王愛媛 劉姝 吳衛(wèi)平 房輝 張雅中 呂月 韓曉東 張婷 唐文君 劉慶賢

(唐山市工人醫(yī)院 1內(nèi)分泌科，河北 唐山 063000；2神經(jīng)內(nèi)科；3心內(nèi)科；4中醫(yī)科；5腎內(nèi)科；6老年病科；7皮膚科)

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥。研究表明，腎小球足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)〔1〕，尋找有效的方法降低或抑制足細(xì)胞損傷對(duì)于糖尿病腎病的治療具有積極意義。桑白皮是雙子葉植物?？粕３ニㄆず蟮母稍锔ぃ哂醒a(bǔ)虛、活血祛瘀、化痰止嗽、生津止渴等作用。研究顯示，桑白皮黃酮提取物可防治2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝〔2〕，改善糖尿病小鼠物質(zhì)代謝及能量代謝紊亂〔3〕。然而桑白皮黃酮提取物對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的作用還未知。非編碼RNA中的微小RNA(miRNA)已被證明與糖尿病腎病有關(guān)〔4〕。研究顯示，miR-223-3p在糖尿病腎病患者血漿中表達(dá)降低，且其表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)〔5〕。目前，miR-223-3p在足細(xì)胞損傷中的作用還未知。本研究觀察桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖刺激的足細(xì)胞及miR-223-3p表達(dá)的影響，旨在探討桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 小鼠足細(xì)胞購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，桑白皮藥材購自廣東省藥材公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，兔抗小鼠去氧腎上腺素(Nephrin)多克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠活化的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和結(jié)蛋白(Desmin)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，miR-223-3p 模擬物(mimcs)和抑制劑購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1桑白皮黃酮提取物的制備 參照文獻(xiàn)方法提取桑白皮黃酮〔6〕。將500 g桑白皮藥材(干燥粉末)與1 500 ml乙醇(80%)加熱回流提取1 h，重復(fù)3次。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，濃縮至膏狀。加入大孔吸附樹脂、80%乙醇洗脫，收集洗脫液并回收乙醇，濃縮至膏狀，真空冷凍干燥，得到桑白皮黃酮。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 足細(xì)胞維持在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基生長，環(huán)境為37℃、CO25%、濕度97%。取對(duì)數(shù)增殖期的足細(xì)胞(5×104個(gè))接種于6孔板中。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作指示，分別將miR-223-3p mimcs、mimcs陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-223-3p抑制劑(anti-miR-223-3p)及抑制劑對(duì)照(anti-miR-NC)轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。

1.2.3細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的足細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中。未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的足細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組和高糖+桑白皮黃酮提取物組。對(duì)照組細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)48 h；高糖組細(xì)胞使用含30 mmol/L〔7〕葡萄糖的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；高糖+桑白皮黃酮提取物組使用含30 mmol/L葡萄糖和50 μg/ml桑白皮黃酮提取物的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h。miR-223-3p組和miR-NC組使用含30 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，并分別記為高糖+miR-223-3p組和高糖+miR-NC組。anti-miR-223-3p組和anti-miR-NC組細(xì)胞均使用含30 mmol/L萄糖和50 μg/ml桑白皮黃酮提取物的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h，并分別記為高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組和高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集1.2.3分組處理的足細(xì)胞，用試劑盒中5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI依次室溫避光染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5細(xì)胞中ROS含量測(cè)定 收集1.2.3分組足細(xì)胞，加入含有20 μmol/L二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，重懸細(xì)胞，37℃孵育2 h。1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液。PBS溶液清洗細(xì)胞2次，用重懸細(xì)胞后熒光顯微鏡檢測(cè)。激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm。以對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為1，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的熒光強(qiáng)度比值表示ROS含量。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中MDA和SOD水平 收集1.2.3分組足細(xì)胞，PBS清洗后，3500 r/min離心5 min。分別遵循MDA和SOD試劑盒操作說明，檢測(cè)上清中MDA和SOD水平。

1.2.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集1.2.3分組足細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心10 min收集在干凈的EP管中。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒分析蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等體積的蛋白質(zhì)(20 μg)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。分別用cleaved caspase-3、Nephrin、Desmin、Vimentin和GAPDH一抗孵育液4℃孵育過夜，與二抗免疫球蛋白(Ig)G孵育液37℃孵育2 h。并使用化學(xué)發(fā)光試劑和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶可視化，Image J軟件以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行條帶分析。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá) 收集1.2.3分組足細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR。引物序列：miR-223-3p上游 5′-GCCTTCTGCAGTGTTACGC-3′，下游5′-TAAGCATGAGCC ACAC TTGG-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算足細(xì)胞中miR-223-3p相對(duì)于U6的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1桑白皮黃酮提取物影響高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡 高糖組足細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1和圖1、圖2。

表1 桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡的 影響

1～3：對(duì)照組、高糖組、高糖+桑白皮黃酮提取物組；圖2、圖3同圖1 桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠 足細(xì)胞凋亡的影響

圖2 桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠 cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.2桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，高糖組足細(xì)胞中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD活力顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細(xì)胞中ROS和MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD活力顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠 足細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞Nephrin、Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響 高糖組足細(xì)胞中Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，Nephrin蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。桑白皮黃酮提取物組足細(xì)胞中Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)水平比高糖組顯著降低(P<0.05)，Nephrin蛋白表達(dá)水平比高糖組顯著升高(P<0.05)。見表3和圖3。

表3 桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western印跡檢測(cè)Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達(dá)

2.4桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞miR-223-3p表達(dá)的影響 對(duì)照組、高糖組和高糖+桑白皮黃酮提取物組足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平分別為1.03±0.09、0.34±0.03、0.75±0.06。與對(duì)照組比較，高糖組足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物組足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

2.5上調(diào)miR-223-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響 高糖+miR-223-3p組足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)水平、SOD活力、Nephrin蛋白表達(dá)水平顯著高于高糖+miR-NC組(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著低于高糖+miR-NC組(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 上調(diào)miR-223-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激及Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達(dá)的影響

1～2：高糖+miR-NC組、高糖+miR-223-3p組圖4 上調(diào)miR-223-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡和cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

2.6下調(diào)miR-223-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組比較，高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組miR-223-3p水平、SOD活力、Nephrin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表5和表6。

1～2：高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-NC組、高糖+桑白皮黃酮提取物+anti-miR-223-3p組圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠足細(xì)胞凋亡和Western印跡檢測(cè)cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表達(dá)

表5 下調(diào)miR-223-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

表6 下調(diào)miR-223-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)桑白皮黃酮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

足細(xì)胞是一種特異性終末分化的細(xì)胞，其位于基底膜外側(cè)，與腎小球基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成腎臟的濾過屏障，在維持腎小球正常的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用〔8〕。在糖尿病腎病發(fā)展過程中，高糖可損傷細(xì)胞線粒體，引起ROS積累過多，通過氧化應(yīng)激等多種途徑損傷足細(xì)胞，導(dǎo)致其脫落、活性降低甚至凋亡〔9〕。本研究顯示，高糖作用小鼠足細(xì)胞后，細(xì)胞中ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA〔10〕水平顯著升高，而抗氧化酶SOD〔11〕活力顯著降低，表明高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)，高糖還可能通過上調(diào)cleaved caspase-3正調(diào)節(jié)足細(xì)胞凋亡，與前人報(bào)道一致〔12〕。這表明高糖處理損傷了足細(xì)胞。而桑白皮黃酮提取物干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡降低，說明桑白皮黃酮提取物可降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

Nephrin是足細(xì)胞上特異的跨膜黏附蛋白，也是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分。研究顯示，在糖尿病腎病患者及模型中，Nephrin呈低表達(dá)〔13〕。Desmin和Vimentin屬于細(xì)胞骨架中間絲蛋白，是構(gòu)成足細(xì)胞胞體和初級(jí)突起細(xì)胞骨架的重要組成部分。研究表明，正常足細(xì)胞中Desmin和Vimentin表達(dá)較低，當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)Desmin和Vimentin表達(dá)升高〔14，15〕。本研究顯示，高糖處理可抑制足細(xì)胞中Nephrin的表達(dá)，促進(jìn)Desmin和Vimentin表達(dá)，而桑白皮黃酮提取物可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞表達(dá)Nephrin并抑制Desmin和Vimentin表達(dá)，表明桑白皮黃酮提取物可降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

miRNA參與組織器官或細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展，與疾病的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。研究顯示，miR-223-3p表達(dá)上調(diào)可能是心臟損傷后纖維性修復(fù)重要調(diào)控基因〔16〕；上調(diào)miR-223-3p表達(dá)可能通過抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6炎性因子的表達(dá)減輕脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造成的內(nèi)皮損傷〔17〕。目前，miR-223-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響還未知。本研究顯示，高糖可抑制足細(xì)胞中miR-223-3p的表達(dá)，提示miR-223-3p可能參與足細(xì)胞損傷過程。通過轉(zhuǎn)染miR-223-3p mimics上調(diào)足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和凋亡降低，且Nephrin高表達(dá)，Desmin和Vimentin低表達(dá)，說明上調(diào)miR-223-3p表達(dá)可降低高糖引起的小鼠足細(xì)胞損傷。本研究還顯示，桑白皮黃酮提取物可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)，下調(diào)miR-223-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了桑白皮黃酮提取物對(duì)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，提示桑白皮黃酮提取物可能通過上調(diào)miR-223-3p表達(dá)降低高糖引起的小鼠足細(xì)胞損傷。

綜上所述，桑白皮黃酮提取物可降低高糖引起的小鼠足細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-223-3p表達(dá)有關(guān)，為桑白皮黃酮提取物防治糖尿病腎病足細(xì)胞損傷提供了一定的理論依據(jù)。