楊利艷，邊 璐，史瑞翔，王創(chuàng)云，鄧 妍，張麗光，趙 麗，郭虹霞，秦麗霞，王美霞

(1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，中國 太原 030031；3. 東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，中國 哈爾濱 150006)

生物與非生物脅迫對植物生長發(fā)育的影響是近年來關(guān)注的熱點(diǎn)，抗性基因的挖掘與功能鑒定對提高作物抗逆性有著重要意義。乙烯是植物體內(nèi)一種重要的激素，參與植物眾多生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)，根生長發(fā)育，莖的生長、成熟與衰老[1，2]等；同時參與一系列重要的物質(zhì)代謝，并在受到外界刺激如機(jī)械損傷、冷害、鹽等脅迫和病原菌入侵等均會通過釋放量的改變，進(jìn)一步引起植物發(fā)生應(yīng)答。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是乙烯生物合成途徑中的最后一個酶也是關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是高等植物中乙烯應(yīng)答的主要標(biāo)志[3]。最早被Yang等[4]發(fā)現(xiàn)并命名為乙烯形成酶(EFE)，后來證實(shí)需要抗壞血酸和氧作為輔助底物，因此稱為ACC氧化酶。目前多種植物中的ACO基因被克隆得到，并證實(shí)ACO基因?yàn)榧易寤颉Ｄ壳皩ζ湓谥参锷L發(fā)育及逆境脅迫等方向的研究已有報道。Sornchai等[5]通過導(dǎo)入石斛蘭CpACO基因反義載體從而延長了石斛蘭花期；Yuan等[6]鑒定出梨中3個ACO基因可被乙烯誘導(dǎo)，是控制果實(shí)成熟的主要因素；脫落酸、外部機(jī)械損傷、低溫能夠誘導(dǎo)番茄、花椰菜ACO基因的表達(dá)[7]；生長素、干旱及鹽脅迫會抑制植物ACO基因的表達(dá)[8]；六出花屬植物ACO基因在花脫落前轉(zhuǎn)錄水平上升了4.5倍，而在花發(fā)育的前期幾乎沒有變化[9]。研究顯示，ACO基因的表達(dá)能夠在很多植物生理活動中被快速誘導(dǎo)，表明 ACO 可能是調(diào)控乙烯生物合成的一個關(guān)鍵酶。

玉米是世界主要糧食作物之一，同時還是飼用、工業(yè)和能源開發(fā)的重要原料[10]。玉米在生長發(fā)育過程中會遇到干旱、低溫和病蟲害等各種生物與非生物脅迫，從而嚴(yán)重影響產(chǎn)量。植物在進(jìn)化過程中為更好地適應(yīng)環(huán)境變化形成了復(fù)雜的防御機(jī)制。有關(guān)玉米ACO基因的研究鮮有報道。本研究基于玉米全基因組測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法對玉米基因組中ZmACO基因進(jìn)行鑒定，并對其進(jìn)行序列特征、理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系等分析，同時結(jié)合前期研究，根據(jù)粘蟲取食的玉米轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析ZmACO基因在蟲食前后表達(dá)量變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米基因組數(shù)據(jù)來源 玉米PH207基因組數(shù)據(jù)、水稻ACO蛋白序列從Phytozome13(http://phytozome. Jgi. Doe. Gov/pz/)中獲得，擬南芥ACO蛋白序列從TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)中獲得。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 植物材料：玉米 (Zeamaysssp.maysL.) 自交系B73種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所提供,用于轉(zhuǎn)錄組測序。玉米雜交種先玉335種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供,用于飼喂粘蟲。

動物材料：粘蟲 (MythimnaseparateWalker),又名東方粘蟲,剛孵化的粘蟲由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 玉米ACO基因家族成員的鑒定及序列分析 利用TAIR數(shù)據(jù)庫中所有的擬南芥ACO蛋白，在玉米基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對搜索，篩選出玉米中所有的 ACO蛋白，運(yùn)用Pfam(http://pfam.xfam.org/)分析候選ACO蛋白結(jié)構(gòu)，去除無ACO蛋白典型保守結(jié)構(gòu)域的成員，得到ACO家族的所有成員。通過Expasy (https://web.expasy.org/protparam/)對ACO蛋白家族的序列氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)及脂肪族氨基酸數(shù)等一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.2 玉米ACO染色體定位、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析 利用在線工具M(jìn)G2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)制作染色體定位圖。采用Expasy (https://web.expasy.org/protparam/)，SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ secpred_sopma. pl)和CELLO2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)等在線軟件分別對ACO的親水性、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將玉米ACO家族蛋白序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana,At)和水稻(Oryzasativa,Os)已知ACO蛋白序列通過MEGA7.0中的Muscle進(jìn)行比對，采用鄰接法(bootstrap=1 000)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 玉米ACO家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析 采用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行玉米ACO基因家族外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析，用MEME(https://meme-suite.org/meme/)進(jìn)行保守基序分析，利用TBtools工具繪制玉米ACO蛋白的motif圖，分析玉米ACO氨基酸序列的保守性。采用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，利用TBtools工具繪制玉米ACO基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5 玉米ACO基因啟動子分析 利用TBtools提取玉米ACO家族基因的啟動子序列并用在線工具Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析玉米ACO家族基因上游2 000 bp序列，預(yù)測ACO基因基序類別和功能特征。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序分析玉米ACO基因表達(dá) 粘蟲取食玉米實(shí)驗(yàn)設(shè)置及轉(zhuǎn)錄組分析見本課題組已發(fā)表論文[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ACO基因家族成員的鑒定及序列分析

利用所有的擬南芥ACO蛋白和水稻ACO蛋白，在玉米基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對搜索，篩選出玉米中的ACO蛋白，運(yùn)用Pfam(http://pfam.xfam.org/)分析候選ACO蛋白結(jié)構(gòu)，去除無ACO蛋白典型保守結(jié)構(gòu)域的成員，最終得到8個ZmACO基因，分別命名為ZmACO1～ZmACO8。并獲得了每個成員的全基因序列、CDS序列及相應(yīng)的蛋白序列?；蚱稳L在944～4 264 bp，CDS全長為888～1 359 bp，編碼氨基酸長度為296～453 aa(表1)。

表1 玉米ACO基因家族成員的基本特征

2.2 玉米ACO染色體定位、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)該家族8個基因分布于玉米的5條染色體上(圖1)，且均位于染色體的中下部。其中第10染色體上有3個基因(ZmACO6，ZmACO7和ZmACO8)成簇分布，且屬同一亞族以不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本定位于同一染色體上。第4染色體上有2個基因(ZmACO2和ZmACO3)，第2，5和7號染色體上各有一個基因，分別為ZmACO1，ZmACO4和ZmACO5。且結(jié)合ZmACO進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，ZmACO1(2號染色體)和ZmACO3(4號染色體)在不同染色體上發(fā)生片段重復(fù)。

圖1 ZmACOs基因在玉米染色體上的定位

通過對8個ZmACO蛋白基因家族成員理化性質(zhì)的研究表明(表2)，ZmACO的平均相對分子質(zhì)量為32 974 260～36 437 570。理論等電點(diǎn)PI值為4.97～5.49，即該基因家族蛋白均為弱酸性蛋白。該基因家族不穩(wěn)定系數(shù)為27.16～45.82，ZmACO1，ZmACO3及ZmACO5為親水性不穩(wěn)定蛋白，其余為親水性穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為63.52～85.03。對ZmACO蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可知該家族主要有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋為115～163個，β-折疊為56～74個，無規(guī)則卷曲為97～178個。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，玉米ACO家族所有成員均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，推測ZmACO會在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。

表2 ZmACOs蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位

2.3 玉米、擬南芥和水稻ACO家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步了解ACO基因家族的進(jìn)化關(guān)系，利用單子葉植物：玉米(8個)、水稻(4個)；雙子葉植物：擬南芥(4個)的ACO蛋白(總計16個蛋白序列)，基于鄰接法構(gòu)建無根進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明，16個ACO序列蛋白被劃分成ACOⅠ(7個)、ACOⅡ(2個)和ACOⅢ(7個)3個分支。8個ZmACO蛋白家族成員分布在ACOⅠ和ACOⅢ中，ACOⅡ分支中沒有ZmACO蛋白家族成員。通過分析玉米、擬南芥和水稻ACO基因的同源性發(fā)現(xiàn)，存在3對種內(nèi)旁系同源基因(玉米2對，擬南芥1對)，2對種間直系同源基因(AtACO3和OsAO1、ZmACO5和OsACO4)，表明在單子葉和雙子葉植物分離之前就出現(xiàn)了ACO基因的共同祖先，ACO基因家族按照物種特異性進(jìn)行擴(kuò)展，以更好地適應(yīng)環(huán)境變化。

經(jīng)過全面的質(zhì)量檢查與測試，本地鐵車站高壓旋噴樁質(zhì)量合格，承載力能達(dá)到設(shè)計與規(guī)范的要求，說明以上施工工藝和技術(shù)合理可行，具備良好的參考借鑒價值。

圖2 ACO進(jìn)化分析(Zm：玉米；At：擬南芥；Os：水稻)

2.4 玉米ACO家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

對玉米ACO基因家族進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析預(yù)測，結(jié)果表明：有4個基因沒有5’UTR區(qū)，有4個基因有UTR區(qū)(如圖3)。ZmACO8沒有內(nèi)含子，有1個外顯子；ZmACO5，ZmACO6和ZmACO7有1個內(nèi)含子和2個外顯子；ZmACO1，ZmACO2和ZmACO3有2個內(nèi)含子和3個外顯子；ZmACO4有4個內(nèi)含子和5個外顯子。其中旁系同源基因ZmACO1和ZmACO3的基因結(jié)構(gòu)高度相似，均有5’UTR區(qū)、3個外顯子和2個內(nèi)含子；旁系同源基因ZmACO6和ZmACO7的基因結(jié)構(gòu)相似，均沒有5’UTR區(qū)、2個外顯子和1個內(nèi)含子；這兩對旁系同源基因均屬于ACOⅠ，并且氨基酸序列同源性均在80%以上，這與他們的進(jìn)化結(jié)果相對應(yīng)。

圖3 ZmACOs進(jìn)化樹與基因結(jié)構(gòu)

利用MEME在線軟件分析玉米ACO家族成員的保守基序分布，共鑒定出了10個motif，結(jié)果如圖4所示。所有玉米ACO家族成員中均含有motif1，motif2，motif4，motif6和motif8，并且分布位置相似，均為motif6-motif4-motif2-motif1-motif8。可見玉米ACO蛋白結(jié)構(gòu)保守性較高。

圖4 ZmACO蛋白家族保守基序

對玉米ACO家族成員的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖5)，所有成員均含有相似的保守結(jié)構(gòu)域。其中ZmACO2的保守結(jié)構(gòu)域最長，其余成員的保守結(jié)構(gòu)域長度及位置相似，因此推斷該基因家族成員可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖5 ZmACO蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域

2.5 玉米ACO基因啟動子分析

對玉米ACO基因家族成員啟動子上游2 kb區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析，預(yù)測的順式作用元件可分為兩類(表3)，即植物激素調(diào)控元件和逆境脅迫相關(guān)元件。可能應(yīng)答的激素包括以下6類：脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ERE)和水楊酸(SA)。MeJA響應(yīng)元件和ABA應(yīng)答元件在玉米ACO基因家族中數(shù)量最多，其中MeJA調(diào)控元件在ZmACO3中最多(14個)，在ZmACO5和ZmACO8的含量最少(2個)；ABA作用元件在ZmACO6中最多(7個)，在ZmACO1中最少(1個)。逆境脅迫類元件分為3類：厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)、逆境應(yīng)答元件(MBS)和抗寒響應(yīng)元件(MYC)。其中MYB和MYC元件數(shù)量最多，且只有ZmACO5不含逆境脅迫相關(guān)元件，因此推測玉米ACO家族在響應(yīng)逆境脅迫中ZmACO5可能不發(fā)揮作用。

表3 ZmACO基因家族上游順式作用元件

2.6 玉米ACO對粘蟲取食的響應(yīng)

根據(jù)ZmACOs基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)量的高低，篩選出粘蟲取食前后表達(dá)量差異最高的基因見圖6。ZmACO6和ZmACO7在粘蟲取食前后表達(dá)量差異相同且最明顯，ZmACO5和ZmACO8取食前后表達(dá)量差異較小，ZmACO4的表達(dá)在取食前后無差異，ZmACO1和ZmACO3在取食前后均無表達(dá)，因此推測ZmACO6和ZmACO7在玉米響應(yīng)粘蟲取食過程中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)論與討論

本研究通過blastp比對和保守結(jié)構(gòu)域篩選，確定了8個ZmACOs基因家族成員。染色體定位顯示ZmACO2和ZmACO3在同一條染色體上，但是在進(jìn)化樹中卻分布在不同的亞族，這可能是這兩個基因mRNA的表達(dá)模式不同。ZmACO2和ZmACO5的氨基酸同源性比ZmACO2和ZmACO3高，且不在同一條染色體上，推測ZmACO2和ZmACO5在同一亞族的原因可能是氨基酸同源性高，保持緊密連鎖[12]。玉米ACO基因家族編碼蛋白為296～453 aa，保守結(jié)構(gòu)域同源性最高均在多肽中部，最大差異在C端，這與前人的研究相吻合[13]。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，在ACOⅠ中，多個玉米ACO基因發(fā)生聚類，并且在基因結(jié)構(gòu)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域中均高度相似，說明ZmACO1，ZmACO3，ZmACO6，ZmACO7和ZmACO8在后期進(jìn)化而來且功能可能相似。ZmACO5和OsACO4是一對種間直系同源基因，親緣關(guān)系更近。

ZmACO6和ZmACO7的氨基酸序列同源性最高，其次為ZmACO1和ZmACO3，ZmACO2和 ZmACO5同源性最低，這3對基因在系統(tǒng)進(jìn)化樹上分別處于同一分支，為重復(fù)基因。表明玉米中一些ACO基因成員可能經(jīng)歷基因復(fù)制及分化進(jìn)程，這3對基因可能是在物種進(jìn)化過程中，全基因組復(fù)制時不同數(shù)目的內(nèi)含子插入導(dǎo)致局部復(fù)制所產(chǎn)生[8]。

基因的外顯子與內(nèi)含子可作為揭示基因家族各成員之間進(jìn)化關(guān)系的重要印跡[14]。在ZmACO基因家族成員中，只有ZmACO8沒有內(nèi)含子，推測其可能是較為原始的類型。其他成員具有1～4個內(nèi)含子，可能是在ZmACO8進(jìn)化過程中通過外顯子重排產(chǎn)生。ZmACO4具有4個外顯子，其閱讀框經(jīng)內(nèi)含子多次插入，屬于家族中較新的成員。

啟動子是控制基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，位于基因5’端的上游，精準(zhǔn)調(diào)控RNA聚合酶與DNA的結(jié)合，通過上下游順式元件調(diào)控基因表達(dá)[15]。本研究對啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，ZmACOs基因啟動子區(qū)均有激素與逆境脅迫響應(yīng)元件分布，該結(jié)果表明乙烯(ET)與其他激素如SA，IAA，MEJA，ABA及GA等存在相互作用，共同參與植物的防御響應(yīng)[16]，也為乙烯參與干旱、低溫和厭氧等[17]提供了合理的解釋。

研究發(fā)現(xiàn)MeJA處理在整個貯藏期間增強(qiáng)了蘋果基因MdACO1及MdACO2等的表達(dá)，對乙烯生物合成和信號通路相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了差異調(diào)節(jié)[18]。外施茉莉酸和乙烯能夠提高植物防御素PDF1．2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，這說明茉莉酸與乙烯信號途徑存在著不同程度的交互作用，并且是機(jī)械傷害、蟲害誘導(dǎo)的植物防御必要措施[19]。

ABA處理能夠顯著提高蘋果乙烯生物合成基因ACO1/2和ACS1/3的表達(dá)，同時促進(jìn)蘋果乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ERS1/2、ETR2和ERF3/4/5在貯藏過程中表達(dá)量的增加，顯著促進(jìn)了乙烯的積累[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)，ABA作為上游調(diào)節(jié)因子啟動呼吸躍變型果實(shí)成熟可能是通過誘導(dǎo)乙烯合成而實(shí)現(xiàn)。外源ABA可增加乙烯合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)乙烯的生成，而使用ABA抑制劑則具有相反的作用[21]。ACO基因的表達(dá)和乙烯的產(chǎn)生與PEG處理的干旱脅迫密切相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，ACO以基因家族的形式存在于多種植物中，在乙烯合成過程中有關(guān)鍵的作用；植物ACO基因的表達(dá)受到激素(IAA，ABA和乙烯)、環(huán)境脅迫(機(jī)械損傷、高溫、低溫、臭氧、高鹽、干旱、淹水和病原體侵染)和生長發(fā)育過程(植物開花、果實(shí)成熟、衰老)的誘導(dǎo)[22]。上述研究為本研究結(jié)果中玉米ZmACOs基因啟動子上具有眾多諸如MEJA，ABA和低溫誘導(dǎo)相關(guān)元件提供了合理的注解。綜上所述,ZmACOs基因可能在玉米生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用,可以作為作物改良的重要基因，后期需進(jìn)一步證明。

來源于不同物種的ACO可對多種環(huán)境脅迫具有響應(yīng)，例如機(jī)械損傷割膠對橡膠樹HbACO7基因表達(dá)有影響，且證實(shí)HbACO7基因編碼具有生理活性的 ACO 酶，能體外催化ACC產(chǎn)生乙烯[23]；在低溫和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的向日葵HaACO1基因表達(dá)量高于野生型煙草[24]；過表達(dá)馬鈴薯StACO1基因的煙草，可增強(qiáng)對鉀脅迫的耐受性[25]。

本研究中，對粘蟲取食玉米前后ACO基因家族各基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，ZmACO6和ZmACO7在取食前后基因的相對表達(dá)量差異最大，推測這兩個基因與玉米的抗蟲響應(yīng)密切相關(guān)。