徐思琪 張世勇 陳校輝 王明華 鐘立強(qiáng) 李聯(lián)泰 邊文冀

摘要：為建立一種準(zhǔn)確和快速鑒定斑點(diǎn)叉尾遺傳性別方法，根據(jù)其性別連鎖SNP（single nucleotide polymorphism）位點(diǎn)，設(shè)計(jì)外圍引物、SNP特異性延伸引物和DNA探針。性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增終產(chǎn)物與DNA探針雜交，并應(yīng)用基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測(cè)試紙檢測(cè)性別連鎖SNP，從而實(shí)現(xiàn)遺傳性別分子水平的可視化鑒定。結(jié)果顯示，該方法能夠準(zhǔn)確地鑒定斑點(diǎn)叉尾的遺傳性別，與基于性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法所得結(jié)果一致，表明斑點(diǎn)叉尾性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)聯(lián)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸試紙能夠準(zhǔn)確、快速地完成斑點(diǎn)叉尾的遺傳性別鑒定。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾;遺傳性別鑒定;特異性引物延伸反應(yīng);性別連鎖SNP;免疫膠體金

中圖分類號(hào)： S965.128文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0189-05

收稿日期：2021-08-17

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（編號(hào)：PZCZ201741）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-46）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20191487）。

作者簡(jiǎn)介：徐思琪（1996—），女，吉林通化人，碩士研究生，研究方向?yàn)轸~(yú)類遺傳育種。E-mail：121972467@qq.com。

通信作者：張世勇，E-mail：shiyongzhang@hotmail.com;邊文冀，E-mail：js6060@sina.com。

斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）隸屬鲇形目科，原產(chǎn)于北美，是一種世界性淡水養(yǎng)殖魚(yú)類[1]。由于斑點(diǎn)叉尾對(duì)不同環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)能力，已引種至多個(gè)國(guó)家開(kāi)展人工養(yǎng)殖。我國(guó)于1984年首次引種斑點(diǎn)叉尾，此后30余年間，根據(jù)其生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的本土化研究，極大地促進(jìn)了我國(guó)斑點(diǎn)叉尾產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。斑點(diǎn)叉尾雌雄魚(yú)生長(zhǎng)具有較大差異，雌魚(yú)達(dá)到一定規(guī)格后，生長(zhǎng)減慢，卵巢發(fā)育加快，較大的卵巢組織一定程度上降低了其食用比例，導(dǎo)致雌魚(yú)的市場(chǎng)需求不高[3]。因此，為提高斑點(diǎn)叉尾養(yǎng)殖效益，有必要開(kāi)展全雄品種選育研究。

性逆轉(zhuǎn)是培育魚(yú)類全雄或全雌品種的必要途徑，性逆轉(zhuǎn)的開(kāi)展要求精準(zhǔn)的遺傳性別鑒定方法予以輔助。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在魚(yú)類中的應(yīng)用，已鑒別出大量魚(yú)類RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeats）、SNP（single nucleotide polymorphism）等性別特異性分子標(biāo)記。1991年，Devlin等采用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)首次獲得大鱗大馬哈魚(yú)（Oncorhynchus tshawytscha）性別特異分子標(biāo)記[4]。使用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[5]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[6]等;AFLP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有：三刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）[7]、金槍魚(yú)（Thunnus orientalis）[8]等;SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有：尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[9]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[10]、斑點(diǎn)叉尾[11]等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)地進(jìn)步，基于測(cè)序技術(shù)篩選性別特異性分子標(biāo)記已成為目前最主流的方法。近年，基于高通量測(cè)序技術(shù)陸續(xù)在大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）[12]、大口鲇（Silurus meridionalis）[13]、斑點(diǎn)叉尾[14]等物種中鑒定出多個(gè)性別連鎖SNPs標(biāo)記。根據(jù)魚(yú)類性別特異性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)出多種遺傳性別鑒定方法，但大部分性別鑒定方法耗時(shí)、耗力，且需要借助較為精密的儀器。

將性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)與基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測(cè)試紙相結(jié)合，鑒定魚(yú)類遺傳性別的方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于筆者所在課題組前期開(kāi)發(fā)的斑點(diǎn)叉尾性別連鎖SNP標(biāo)記[14]，設(shè)計(jì)SNP位點(diǎn)特異性延伸反應(yīng)引物，并聯(lián)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測(cè)試紙，首次建立了快速鑒定斑點(diǎn)叉尾遺傳性別方法。該方法不僅能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出斑點(diǎn)叉尾遺傳性別，還能夠?yàn)槠渌锓N遺傳性別鑒定方法的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的試驗(yàn)魚(yú)來(lái)自國(guó)家級(jí)江蘇斑點(diǎn)叉尾遺傳育種中心揚(yáng)中基地培育的斑點(diǎn)叉尾G3代選育群體。采集180日齡雌雄斑點(diǎn)叉尾各10尾，MS-222（Merck公司，德國(guó)）麻醉后解剖，根據(jù)其性腺記錄其性別信息，同時(shí)，剪取部分尾鰭組織于1.5 mL離心管中，加入無(wú)水乙醇保存。

1.2 基因組DNA提取

取20 mg尾鰭組織，剪碎后置于1.5 mL離心管中。使用DNA Isolation Mini Kit試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）提取基因組DNA，操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用Qubit熒光光度計(jì)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）評(píng)估DNA質(zhì)量，并在0.6%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其完整性。合格的DNA樣本于-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Primer BLAST在線軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增斑點(diǎn)叉尾性別連鎖SNP位點(diǎn)（scaffold99_205834 G>A）[14]的外圍引物（WF/WR）、特異性延伸引物（ASE）和DNA探針（ASE-DP）;使用Oligo軟件檢驗(yàn)ASE引物與DNA探針二級(jí)結(jié)構(gòu)間相互關(guān)系，避免產(chǎn)生二聚體。ASE引物3′端最后一個(gè)位點(diǎn)為雄性特異性堿基，5′端用6-羧基熒光素（6-FAM）熒光基團(tuán)標(biāo)記，DNA探針3′端用生物素（Biotin）標(biāo)記，引物及探針的合成和標(biāo)記委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列見(jiàn)表1。3FA4C0FF-2B1A-47A8-BBFA-EB7E822326D4

1.4 巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)

第1輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增斑點(diǎn)叉尾性別連鎖SNP位點(diǎn)（scaffold99_205834 G>A）。反應(yīng)總體系：40 μL，其中，2×Phanta Max Master Mix 0 μL（南京諾維贊生物科技有限公司）、模板DNA 1 μL、外圍引物（WF和WR）各1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，57～53 ℃（每個(gè)循環(huán)減1 ℃）退火30 s，72 ℃延伸60 s，每個(gè)退火溫度2個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，15 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

第2輪PCR反應(yīng)為性別連鎖SNP位點(diǎn)特異性引物延伸反應(yīng)，將第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍后用作第2輪PCR反應(yīng)的模板DNA。反應(yīng)總體系：20 μL，其中，2×Phanta Max Master Mix 10 μL、模板DNA 1 μL、ASE延伸引物（ASE）、DNA探針（ASE-DP）各1 μL、ddH2O 7 μL。第2輪PCR反應(yīng)分2步進(jìn)行，第1次擴(kuò)增：95 ℃，5 min;94 ℃30 s，66 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán);第2次擴(kuò)增：94 ℃30 s，50 ℃ 30 s，25 個(gè)循環(huán)。

1.5 遺傳性別鑒定結(jié)果判讀

本試驗(yàn)所用核酸檢測(cè)試紙及其配伍堿性緩沖液，均購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物科技有限公司。第2輪PCR完成后，滴加20 μL核酸檢測(cè)試紙配伍的堿性緩沖液于微孔板中，在核酸檢測(cè)試紙的樣品墊上滴加10 μL第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將已滴加擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測(cè)試紙插入含有緩沖液的100 μL微孔板中，保證樣品墊最下端與緩沖液接觸。上述過(guò)程完成后10～15 min內(nèi)對(duì)試紙顯色結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.6 遺傳性別鑒定準(zhǔn)確性驗(yàn)證

從斑點(diǎn)叉尾遺傳育種中心樣本庫(kù)中隨機(jī)選取96個(gè)樣本，應(yīng)用本研究鑒定的方法對(duì)96個(gè)樣本遺傳性別進(jìn)行鑒定，并將鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的性別信息進(jìn)行比對(duì)，以期檢驗(yàn)該方法準(zhǔn)確性。此外，應(yīng)用基于斑點(diǎn)叉尾性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法[15]對(duì)上述試驗(yàn)魚(yú)的遺傳性別進(jìn)行鑒定，并比較2種方法的鑒定結(jié)果。

1.7 第2輪PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對(duì)鑒定結(jié)果的影響

選擇遺傳性別為雄性的斑點(diǎn)叉尾DNA樣本，在進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)后，第2輪PCR反應(yīng)程序中第2次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)由25個(gè)循環(huán)逐次遞減5個(gè)循環(huán)，直至減少至0個(gè)循環(huán)，其他反應(yīng)程序不變。將巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物按照核酸檢測(cè)試紙顯色及判讀步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳性別鑒定方法

本研究建立的基于性別連鎖SNP位點(diǎn)特異性引物延伸反應(yīng)的斑點(diǎn)叉尾遺傳性別鑒定方法流程見(jiàn)圖 主要包括：SNP位點(diǎn)外圍引物擴(kuò)增、SNP位點(diǎn)特異性引物延伸反應(yīng)、延伸反應(yīng)產(chǎn)物與DNA探針雜交及顯色反應(yīng)等步驟。外圍引物（WF/R）擴(kuò)增主要完成SNP位點(diǎn)區(qū)間目的片段的大量富集，保證SNP位點(diǎn)特異性引物延伸反應(yīng)的有效性和準(zhǔn)確性。SNP位點(diǎn)特異性延伸反應(yīng)引物（ASE）的3′端為雄性特異堿基，5′端為6-FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記，引物能夠與雄性個(gè)體在該SNP位點(diǎn)特異性結(jié)合并完成擴(kuò)增反應(yīng)。DNA探針（ASE-DP）的3′端標(biāo)記有Biotin基團(tuán)，從而保證其不能夠完成擴(kuò)增反應(yīng)，僅起到與SNP位點(diǎn)特異性延伸反應(yīng)產(chǎn)物雜交的目的。核酸檢測(cè)試紙的檢測(cè)區(qū)能夠特異性地識(shí)別DNA探針與SNP位點(diǎn)特異性延伸反應(yīng)產(chǎn)物雜交產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)可直觀地呈現(xiàn)出不同斑點(diǎn)叉尾個(gè)體的遺傳性別信息。

2.2 遺傳性別鑒定結(jié)果及準(zhǔn)確性

本研究分別使用10尾雌雄個(gè)體，性別連鎖SNP位點(diǎn)特異性引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物與DNA探針的雜交產(chǎn)物在核酸檢測(cè)試紙上的顯色反應(yīng)見(jiàn)圖2。由圖2可知，雌雄個(gè)體在質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶，雄性個(gè)體在檢測(cè)區(qū)顯示紅色條帶，雌性個(gè)體在檢測(cè)區(qū)不顯色，鑒定結(jié)果與性別連鎖SNP位點(diǎn)測(cè)序圖譜一致。為驗(yàn)證本研究建立的斑點(diǎn)叉尾遺傳性別鑒定方法的準(zhǔn)確性，使用96份未知性別樣本對(duì)該方法進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明鑒定結(jié)果與96份樣本在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的性別信息一致，該遺傳性別鑒定方法準(zhǔn)確率為100%。

基于斑點(diǎn)叉尾性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法中，雌性個(gè)體的DNA分型結(jié)果具有1個(gè)峰值（192 bp），雄性個(gè)體的DNA分型結(jié)果具有2個(gè)峰值（186、192 bp），其中，186 bp峰值為雄性個(gè)體所特有。使用2種方法對(duì)96尾斑點(diǎn)叉尾個(gè)體的遺傳性別進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示2種方法的鑒定結(jié)果一致，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2-c。

2.3 第2輪PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對(duì)顯色反應(yīng)的影響

第2輪PCR反應(yīng)的第1次擴(kuò)增主要是對(duì)第1輪PCR反應(yīng)中剩余外圍引物的消耗，減少其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。因此，在其他反應(yīng)程序不變情況下，第2次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為25時(shí)檢測(cè)線最為清晰，隨著循環(huán)次數(shù)的依次遞減，檢測(cè)線顏色逐漸變淺，直至完全消失。

3 討論

在本研究之前，筆者所在課題組在斑點(diǎn)叉尾基因組中鑒定出多個(gè)性別連鎖SNP位點(diǎn)[14]，由于這些SNP位點(diǎn)均與雄性性別連鎖遺傳，因此，選擇其中1種，利用SNP特異性引物延伸反應(yīng)，并結(jié)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸試紙即可實(shí)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾遺傳性別的快速和準(zhǔn)確鑒定。

膠體金免疫層析技術(shù)因其具有高效、簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于藥殘[16]、毒素[17]、細(xì)菌[18]、病毒[19]等檢測(cè)。應(yīng)用膠體金技術(shù)研發(fā)的新型SARS-CoV-2抗原檢測(cè)試劑盒可用于COVID-19臨床血清檢測(cè)，為病毒早期篩查提供準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[20-22]。在應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)過(guò)程中，以氯金酸（HAuCl4）為還原劑，Au作為膠體顆粒，在堿性緩沖溶液中攜帶負(fù)電荷基團(tuán)，與Biotin單克隆抗體的正電荷基團(tuán)牢固結(jié)合，通過(guò)靜電作用形成金標(biāo)Biotin抗體。本試驗(yàn)中，雄性樣本在核酸檢測(cè)試紙的質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)均顯示紅色， 雌性樣本僅在質(zhì)控3FA4C0FF-2B1A-47A8-BBFA-EB7E822326D4

區(qū)顯色，而在檢測(cè)區(qū)不顯色，主要是因?yàn)樘禺愋匝由煲锏?′末端為雄性特異堿基，且5′端標(biāo)記6-FAM基團(tuán)， 該引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物與3′端標(biāo)記Biotin的DNA探針進(jìn)行雜交，形成同時(shí)包含Biotin和6-FAM的雙標(biāo)記雜交產(chǎn)物。該雙標(biāo)記雜交產(chǎn)物與固定在檢測(cè)區(qū)的6-FAM抗體特異性結(jié)合，同時(shí)大量募集金標(biāo)Biotin抗體，從而使檢測(cè)區(qū)顯示紅色條帶;固定于質(zhì)控區(qū)的Biotin同樣能夠大量募集金標(biāo)Biotin抗體，使質(zhì)控區(qū)也顯示紅色條帶。

假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生會(huì)嚴(yán)重干擾本試驗(yàn)建立的斑點(diǎn)叉尾遺傳性別鑒定方法的準(zhǔn)確性[23]。本方法在特異性延伸引物與DNA探針的設(shè)計(jì)過(guò)程，應(yīng)用Oligo軟件檢驗(yàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)間相互關(guān)系，防止由于形成二聚體而出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)。在SNP位點(diǎn)外圍引物延伸反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物適當(dāng)稀釋，從而降低第二輪PCR體系中外圍引物的濃度，同時(shí)通過(guò)第二輪PCR反應(yīng)的第1次擴(kuò)增對(duì)殘留引物再次消耗，最終保證第2次擴(kuò)增中SNP特異性延伸反應(yīng)順利進(jìn)行。

將雄性遺傳性別斑點(diǎn)叉尾個(gè)體逆轉(zhuǎn)為生理性別為雌性后，再與正常雄魚(yú)雜交，獲得的子代染色體類型包括：XX型（雌性）、XY型（雄性）、YY型（雄性），其中，YY型斑點(diǎn)叉尾與正常雌魚(yú)雜交后，子二代即為全雄斑點(diǎn)叉尾[24]。本研究建立的遺傳性別鑒定方法亦可應(yīng)用于XY型、YY型雄性斑點(diǎn)叉尾子代的篩選，將SNP位點(diǎn)特異性延伸引物3′端設(shè)計(jì)為雌性個(gè)體特異堿基，經(jīng)過(guò)特異性引物延伸反應(yīng)和核酸檢測(cè)試紙顯色反應(yīng)后，可快速鑒定出XY型子代。

4結(jié)論

本研究成功建立了一種斑點(diǎn)叉尾遺傳性別快速鑒定方法，通過(guò)性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)結(jié)合核酸檢測(cè)試紙完成對(duì)魚(yú)類遺傳性別的鑒定尚屬首次，整個(gè)過(guò)程僅數(shù)小時(shí)，且能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本。在斑點(diǎn)叉尾性別控制育種過(guò)程中，使用本研究建立的遺傳性別鑒定方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)性逆轉(zhuǎn)個(gè)體的快速篩選，也能夠?yàn)槠渌~(yú)類的遺傳性別鑒定技術(shù)開(kāi)發(fā)提供參考。

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