王茜月 管飄萍 陳詩涵 黃紫貝 郭鑫 趙以恒 羅健雅 王欣宇 崔顥月 劉金彪 王海燕 劉文博

摘要：從池塘中分離、純化了1株具有極強溶血活性的革蘭氏陰性桿菌BB2，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈灰色、半透明圓形，經16S rRNA基因序列分析確定為色桿菌屬，但無法確定到種;進一步全基因組測序結果表明，該菌株與GenBank中唯一的1株稻根色桿菌基因組同源性最高，但生物學特性又不一致。文獻逆索發(fā)現(xiàn)其命名為稻根色桿菌主要是由于其分離于水稻根部，這對分類造成了困惑。最終依據(jù)細菌形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和全基因組序列分析及文獻分析等綜合信息，確定分離菌BB2為溶血色桿菌，這提醒研究者們在細菌鑒定時應謹慎使用GenBank數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù)，一定要對相關參考文獻進行全面認真研讀，獲取必要的證據(jù)，為最終分類提供科學依據(jù)。本研究也為進一步研究該分離株的生物學特性和應用提供了參考和基礎。

關鍵詞：池塘;溶血色桿菌;全基因組序列;比較基因組分析

中圖分類號：S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0042-09

收稿日期：2021-08-16

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程（2018）。

作者簡介：王茜月（1999—），碩士，江蘇泰州人，主要從事傳染病流行病學研究。E-mail：Bioyusy@outlook.com。

通信作者：劉文博（1975—），男，博士，副教授，主要從事傳染病防控。E-mail：lwb@yzu.edu.cn。

溶血色桿菌，屬于色桿菌屬（Chromobacterium），革蘭氏染色陰性，可以在多種類型的瓊脂平板上生長（羊血瓊脂、巧克力平板培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、木炭酵母提取物培養(yǎng)基），菌落呈灰色、圓形。在血瓊脂平板上呈現(xiàn)出大約5 mm的明顯溶血區(qū)[1-3]。目前，色桿菌屬共有14個成員，分別是稻根色桿菌[4]、鏈烷烴色桿菌[5]、亞馬遜色桿菌 [6]、水生色桿菌 [7]、氟色桿菌[8]、紫色色桿菌 [9]、魚腥草色桿菌 [9]、偽紫色色桿菌[9]、溶血色桿菌 [1]、沼澤色桿菌 [10]、瞼炎色桿菌 [10]、痘苗色桿菌 [11]、球形色桿菌 [11]和枯草色桿菌 [12]。其中，紫色色桿菌和溶血色桿菌因可以引起哺乳動物感染而受到重視[ 13-14]。由于溶血色桿菌的一些分離株能夠感染人類，引起壞死性筋膜炎[1]、直腸結腸炎[15]和肺炎[3]，故有必要對該菌進行更深入的研究。溶血色桿菌對β-內酰胺類抗生素有較大的耐藥性[ 15]。有報道稱，溫帶地區(qū)的河水是人感染溶血色桿菌的主要來源[2]。

16S rRNA基因因其保守性和穩(wěn)定性，成為微生物分類鑒定中的重要分子標記[16]，但這種方法在區(qū)分相似性很高的菌種時有局限性，全基因組分析的方法或許可以克服這一缺點[17-18]，高通量測序技術的發(fā)展為微生物分類提供了新的方法和思路。平均核苷酸同源性方法具有方便、錯誤率低、分辨率高的特點，該方法通過計算2個基因組之間同源基因的相似性，認為ANI值接近或高于95%屬于同一菌種[19]。同時，有研究表明，ANI與DDH（一般認為DDH值接近或高于70%屬于同一菌種）具有較好的一致性。然而，由于成本等問題基因序列庫中全基因組數(shù)據(jù)比較少，可能會由于比對時數(shù)據(jù)缺少而造成分類錯誤。

本研究從池塘水樣中分離出1株溶血活性很強的細菌，確定為色桿菌屬，但在確定其種時卻因為數(shù)據(jù)、文獻問題造成了困惑，最終綜合其16S rRNA序列、全基因組序列、生物學特性和文獻綜合分析，確定為溶血色桿菌，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 生物安全柜購自Thermo公司;電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司;奧林巴斯顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;高壓滅菌鍋購自Tomy公司;PCR儀2720購自美國ABI公司;電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.1.2 主要試劑 血平板購自江門市凱林貿易有限公司;TSA瓊脂購自青島海博生物技術有限公司;16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 細菌分離、純化、16S rRNA 基因擴增

2019年8月，采集揚州大學文匯路校區(qū)農學大樓和獸醫(yī)學院大樓中間池塘內的水樣，4 000 r/min離心后取上清液，接種于含有10%血清的血平板中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落，接種血平板、TSA等進行菌落特性研究，連續(xù)純化3代，對單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，擴增16S rRNA基因，送往擎科生物技術公司測序。

1.3 16S rRNA 基因序列比對

基于EZBioCloud 16S數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/），對細菌進行 16S rRNA基因比對，使用MEGA-X軟件，構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹進行遺傳進化分析。

1.4 基因組DNA的提取

挑取單個菌落，提取高質量基因組DNA，利用Nanodrop、Quibit和 0.35% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送武漢貝納科技服務公司測序。

1.5 基因組測序和組裝

對Nanopore測序儀測得的原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除接頭、短片段及低質量數(shù)據(jù)。使用unicycler （0.4.8）[20]軟件對過濾后的reads進行組裝。使用bwa[21]軟件將二代測序illumina短序列比對到拼接完成的基因組上，使用minimap2將3代測序的長序列比對到拼接完成的基因組上，使用samtools depth工具，以2 000 bp為一滑窗在基因組上滑動，統(tǒng)計平均測序深度。通過Prokka軟件對組裝后的基因組進行編碼基因預測。利用預測得到的基因組信息，如基因組測序深度、GC分布及基因組結構注釋進行整合，用R包circlize繪制基因組圈圖。將全基因組序列信息上傳NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為CP061849。

1.6 基因組成分初步分析

通過PHAST軟件來預測前噬菌體基因[22];通過RepeatMasker軟件對基因組進行重復序列預測[23];通過IslandView4網(wǎng)站預測基因組中存在的基因島[24]。

1.7 抗性基因預測

通過Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）[25]數(shù)據(jù)庫對細菌的抗性基因進行篩查，獲得基因的抗性類型、抗性譜等詳細信息，預測細菌的耐藥基因。

1.8 比較基因組分析

1.8.1 全基因組序列比較及共線性分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找色桿菌屬可獲得全基因組序列的菌株，包括稻根色桿菌（C. rhizoryzae JP2-74）、溶血色桿菌（C. haemolyticum CH06-BL）、紫色色桿菌（C. violaceum ATCC 12472）、痘苗色桿菌（C. vaccinia 1-1）的基因組信息，與分離菌的基因組序列直接進行比較分析，統(tǒng)計基因組基本特征，計算平均核苷酸同源性（ANI）及DNA-DNA雜交值（DDH）。采用Mauve軟件，構建參考菌株和分離菌的全基因組序列共線性比對[26]。

1.8.2 基因家族比較分析 利用OrthoVenn2在線工具[27]（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/）對分離菌和“1.8.1”節(jié)所選參考菌株的蛋白序列進行直系同源聚類分析（參數(shù)：e-value≤1×10-5，Inflation value≤1.5）。

2 結果與分析

2.1 細菌分離、純化和16S rRNA 基因擴增

從池塘水樣中劃線分離培養(yǎng)出不同菌落形態(tài)的多種細菌，其中有1種細菌在TSA培養(yǎng)基上呈灰色、半透明的圓形菌落（圖1），多次純化后，該菌可以在血瓊脂平板上產生非常明顯的溶血環(huán)（圖2），符合溶血色桿菌的形態(tài)學特點和溶血特性。16S rRNA 基因擴增成功。

2.2 16S rRNA 基因序列比對結果

通過擴增細菌的16S rRNA基因并測序得到其序列，進行BLAST比對，結果表明為色桿菌屬，下載相關的16S rRNA基因進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)該細菌的16S rRNA基因序列與Chromobacterium haemolyticum MDA0585、Chromobacterium rhizoryzae LAM1188、Chromobacterium alkanivorans IITR-71、Chromobacterium aquaticum CC-SEYA-1較為接近，相似度分別為99.38%、99.30%、99.09%、98.56%。將分離到的細菌命名為BB2，遺傳進化樹見圖3。

2.3 測序結果統(tǒng)計并繪制基因組圈圖

高通量測序儀測序得到5 635 123條序列，過濾后得到5 625 367條序列，二代測序平均測序深度為321.35 X，三代測序平均測序深度約為154.41 X。過濾后細菌基因組總長度為5 30 650，GC含量為63.09%，基因組中重復序列含量極少，總長為 59 951 bp，占基因組序列全長的1.15%。經預測，細菌基因組含有4 859個編碼基因，4 690個CDS，87個tRNA，25個rRNA，1個tmRNA，繪制基因組圈如圖4所示。

2.4 基因組成分初步分析

2.4.1 前噬菌體分析 PHASTER預測結果顯示，分離菌中含有5個完整的前噬菌體，分離菌作為溶源性細菌，與病原菌共同培養(yǎng)時，前噬菌體可能會從宿主染色體上切割下來，大量復制，成為成熟的噬菌體，通過噬菌體的傳染，導致病原菌裂解、死亡。分離菌還含有4個非完整的前噬菌體，分別含有19、12、20、14個CDS，可能是在此發(fā)生了基因突變，導致產生了非完整的前噬菌體。此外，分離菌還存在1個有爭議的前噬菌體，含有21個CDS。具體情況見表1。

2.4.2 基因島預測 基因島通常被認為通過水平轉移獲得，這些區(qū)域常包含抗生素抗性及毒力相關基因?；驆u預測對細菌的進化分析，以及在進化過程中可能獲得的特異功能的研究有重要意義。分離菌的全基因組中共預測到了37個基因島，其中，IslandPath-DIMOD方法預測到15個基因島，SIGI-HMM方法預測到16個基因島，IslandPick方法預測到6個基因島，這些基因島可能對細菌適應不同的環(huán)境和抗生素耐藥性有重要作用。預測結果見圖5。

2.5 抗性基因預測結果

根據(jù)CARD抗性基因數(shù)據(jù)庫預測結果，該菌株含有adeF外排泵和抗生素靶點改變機制（抗磺胺類藥物）。

2.6 比較基因組分析

2.6.1 全基因組序列比較分析 由表2可見，分離菌的基因組大小和GC含量與C.rhizoryzae JP2-74和C.haemolyticum CH06-B較為接近，C. violaceum ATCC 12472與其他菌株基因組基本特征差異較大。一般認為ANI值接近或高于95%劃分為同一菌種[16]，令人驚訝的是，按照此標準，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C.haemolyticum CH06-BL均屬于同一菌種，而和C. violaceum ATCC 12472及C. vaccinia 1-1顯然不屬于同一菌種。DDH預測值認為物種邊界的閾值為70%左右，高于70%被認為屬于同一菌種[19]，DDH值預測結果與ANI值的結果具有一致性。

通過共線性分析可以進一步識別菌種全基因組的一致性和變異性，體現(xiàn)基因組的共同起源。分離菌與4株參考菌株的共線性分析結果見圖6。由圖6可見，分離菌與C. rhizoryzae JP2-74、C. haemolyticum CH06-BL存在大量同源性區(qū)域，但也存在缺失、插入和重排區(qū)域，與C. violaceum ATCC 12472、C. vaccinia 1-1差異較大。

2.6.2 直系同源聚類分析 OrthoVenn2 直系同源聚類分析結果顯示，共得到5 324個基因簇，2 462個同源基因簇（至少包含2個物種）以及2 862個單拷貝基因簇。由圖7可以看出，5株菌的共有基因簇（核心基因簇）有2 898個，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C. haemolyticum CH06-BL的共有基因簇較多，和C. vaccinia 1-1的共有基因簇較少。相似矩陣熱圖（圖8）也顯示，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C. haemolyticum CH06-BL具有較高的聚類。

以上結果均表明全基因組分類方法可以區(qū)分溶血色桿菌、紫色色桿菌和痘苗色桿菌。雖然溶血色桿菌和稻根色桿菌在基因組的組成上極為相似，單靠全基因組測序分析方法仍無法做出判斷，但是由于稻根色桿菌目前僅有從水稻根部分離出的報道[4]，且基因庫中相關的全基因組序列很少，進一步進行文獻綜合分析，結合分離菌的細菌生物學特征和極強的溶血特性，認為BB2應該屬于溶血色桿菌。

3 討論

通過16S rRNA基因序列和遺傳關系鑒定細菌、確定菌種已成為常用的細菌分類手段，但其分類僅僅能夠到屬，無法確定到種，現(xiàn)在很多研究者對該方法的原理并不清楚，在GenBank進行BLAST，同源性最高的就確認到種，這種文章現(xiàn)在越來越多，但并未深究其因。然而，GenBank中的數(shù)據(jù)均為測定者上傳，全面性和準確性值得商榷，且其分類依據(jù)也是依賴于以往的基因庫，這就造成了以訛傳訛的后果。16S rRNA序列作為細菌分類的依據(jù)，一般分別以97%和95%作為劃分一種新種和新屬的依據(jù)[28]，2006年劃分新種的標準被提高到了98.7%[29]，這一標準和DDH結果有較好的一致性[30]。但是僅僅依賴于16S rRNA基因序列不能夠確定到種，只能作為參考。本研究中細菌純化后測定的序列表明分離株BB2為色桿菌屬。基于EZBioCloud 16S 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/）對該分離株的16S rRNA基因進行比對以鑒定菌種，結果發(fā)現(xiàn)該細菌的16S rRNA基因序列與Chromobacterium haemolyticum MDA0585、Chromobacterium rhizoryzae LAM1188、Chromobacterium alkanivorans IITR-71、Chromobacterium aquaticum CC-SEYA-1較為接近，相似度分別為99.38%、99.30%、99.09%、98.56%。確定分離菌屬于色桿菌屬，但無法確定菌種，這也體現(xiàn)出了16S rRNA序列比對在區(qū)分同屬不同種細菌之間的局限性。

隨后的全基因組序列測定結果與GenBank中可獲得的色桿菌屬成員進行基因組比較分析，結果顯示，分離菌和唯一的1株稻根色桿菌Chromobacterium rhizoryzae LAM1188基因組特征最相似，遺傳關系很近。但是很多參考菌株并沒有測定全基因組序列，缺少大量的序列證據(jù)，無法對其進行種的確定，進一步回顧將稻根色桿菌確定為新種的報道[4]，發(fā)現(xiàn)其依據(jù)主要是表型、DNA-DNA雜交值和16S rRNA序列比對，其中，報道中用來比較的2株模式菌株稻根色桿菌C. rhizoryzae LAM1188和溶血色桿菌C. haemolyticum MDA0585 16S rRNA序列相似度為98.7%，這個值恰好是確定細菌為新種的邊界值，這說明16S rRNA序列比對在本研究中確實不能作為鑒定菌種的證據(jù)。該報道最終是以表型和DNA-DNA雜交試驗來確定菌種的，稻根色桿菌在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃褐色，但溶血色桿菌在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰色。本研究中分離菌BB2在TSA培養(yǎng)基上也呈現(xiàn)灰色，故最終確定BB2為溶血色桿菌。

在平常的菌種鑒定過程中，依據(jù)GenBank中的序列進行細菌分類，主要包括16S rRNA序列比對和基因組分析方法。但在本研究中，如果僅僅依據(jù)16S rRNA序列比對和基因組分析方法，很有可能會得出分離菌BB2屬于稻根色桿菌的錯誤結論。造成這種情況的原因可能有2點，一是稻根色桿菌和溶血色桿菌基因組組成極其相近;二是數(shù)據(jù)庫中登記信息有誤，實際上這株稻根色桿菌應是1株溶血色桿菌。因為稻根色桿菌的模式菌株基因組序列未見上傳，且由于生物材料缺乏，也無法進行 DNA-DNA 雜交試驗驗證，故具體原因仍待進一步探究。這提醒研究者們如果完全依據(jù)GenBank上的序列數(shù)據(jù)進行分類，不去考慮表型和生理生化特性，會造成偏差和錯誤，應依據(jù)細菌形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和全基因組等綜合分類，有困惑時一定要對相關參考文獻進行全面認真研讀，獲取必要的證據(jù)，做出準確判斷。已知溶血色桿菌能夠感染人類，稻根色桿菌僅有1篇報道，未有感染性報道。本研究為謹慎使用GenBank數(shù)據(jù)和文獻提供了一些證據(jù)，也為進一步研究該溶血色桿菌分離株提供了參考和基礎。

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