溴氰菊酯隨著離子源溫度升高，靈敏度呈增加趨勢(shì)；外環(huán)氧七氯B、七氯、敵稗、禾草敵隨著離子源溫度升高，靈敏度呈下降趨勢(shì)?？傮w上離子源溫度280 ℃略?xún)?yōu)于300 ℃，但兩者響應(yīng)差距不顯著，部分農(nóng)藥在離子源溫度260 ℃下響應(yīng)降低明顯，離子化效率低。GB 23200.113—2018中離子源溫度設(shè)定為280 ℃，但本實(shí)驗(yàn)考慮到離子源在高溫下不易臟，最終將離子源溫度設(shè)定為300 ℃。

2.2 農(nóng)殘前處理方法的優(yōu)化

提取是農(nóng)藥殘留檢測(cè)很關(guān)鍵的一步，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有著直接的影響。乙腈的溶解性好，滲透力強(qiáng)，適合的農(nóng)藥極性范圍相對(duì)廣泛，乙腈適當(dāng)酸化，能促進(jìn)農(nóng)藥從組織中溶出，改善提取效率[15]。本研究采用20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合液直接提取樣品[16]，渦旋20 min后離心。

提取上清液中含有大量水分，無(wú)法直接進(jìn)行氣質(zhì)分析，必須將水分除掉。鹽析能減少有機(jī)溶劑在水中的溶解度，使提取液中的水分含量減少。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113—2018中鹽包使用量大，鹽析發(fā)熱明顯，如操作不當(dāng)，會(huì)造成局部過(guò)熱，甚至燙傷。因此本研究對(duì)前處理進(jìn)行優(yōu)化，選擇了2.0 g無(wú)水硫酸鎂和0.8 g氯化鈉作為鹽析劑，加入過(guò)程中不會(huì)造成局部過(guò)熱，除水效果理想。鹽析劑可實(shí)驗(yàn)室自行配制，操作簡(jiǎn)單，降低檢測(cè)成本。

在鹽析液中存在少量蛋白、脂肪等雜質(zhì)，干擾后續(xù)分析，因此需要進(jìn)一步凈化。常用的吸附填料有PSA、C18、石墨化碳黑GCB等。PSA可以有效去除脂肪酸、蛋白質(zhì)等極性干擾物質(zhì)；C18凈化劑可去除脂類(lèi)、蠟類(lèi)等非極性干擾物質(zhì)；GCB表面由6個(gè)碳原子構(gòu)成平面六角形，能有效吸附色素。大米中基本不存在色素干擾，因此選用PSA和C18作為凈化劑，同時(shí)加入一定量的無(wú)水硫酸鎂吸附鹽析液中殘留的少量水分。本研究中凈化劑比例參考GB 23200.113—2018添加。

圖1 不同離子源溫度下響應(yīng)值比值

圖2 不同離子源溫度下響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

GB 23200.113—2018凈化后需進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)化，將溶劑乙腈轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯，再進(jìn)行氣質(zhì)分析?？紤]到溶劑轉(zhuǎn)化過(guò)程存在耗時(shí)、容易損失農(nóng)殘目標(biāo)物的缺點(diǎn)，且目前很多品牌的色譜柱可耐受乙腈， 因此本研究采用凈化后直接進(jìn)樣。整個(gè)前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)便、快速、可實(shí)現(xiàn)批量處理。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 保護(hù)劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指樣品中除分析物以外的組分對(duì)分析物的離子化產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制作用，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[17]。目前基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方式主要有兩種，一種是基于目標(biāo)物響應(yīng)值(峰面積)，即基質(zhì)中目標(biāo)物響應(yīng)值與純?nèi)軇┲心繕?biāo)物響應(yīng)值的比值[17]；一種是基于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率，即基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的比值[18]。兩種方法的計(jì)算理論依據(jù)一致，表述方式略有不同。實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種評(píng)價(jià)方式進(jìn)行了比較。方法一采用100 μg/L純?nèi)軇?乙腈)標(biāo)液及基質(zhì)標(biāo)液，方法二采用2.5～100 μg/kg線(xiàn)性范圍內(nèi)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率(外標(biāo)法)，大米中25種農(nóng)殘及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖3。可以看出，基質(zhì)對(duì)所有農(nóng)藥有明顯增強(qiáng)作用，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在氣相色譜中主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)結(jié)論一致[14]。在氣相色譜中，基質(zhì)成分的存在減少了色譜系統(tǒng)活性位點(diǎn)與待測(cè)物分子作用的機(jī)會(huì)，使得待測(cè)物的檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)[14]。除δ-六六六、γ-六六六2種農(nóng)藥略有差距外，其他農(nóng)藥兩種基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方式結(jié)果具有很好的一致性。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)多點(diǎn)線(xiàn)性回歸獲得，因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率比值比單點(diǎn)響應(yīng)值比值具有更強(qiáng)的穩(wěn)健性。

一種比較常見(jiàn)的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法是加入分析保護(hù)劑。分析保護(hù)劑可以與待分析農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)襯管中的活性位點(diǎn)，也可降低高溫不穩(wěn)定的農(nóng)藥在進(jìn)樣口的分解率，從而提高純?nèi)軇┲修r(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，達(dá)到與基質(zhì)中農(nóng)藥同等的響應(yīng)[19]。實(shí)驗(yàn)中考察了L-古洛糖酸內(nèi)酯和D-山梨醇保護(hù)劑對(duì)響應(yīng)的影響。分別配制了100 μg/L純?nèi)軇?乙腈)標(biāo)液、基質(zhì)標(biāo)液、含保護(hù)劑的溶劑標(biāo)液、含保護(hù)劑的基質(zhì)標(biāo)液四種標(biāo)液。不同標(biāo)液中農(nóng)藥的響應(yīng)值與含保護(hù)劑的溶劑標(biāo)液中相應(yīng)農(nóng)藥的響應(yīng)值比較，見(jiàn)圖4。保護(hù)劑的加入對(duì)于純?nèi)軇┲卸鄶?shù)農(nóng)藥(除氯蟲(chóng)苯甲酰胺外)有顯著增強(qiáng)效應(yīng)，特別是甲萘威。狄氏劑、順-氯丹、反-氯丹3種農(nóng)藥受基質(zhì)影響不大。丁草胺、丙草胺、喹硫磷、敵稗、氟酰胺、氯蟲(chóng)苯甲酰胺等農(nóng)藥含保護(hù)劑的溶劑標(biāo)液與基質(zhì)標(biāo)液響應(yīng)差距顯著，因此用含保護(hù)劑的溶劑標(biāo)液作為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并不合適。對(duì)于大米中多數(shù)農(nóng)藥(丁草胺、敵瘟磷、氟酰胺、溴氰菊酯、甲萘威除外)，當(dāng)純?nèi)軇?biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液中加入相同量的保護(hù)劑，可以補(bǔ)償純?nèi)芤夯|(zhì)效應(yīng)，削弱基質(zhì)溶液的基質(zhì)效應(yīng)。因此，在實(shí)際測(cè)定過(guò)程，可采取基質(zhì)標(biāo)曲或是保護(hù)劑基質(zhì)標(biāo)曲作為樣品定量標(biāo)曲。

圖4 保護(hù)劑對(duì)響應(yīng)值影響的對(duì)比

2.3.2 線(xiàn)性范圍

為了提高方法的準(zhǔn)確性，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用保護(hù)劑基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。在2.5～100 μg/kg范圍內(nèi)，大米中25種農(nóng)殘及其代謝物線(xiàn)性良好，R2≥0.995，可用于定量，見(jiàn)表2。

表2 大米中25種農(nóng)殘及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

續(xù)表2

2.3.3 加標(biāo)回收率、定量限及檢出限

取空白大米樣品，分別添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得10、20、100、200 μg/kg添加水平樣品，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行3平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各添加水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見(jiàn)表3。在10 μg/kg添加水平下，各農(nóng)藥回收率67.2%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.9%～18.2%；在20 μg/kg添加水平下，各農(nóng)藥回收率73.7%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.6%～12.2%；在100 μg/kg添加水平下，各農(nóng)藥回收率83.0%～101.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%～8.4%；在200 μg/kg添加水平，各農(nóng)藥回收率90.2%～111.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2%～3.3%。除殺螟硫磷在200 μg/kg回收率(111.3%)略高于GB/T 27404—2008[20]要求(0.2 mg/kg添加水平，80%～110%)外，其他農(nóng)藥在10～200 μg/kg添加水平下，均符合公告要求。該方法各農(nóng)藥定量為0.01 mg/kg，檢出限小于0.001 mg/kg，能滿(mǎn)足GB 2763—2019中大米中農(nóng)藥限量檢測(cè)的要求，可應(yīng)用于大米中限量農(nóng)殘的日常檢測(cè)工作中。

表3 大米中25種農(nóng)殘及其代謝物加標(biāo)回收率

2.4 大米實(shí)際樣品的測(cè)定

采用開(kāi)發(fā)的保護(hù)劑基質(zhì)內(nèi)標(biāo)方法(GC-MS/MS)對(duì)15個(gè)市售的大米樣品進(jìn)行測(cè)試分析，農(nóng)殘檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。除稻瘟靈、甲基嘧啶磷、三唑磷外，其他限量農(nóng)殘留均未檢出，檢出值遠(yuǎn)低于限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763—2019)。

表4 市售大米樣品中25種農(nóng)殘及其代謝物的測(cè)定

3 結(jié)論

基于氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù)，建立了同時(shí)檢測(cè)大米中25種農(nóng)藥及其代謝物殘留的方法，樣品經(jīng)提取、鹽析、凈化，加保護(hù)劑，上機(jī)測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，可批量處理，準(zhǔn)確度和精密度滿(mǎn)足方法學(xué)要求，方法的定量限低于食品安全標(biāo)準(zhǔn)大米中農(nóng)藥最大殘留限量的要求，適用于批量大米樣品中農(nóng)藥殘留的日常定量分析，為保障我國(guó)大米質(zhì)量安全提供參考。