劉濤 程培蕾 趙坤坤 王麗君 蔣甲福

摘要：為研究藍(lán)光對(duì)夏菊生長發(fā)育的影響，并探究光質(zhì)影響菊花生長發(fā)育的分子機(jī)制，選用菊花優(yōu)香 [Chrysanthemum morflorium （Ramat.） Kitam.‘ Yuuka’]為試驗(yàn)材料，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)藍(lán)光照射組培苗后，對(duì)組培苗進(jìn)行表型觀察、葉綠素含量測(cè)定、石蠟切片制作及相關(guān)基因表達(dá)量分析，進(jìn)而從表觀、細(xì)胞、分子3個(gè)層面來觀察藍(lán)光照射對(duì)菊花的影響。結(jié)果表明，在組培苗生長前期，藍(lán)光處理會(huì)抑制菊花根的發(fā)育，而在后期該抑制作用減弱;同時(shí)藍(lán)光照射會(huì)使植株發(fā)生矮化，且葉片明顯變小，但植株總?cè)~片數(shù)并未改變。基于石蠟切片的結(jié)果顯示，藍(lán)光處理60 d后，植株較白光對(duì)照組，莖明顯變細(xì)，根變粗，葉片中柵欄細(xì)胞明顯變大;同時(shí)，在葉綠素含量方面，藍(lán)光照射對(duì)葉綠素含量的影響并不明顯;而在基因表達(dá)水平上，藍(lán)光處理會(huì)使光敏色素基因CmPHYA、CmPHYB、CmPHYC和隱花色素基因CmCRY1、CmCRY2的表達(dá)量升高，使CmCRY1.2的表達(dá)量下降。另外，藍(lán)光處理對(duì)開花調(diào)控基因CmCO的表達(dá)沒有明顯影響，但能誘導(dǎo)開花素基因CmFT1、CmFT2、CmFT3的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：菊花;藍(lán)光;石蠟切片;開花基因

中圖分類號(hào)：S682.1+10.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0150-06

收稿日期：2021-07-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31872146）。

作者簡介：劉 濤（1993—），男，山東青島人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事園藝作物組培、栽培、育種研究。E-mail：773018081@qq.com。

通信作者：蔣甲福，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事菊花遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail：jiangjiafu@njau.edu.cn。

菊花（Chrysanthemum morflorium）原產(chǎn)于我國，多為短日照植物，秋季開花，因其觀賞價(jià)值極高，深受人們的喜愛。作為世界四大切花之一，菊花的栽培生產(chǎn)遍布世界各地，且對(duì)其生長發(fā)育的研究也得到了人們的普遍重視。優(yōu)香作為菊花品種之一，表現(xiàn)為光周期不敏感，因此夏季即可開花[1]，其較為獨(dú)特的開花機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，不同光質(zhì)對(duì)植物生長發(fā)育所產(chǎn)生的影響是不同的，如紅光相對(duì)于藍(lán)光對(duì)葡萄的形態(tài)建成所起的作用更大[2];而在蝴蝶蘭組培苗方面的研究表明，不同光質(zhì)對(duì)植物組培苗的生長發(fā)育也會(huì)產(chǎn)生不同的影響[3]。當(dāng)然，在光質(zhì)影響菊花生長發(fā)育方面也有類似報(bào)道，如在菊花神馬中的研究表明，白光和紅光對(duì)菊花神馬的生長更加有利[4];Kim等研究表明，不同光質(zhì)對(duì)菊花組培苗的光合速率及氣孔數(shù)目有不同的影響[5];Jeong等研究表明，補(bǔ)加藍(lán)光對(duì)菊花的凈光合率及開花時(shí)間會(huì)產(chǎn)生影響[6]。然而在以上報(bào)道中，雖涉及藍(lán)光處理，但此類報(bào)道多集中在表型觀察方面，并未深入研究，且試驗(yàn)普遍選用秋菊，對(duì)于光周期不敏感的夏菊，并不能完全參考。另外，為進(jìn)一步探究光質(zhì)影響植物生長發(fā)育的分子機(jī)制，研究者發(fā)現(xiàn)了光敏色素、隱花色素以及向光素的存在，而光敏色素、隱花色素已有研究證實(shí)，其參與了植物的開花調(diào)控路徑[7-8]，且隱花色素作為一種藍(lán)光受體，在光信號(hào)感知及信號(hào)傳導(dǎo)過程中也起著重要作用[9]。

本試驗(yàn)以夏菊優(yōu)香為材料，為避免大田栽培過程中存在的環(huán)境差異，選用組培苗進(jìn)行光照處理。通過表型觀察、數(shù)據(jù)分析、石蠟切片制作及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)手段，對(duì)藍(lán)、白光處理后的差異進(jìn)行比較分析，旨在探究藍(lán)光處理對(duì)夏菊的影響機(jī)制，并希望借此對(duì)菊花的組培、栽培提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2017年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，材料夏菊[C. morflorium （Ramat.） Kitam.]品種優(yōu)香（Yuuka）取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花遺傳及分子育種實(shí)驗(yàn)室，取材后經(jīng)外植體消毒、植物組織培養(yǎng)等操作于組培瓶中培養(yǎng)，待組培苗長大后，取組培苗相同位點(diǎn)節(jié)間，轉(zhuǎn)置新組培瓶中，每瓶放3株，置于組培室中進(jìn)行光照處理。處理在LED（全白、全藍(lán)）燈光下進(jìn)行，處理時(shí)間維持2個(gè)月。處理過程中，組培室溫度恒定為25 ℃，白光、藍(lán)光光周期均為 16 h/8 h，光強(qiáng)度均為38 μmol/（m2·s）。處理結(jié)束后進(jìn)行如下取樣：葉綠色含量直接稱取新鮮葉片0.2 g進(jìn)行測(cè)定;石蠟切片制作取樣根、莖、葉置于酒精醋酸福爾馬林混合（FAA）固定液中固定，4 ℃冰箱保存;相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定取樣根、莖、葉、生長點(diǎn)，并置于液氮中進(jìn)行速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2 表型觀察

光照處理過程中觀察記錄組培苗生根數(shù)、生根長度、植株高度并拍照;光照處理60 d取組培苗統(tǒng)計(jì)單株葉片數(shù)，隨機(jī)選取組培苗5株，取每株最大葉片3張，進(jìn)行測(cè)量計(jì)算并拍照。

1.3 石蠟切片制作

將FAA固定液中固定的根、莖、葉取出，經(jīng)脫水、透明、滲蠟、包埋、切片等操作進(jìn)行石蠟切片制作[10]，并使用番紅固綠雙重染色法和固綠快速染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，封片后，顯微鏡下觀察各組織器官形態(tài)、大小。

1.4 葉綠素含量測(cè)定

取新鮮葉片0.2 g，加石英砂、碳酸鈣進(jìn)行研磨，隨后使用95%乙醇進(jìn)行萃取，并用分光光度計(jì)測(cè)量665、649、490 nm 3個(gè)波長下的吸光度，通過計(jì)算，求得葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量。

1.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

使用Trizol試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行總RNA的提取。取0.2 g左右根、莖、葉、生長點(diǎn)樣品在液氮中研磨，加入2 mL Trizol后按說明書步驟操作。其中在第1次三氯甲烷抽提后使用DNaseⅠ消化基因組DNA。提取的RNA溶于20 μL 無酶無菌水中。使用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)孫靜克隆得到的CmFT1（GenBank：AB545936.2）、CmFT2（GenBank：AB677317.1）、CmFT3（GenBank：AB679272）[11]設(shè)計(jì)定量引物（表1），根據(jù)夏菊優(yōu)香轉(zhuǎn)錄組庫序列分析（SRP029991），設(shè)計(jì)CmPHYA（AB733629）、CmPHYB（AB733630）、CmPHYC、CmCRY1.2（KC202424）、CmCRY1、CmCRY2（KJ463737）、CmCO（JQ693394）的定量引物（表1）。使用菊花Elongation Factor 1α （CmEF1α，KF305681）進(jìn)行cDNA 第1鏈檢測(cè)并作為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)比其他基因表達(dá)量的差異，內(nèi)參引物為CmEF1α-F和CmEF1α-R。定量PCR儀使用Mastercycler ep realplex S（Eppendorf），程序?yàn)椋?95 ℃ ?min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 0 s，40 個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后得到每個(gè)樣品的CT值，假定擴(kuò)增效率為100%，并假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之間的效率保持一致，采用2-ΔΔCT 法進(jìn)行相對(duì)定量分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型觀察

2.1.1 藍(lán)、白光處理不同階段根的生長情況

分別統(tǒng)計(jì)光照處理8、10、15 d藍(lán)、白光下組培苗生根數(shù)，并對(duì)光照處理10、60 d的根長度進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算平均值（表2）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，相對(duì)于白光，藍(lán)光處理下的組培苗在生長前期，其生根速度及根長度較對(duì)照明顯受到抑制，而在生長后期，該抑制逐漸消失，前期的抑制效果被逐漸彌補(bǔ)（圖1）。

2.1.2 藍(lán)、白光處理不同階段地上部分的生長情況

分別測(cè)量統(tǒng)計(jì)10、30、60 d優(yōu)香組培苗地上部分長度，并計(jì)算平均值（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)光照射下的組培苗較白光均明顯變矮，光照60 d藍(lán)光下植株僅為對(duì)照組高度的1/2（圖1）。

2.1.3 藍(lán)、白光處理后期植株葉片生長情況

光照處理60 d后， 統(tǒng)計(jì)組培苗的葉片數(shù)和葉面積（表4），

并拍照記錄（圖2）。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，夏菊優(yōu)香組培苗經(jīng)藍(lán)光處理60 d后，單株葉片總數(shù)保持不變，但葉面積較白光對(duì)照組明顯變小。

2.2 石蠟切片結(jié)果

光照處理60 d后，隨機(jī)選取藍(lán)、白光下各3株組培苗的成熟區(qū)根段、莖中段及葉面積最大的3張葉片，經(jīng)滲蠟、切片、番紅固綠雙重染色（葉片選用固綠快速染色法染色）后，置于顯微鏡下觀察根的最大直徑（圖3），莖的最大直徑（圖4），葉片的葉厚度及柵欄細(xì)胞厚度（圖5），進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，隨后計(jì)算各部位平均值，結(jié)果見表5。比較發(fā)現(xiàn)，夏菊優(yōu)香組培苗經(jīng)藍(lán)光處理60 d后，根變粗，莖顯著變細(xì)，葉厚度變厚而柵欄細(xì)胞長度顯著變長，柵欄組織厚度占葉片總厚度的比值明顯變大。

2.3 葉綠素含量測(cè)定

取藍(lán)、白光處理60 d組培苗葉片，使用分光光度法進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定。由表6可知， 藍(lán)光處理后，葉綠素b、類胡蘿卜素含量基本保持不變，僅葉綠素a含量略微升高。

2.4 色素基因組織相對(duì)表達(dá)量分析

取白光處理60 d組培苗根、莖、葉、生長點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)光敏色素基因CmPHYA、CmPHYB、CmPHYC，隱花色素基因CmCRY1.2、CmCRY1、CmCRY2的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖6可知，在菊花組培苗中各色素基因在不同部位的表達(dá)量是不同的，CmPHYA表達(dá)量最高的部位是莖和生長點(diǎn)，在根中表達(dá)量最低;CmPHYB表達(dá)量最高的部位是葉，最低部位是根;CmPHYC表達(dá)量最高的部位是莖，最低部位是根;CmCRY1.2表達(dá)量最高的部位是葉，最低部位是根;CmCRY1表達(dá)量最高的部位是葉，最低部位是根;CmCRY2表達(dá)量最高的部位是莖，最低部位是根。

2.5 葉片中色素基因相對(duì)表達(dá)量及藍(lán)光處理后表達(dá)量變化

取藍(lán)、白光處理60 d的組培苗葉片反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)光敏色素基因CmPHYA、CmPHYB、CmPHYC，隱花色素基因CmCRY1.2、CmCRY1、CmCRY2的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖7可知，在葉片中CmCRY1.2的相對(duì)表達(dá)量最高，CmPHYA的相對(duì)表達(dá)量最低。經(jīng)藍(lán)光處理后，除CmCRY1.2的相對(duì)表達(dá)量降低外，其他基因的相對(duì)表達(dá)量都有所增加。

2.6 藍(lán)、白光處理后開花調(diào)節(jié)基因相對(duì)表達(dá)量變化

取藍(lán)、白光處理60 d的組培苗葉片反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)開花調(diào)節(jié)基因CmFT1、CmFT2、CmFT3、CmCO的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。經(jīng)藍(lán)光處理后，CmFT1、CmFT3的相對(duì)表達(dá)量都明顯升高，為白光對(duì)照組的4倍左右;CmFT2相對(duì)表達(dá)量也有所升高， 但僅為白光對(duì)照組的2倍左右;而CmCO的相對(duì)表達(dá)量并沒有因藍(lán)光處理產(chǎn)生變化（圖8）。

3 討論與結(jié)論

不同光質(zhì)對(duì)植物的生長發(fā)育會(huì)產(chǎn)生不同的影響，眾所周知，對(duì)于綠色植物，綠色光照最不利于植物的生長，而紅光、紅藍(lán)光等對(duì)大多數(shù)植物的生長有促進(jìn)作用。相對(duì)于夏菊，不同光質(zhì)對(duì)秋菊的影響已基本清晰。然而夏菊作為一種對(duì)光周期不敏感的特殊品種，其受光質(zhì)的影響與秋菊是否一致還有待證實(shí)。秋菊的報(bào)道中顯示，藍(lán)光處理后秋菊31-12組培苗表現(xiàn)為植株變高，莖變粗，葉面積變大，生根數(shù)變多，根長度變長，葉綠素a、b、a+b含量均升高等[13]。本試驗(yàn)選用夏菊優(yōu)香作為供試材料，藍(lán)光處理后，夏菊優(yōu)香表現(xiàn)為植株矮化，莖粗變細(xì)，葉片數(shù)不變，葉面積變小，生根總數(shù)基本不變，根長度變長，葉綠素a含量略微升高等。由此可見，對(duì)光周期不敏感的夏菊，其在表型上對(duì)不同光質(zhì)的響應(yīng)與秋菊是不同的。因此在選擇夏菊組培及栽培的光質(zhì)時(shí)，應(yīng)與秋菊進(jìn)行區(qū)分。另外，有研究表明，葉片中柵欄組織的光合效率較海綿組織更高[14]。本試驗(yàn)在進(jìn)行石蠟切片制作時(shí)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光處理后，夏菊葉面積明顯變小，但葉平均厚度略微增加且葉片中柵欄組織厚度所占比重顯著增加，以上結(jié)果可從側(cè)面說明，植物為適應(yīng)環(huán)境變化造成的傷害（葉面積變?。?，可能通過提高柵欄組織厚度來保證光合效率和保證生命代謝的有序進(jìn)行。

有試驗(yàn)表明，光敏色素及隱花色素在植物的光信號(hào)接受及傳遞過程中扮演著重要的角色，廣泛參與植物各種生長、代謝路徑[15-16]。本試驗(yàn)為探究光質(zhì)對(duì)夏菊生長發(fā)育的影響，對(duì)夏菊優(yōu)香中光敏色素及隱花色素相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，除隱花色素CmCRY1.2的表達(dá)下降外，其他基因表達(dá)量均上升。這一結(jié)果顯示，光質(zhì)對(duì)植物的影響從光信號(hào)接收開始便已存在。

光敏色素基因及隱花色素基因表達(dá)量的變化，必然會(huì)影響其參與的信號(hào)調(diào)節(jié)路徑，如開花路徑[17]。對(duì)開花調(diào)節(jié)基因CmCO及開花整合因子CmFT1、CmFT2、CmFT3進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藍(lán)光處理后CmCO表達(dá)量無明顯變化，而CmFT1、CmFT2、CmFT3的表達(dá)量均明顯升高。這一結(jié)果可在分子層面上解釋關(guān)于秋菊白蓮經(jīng)藍(lán)光照射開花提前的現(xiàn)象[18]。

有報(bào)道稱，在擬南芥中PHYA能夠誘導(dǎo)CO表達(dá)，進(jìn)而通過上調(diào)FT促進(jìn)開花;PHYB通過抑制pFT表達(dá)和CO的表達(dá)延遲開花[7，19];在小麥中的研究表明，PHYC能夠通過誘導(dǎo)PPD1上調(diào)FT促進(jìn)開花[20]。另外，在擬南芥中，隱花色素CRY1、CRY2作為藍(lán)光受體[9]，在響應(yīng)藍(lán)光信號(hào)誘導(dǎo)CO表達(dá)的同時(shí)，也能主動(dòng)結(jié)合CIB 上調(diào)FT[19];而隱花色素CRY1.2由于是近年來剛從菊花中克隆得到，對(duì)其研究尚在進(jìn)行，所以該基因的功能尚不明確。本研究中，藍(lán)光照射作為一種光信號(hào)，直接導(dǎo)致光敏色素PHYA、PHYB、PHYC及隱花色素CRY1、CRY2的表達(dá)上調(diào)，有可能導(dǎo)致向光素PHOT、光敏色素PHYD、PHYE等其他感光基因表達(dá)量的變化，這些感光基因?qū)O的影響不同，有的促進(jìn)，有的抑制，所以最終導(dǎo)致CO的表達(dá)量未發(fā)生變化的機(jī)制還不清楚;而對(duì)FT表達(dá)量的影響，雖然PHYB抑制FT的表達(dá)，但也存在CRY結(jié)合CIB1而上調(diào)FT的作用，且還有其他感光基因的調(diào)控，最終導(dǎo)致FT表達(dá)量升高的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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