韓世明,李 志,2 *,王月霞,方玉梅
(1.六盤水市師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,貴州 六盤水 553004;2.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心果蔬實驗室,貴州 六盤水 553000)
獼猴桃(Actinidia chinensisPlanch)又名藤梨、羊桃、木子,為側(cè)膜胎座目,獼猴桃科,獼猴桃屬,獼猴桃種,落葉藤本植物[1-3],獼猴桃果汁多、風(fēng)味宜人,富含維生素C(vitamin C,VC)、氨基酸、多糖、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[4-5],具有提升免疫功能、治療肝臟疾病、消化不良、抑制腫瘤等功效,對人體健康具有促進作用[6],因此深受消費者喜愛。果農(nóng)為提高獼猴桃產(chǎn)量,農(nóng)藥在其生長過程中被廣泛應(yīng)用于病、蟲、草害等防治,因存在農(nóng)藥不合理使用的問題,獼猴桃中存在農(nóng)藥污染風(fēng)險。因此,建立獼猴桃中農(nóng)藥殘留量的快速檢測方法,對于保證獼猴桃的質(zhì)量安全具有重要作用。
有機磷農(nóng)藥是我國目前使用范圍最廣、藥用最大的農(nóng)藥。作為殺蟲劑、除草劑、殺真菌劑[7-8],有機磷農(nóng)藥具有廣譜、高效、用量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域,但與此同時產(chǎn)生的環(huán)境問題也日益嚴重。目前,有機磷農(nóng)藥的檢測方法主要有拉曼光譜法、免疫分析法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS),其中LC-MS和GC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用最廣[9-10],其具有分析范圍廣、分離能力強、檢測限低、分析時間快和自動化程度高等優(yōu)點,已成為農(nóng)藥殘留分析的重要方法之一。較傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測方法,QuEchERS(quick,easy,chenp,effective,rugged,safe)前處理方法具有凈化效果好、重復(fù)性強、靈敏度高等優(yōu)勢,能有效消除基質(zhì)干擾,減少假陽性的檢出率,簡化樣品的前處理,降低分析成本。近年來,國內(nèi)外已有關(guān)于QuEChERS方法作為農(nóng)獸藥殘留檢測的前處理方法的文獻報道,蔣曉勤等[11]采用QuEChERS法萃取-氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定果蔬中58種農(nóng)藥殘留;王興寧等[12]采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,UHPLC-Q-Orbi trap HRMS)法快速檢測果蔬中84種除草劑殘留;HAN M等[13]采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中48種農(nóng)藥殘留。
目前,關(guān)于獼猴桃農(nóng)藥殘留檢測報道主要以NY/T761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》的氣相色譜法為主,還鮮見以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析檢測獼猴桃中的農(nóng)藥殘留的文獻報道。因此,本研究通過對獼猴桃樣品中15種有機磷農(nóng)藥的提取、凈化條件進行考察和優(yōu)化以改良QuEchERS前處理法,并結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法,建立了同時快速檢測獼猴桃中15種有機磷農(nóng)藥殘留的方法,并將其應(yīng)用于市售獼猴桃樣品的篩查檢測,為確保獼猴桃質(zhì)量安全提供有效的檢測方法。
獼猴桃(六盤水紅心獼猴桃)(編號為1#~20#):市售。乙腈、甲苯(均為色譜純):德國Merck公司;丙酮、正己烷、乙酸乙酯(均為色譜純):美國Fisher公司;無水硫酸鈉、氯化鈉(均為分析純):廣州化學(xué)試劑有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(graphitized carbon black,GCB)(均為分析純):日本Shimadzuac公司;環(huán)氧七氯(1 000 μg/mL,1.0 mL)、敵敵畏、對硫磷、喹硫磷、苯硫磷、治螟磷、三唑磷、久效磷、速滅磷、益棉磷、保棉磷、乙拌磷、除線磷、滅線磷、丙溴磷、毒死蜱標準品(均為100 μg/mL,1.2 mL):北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。
GC-MS/MS-TQ8040三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(配AOC-20i+s自動進樣器):日本島津公司;Q24RC快速組織低溫破碎勻漿儀:北京昊諾斯科技有限公司;XPR分析天平:瑞士梅特勒-托利多公司;XH-B旋渦混合器:上海鴻志實驗儀器有限公司;MultifugePro高性能通用臺式離心機:賽默飛世爾科技實驗室產(chǎn)品;RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:濟南禾普儀器設(shè)備有限公司;WIGGENS氮吹儀:維根技術(shù)(北京)有限公司。
1.3.1 樣品的制備及QuEChERS樣品前處理
于20份獼猴桃樣品中隨機選取無腐爛的獼猴桃,用研磨儀粉碎成獼猴桃汁后裝入潔凈的盛樣容器中,放入2~4 ℃環(huán)境中備用。
QuEChERS前處理:稱取10.0 g(精確至0.001 g)獼猴桃汁于50mL離心管中,加入10mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V),旋渦振蕩提取10 min,加入氯化鈉10 g,再旋渦振蕩提取5 min,將離心管放入離心機,以6 000 r/min離心8 min,取上清液5 mL,加入稱有最佳配比的PSA、GCB、C18、無水硫酸鎂的離心管中,旋渦振蕩混勻,以8 000 r/min離心10 min。取全部上清液于試管中置于38 ℃氮吹至近干,加入0.1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的環(huán)氧七氯內(nèi)標溶液,用乙酸乙酯定容至1 mL,過0.22 μm有機相微孔濾膜,供GC-MS/MS分析。
1.3.2 標準溶液的配制
環(huán)氧七氯內(nèi)標溶液的配制:準確量取100 μL于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的環(huán)氧七氯儲備液,于2~4 ℃冷藏保存。
15種混合農(nóng)藥標準儲備液的配制:分別隨機選取10種農(nóng)藥,各量取1 mL于10 mL容量瓶中并于38 ℃氮吹至近干后,再量取剩余5種農(nóng)藥各1 mL于容量瓶中,并用正己烷定容至刻度,即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合農(nóng)藥標準儲備液,于2~4 ℃冷藏保存。
15種農(nóng)藥基質(zhì)混合標準工作溶液的配制:按照1.3.1方法前處理不含目標農(nóng)藥的“空白”獼猴桃樣品,即得空白基質(zhì)提取液,分別精密移取10 μg/mL混合農(nóng)藥標準儲備液于進樣瓶中,加入環(huán)氧七氯內(nèi)標液,用空白基質(zhì)提取液定容,得到稀釋至質(zhì)量濃度為0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50 μg/mL和1.00 μg/mL的系列混合標準工作溶液,其中分別含內(nèi)標環(huán)氧七氯1 μg/mL。
1.3.3 氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜分析條件
色譜條件:Rxi-5SilMS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);載氣為高純氦氣(He)(純度≥99.999%);柱溫的升溫程序為初始溫度50 ℃,保留1 min,以25 ℃/min升溫至150 ℃,保留3 min,再以10 ℃/min升溫至300 ℃,保留7 min;載氣控制方式為恒線速度;不分流進樣;進樣口溫度280 ℃;線速度19.45 cm/s;溶劑延遲時間3 min;柱流量1.78 mL/min,進樣量1 μL。
質(zhì)譜條件:電離方式為電子電離(electronic ionization,EI)源;電子能量70 eV;接口溫度290 ℃;碰撞氣為氬氣(Ar)(純度≥99.999%);檢測器電壓(相對于調(diào)諧結(jié)果)0.5 kV;掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式,具體參數(shù)見表1。
表1 環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥組分的CAS號和多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 CAS number and multiple response monitoring parameters of heptachlor epoxy and 15 pesticide components
1.3.4 不同提取溶劑對各組分回收率的影響
農(nóng)藥種類繁多,根據(jù)不同農(nóng)藥的性質(zhì)選擇不同提取溶劑對分析結(jié)果的準確性至關(guān)重要[14-18]。因一些樣品成分復(fù)雜,用單一溶劑提取樣品中農(nóng)藥殘留效果不佳,需要幾種溶劑混合提取才能滿足農(nóng)藥分析。以回收率為考察指標,按照QuEChERS前處理方法對農(nóng)藥常用提取溶劑(二氯甲烷、乙腈、乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V))的提取效果進行考察。
1.3.5 不同凈化方法對各組分回收率的影響
農(nóng)藥殘留檢測中常用到的凈化劑有乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(GCB)、無水MgSO4等[19-21]。由于獼猴桃樣品基質(zhì)比較復(fù)雜,富含糖類、蛋白質(zhì)、色素等成分,本試驗選取3種組合吸附劑作為獼猴桃樣品提取液凈化劑,分別為25 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB+100 mg無水MgSO4(A組)、50 mg PSA+100 mg C18+20 mg GCB+200 mg無水MgSO4(B組)、100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4(C組)作對比試驗,考察凈化劑對農(nóng)藥回收率的影響。
1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)考察
在農(nóng)藥殘留分析中基質(zhì)效應(yīng)普遍存在,會對農(nóng)藥殘留分析方法的準確度、靈敏度、重復(fù)性等產(chǎn)生影響,表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或增強效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)越接近1,則基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果影響越小,反之亦然。以目標物(農(nóng)藥)的質(zhì)量濃度與內(nèi)標物(環(huán)氧七氯)質(zhì)量濃度的比值和對應(yīng)目標物(農(nóng)藥)峰面積與內(nèi)標物(環(huán)氧七氯)峰面積的比值繪制標準曲線,以峰面積比(y)為縱坐標,以質(zhì)量濃度比(x)為橫坐標,繪制標準曲線,分別得到基質(zhì)匹配校準線性方程和溶劑標準線性方程?;|(zhì)效應(yīng)的計算[22-24]公式如下:
1.3.7 方法的檢出限與定量限
以標準曲線最低點工作液稀釋10倍后上機分析,以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限[25],以信噪比為10(S/N=10)計算定量限[26]。
1.3.8 方法的加標回收率與精密度試驗
選取空白獼猴桃樣品基質(zhì)進行加標回收試驗,分別準確添加5 μg/kg、50 μg/kg和100 μg/kg的3個水平濃度的15種有機磷農(nóng)藥混合標準溶液,按照1.3.1 QuEChERS前處理,每個添加水平做6次重復(fù)試驗,計算其加標回收率、相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。
環(huán)氧七氯內(nèi)標及15種混合農(nóng)藥標準品、獼猴桃樣品中環(huán)氧七氯及15種混合農(nóng)藥的GC-MS分析總離子流色譜圖(total ions chromatogram,TIC)見圖1。
圖1 環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥標準品(A)、獼猴桃樣品中環(huán)氧七氯及15種農(nóng)藥(B)的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 1 Total iron chromatogram of heptachlor epoxy and 15 pesticides standards (A),heptachlor epoxy and 15 pesticides in kiwifruit samples (B) analyzed by GC-MS
不同提取溶劑對15種農(nóng)藥回收率的影響見圖2。由圖2可知,以乙腈、二氯甲烷、乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V)分別作為QuEChERS法萃取溶劑時,其平均回收率分別是83.91%、86.72%、91.93%,均滿足農(nóng)藥殘留痕量分析要求。研究表明,二氯甲烷毒性相對較大,長期接觸不利于實驗人員的健康;單一溶劑乙腈提取效果沒有混合溶劑乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V)提取效果好,所以選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V)作為QuEChERS前處理法的提取溶劑。
圖2 不同提取溶劑對15種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on recovery rate of 15 pesticides
不同凈化方法對15種農(nóng)藥回收率的影響見圖3。由圖3可知,隨著凈化劑用量的增加,獼猴桃中15種農(nóng)藥的回收率逐漸增大,其中A組、B組、C組的平均回收率分別為84.85%、87.47%、93.63%,且C組凈化樣品溶液越清澈,對儀器色譜柱及離子源污染較小,所以選擇C組(100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4)的凈化劑配比進行樣品凈化。
圖3 不同凈化方法對15種農(nóng)藥回收率的影響Fig. 3 Effect of different purification methods on recovery rate of 15 pesticides
15種農(nóng)藥在獼猴桃中的基質(zhì)效應(yīng)見表2。由表2可知,基質(zhì)效應(yīng)對治螟磷、益棉磷、丙溴磷、除線磷、毒死蜱分析結(jié)果影響較小,但對其他農(nóng)藥分析結(jié)果存在基質(zhì)抑制或增強效應(yīng),為了避免基質(zhì)效應(yīng)對農(nóng)藥分析結(jié)果產(chǎn)生影響,試驗中可采用空白基質(zhì)溶液匹配標準曲線,加入分析保護劑、鹽析等方法降低基質(zhì)效應(yīng)對試驗結(jié)果的影響[27-28]。本試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線法降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
表2 15種農(nóng)藥在獼猴桃中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of 15 pesticides in kiwifruit
2.5.1 方法的線性回歸方程、檢出限及定量限
15種農(nóng)藥的標準曲線的線性回歸方程、檢出限及定量限見表3。由表3可知,15種農(nóng)藥在質(zhì)量濃度0.05~1.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2≥0.998,方法檢出限為0.001 2~0.326 5 μg/kg;方法定量限為0.004~1.088 μg/kg。符合GB/T27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》及農(nóng)業(yè)部公告2386號《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》中相應(yīng)參數(shù)要求,表明所建立的檢測方法科學(xué)可行,可用于實際樣品的檢測。
表3 15種農(nóng)藥的線性回歸方程、檢出限及定量限Table 3 Linear regression equation,detection limit and quantification limit of 15 pesticides
2.5.2 方法加標回收率及精密度試驗結(jié)果
由表4可知,空白獼猴桃樣品中15種農(nóng)藥的平均加標回收率為76.95%~101.2%,精密度試驗結(jié)果相對標準偏差(RSD)為0.21%~10.05%,符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》痕量殘留分析要求。
表4 加標回收率及精密度試驗結(jié)果(n=6)Table 4 Results of spiked recovery rate and precision tests (n=6)
續(xù)表
以上述建立的方法檢測20份市售獼猴桃中的15種農(nóng)藥殘留,結(jié)果見表5。由表5可知,共有15個獼猴桃樣品中檢出了14種農(nóng)藥殘留。根據(jù)國標GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定農(nóng)藥最大殘留限量(maximum residue limits,MRLs)對檢測結(jié)果進行判定。15種農(nóng)藥殘留中,有10種農(nóng)藥在國標GB 2763—2021中有農(nóng)藥最大殘留限量值的相應(yīng)規(guī)定,這10種農(nóng)藥雖在不同獼猴桃樣品中有檢出呈陽性,但其值均未超過相應(yīng)國標規(guī)定最大殘留限量值(MRLs);剩余5種農(nóng)藥未有最大殘留限量值(MRLs)規(guī)定的農(nóng)藥品種不作判斷。其中苯硫磷在20份獼猴桃樣品均未檢出。
表5 獼猴桃樣品中15種農(nóng)藥的檢測結(jié)果Table 5 Determination results of 15 pesticides in kiwifruit samples
本研究以獼猴桃為檢測對象,建立了改良QuEChERS法結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法快速檢測獼猴桃中15種有機磷農(nóng)藥殘留的分析檢測方法,通過對試驗條件的選擇和優(yōu)化,最終采用乙腈-乙酸乙酯(1∶1,V/V)作為提取溶劑,凈化條件為100 mg PSA+200 mg C18+40 mg GCB+300 mg無水MgSO4(C組),空白基質(zhì)配標,保留時間、特征離子及其相對豐度定性,內(nèi)標法定量。在此優(yōu)化前處理條件下,其平均加標回收率為76.95%~101.2%,精密度試驗結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為0.21%~10.05%,方法檢出限為0.001 2~0.326 5 μg/kg,定量限為0.004~1.088 μg/kg。該方法具有凈化效果好、重復(fù)性強、靈敏度高等優(yōu)勢,在分析獼猴桃等復(fù)雜樣品時,能有效消除基質(zhì)干擾,減少假陽性的檢出率,簡化樣品的前處理,降低分析成本,可以滿足批量獼猴桃樣品中多農(nóng)藥殘留檢測的要求。