徐毓鴻 龍海濤 王婷 董文科 薛華麗 蒲陸梅

1（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 蘭州 730000）

2（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 蘭州 730000）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是一種多年生豆科植物，是世界上種植面積最大的苜蓿屬植物。其適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富，莖葉中蛋白質(zhì)［1］、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素等含量豐富。成熟期收獲的干草中富含P、K、Ca、Mg 等微量元素［2］，素有“牧草之王”一稱［3］。近年來，過度放牧造成草場退化，導(dǎo)致耕地產(chǎn)量低下，嚴(yán)重影響農(nóng)牧業(yè)發(fā)展。雖然紫花苜蓿具有良好的生態(tài)適應(yīng)性，但因其上種皮表層含有致密的疏水蠟狀物，阻礙水分的吸收，抑制種子萌發(fā)與生長［4］，導(dǎo)致其有出苗困難等問題。因此種子在播種前需要預(yù)先處理，提高其萌發(fā)率及生物產(chǎn)量，創(chuàng)造更好的經(jīng)濟(jì)效益與社會價值。

目前，促進(jìn)豆科植物種子萌發(fā)的方式主要有機械磨皮、熱水浸種、酸蝕處理和堿液浸泡［5］。然而，酸蝕與熱處理促進(jìn)種子的萌發(fā)效果因品種及處理措施而異，若處理不當(dāng)，會引起種子損傷，甚至喪失發(fā)芽能力［6］；利用化學(xué)藥劑會造成土壤污染以及植株損傷［7］。因此，對種子進(jìn)行安全且不污染環(huán)境的改良處理尤其重要。近年來，非熱等離子體（Nonthermal plasma，NTP）技術(shù)在種子播種前處理方面的應(yīng)用越來越廣泛［8］。其非化學(xué)的處理方式有效地避免了化學(xué)試劑對種子的傷害，為減少農(nóng)藥使用量、減輕環(huán)境的污染提供了新的解決方案。常見的處理方式有介質(zhì)阻擋放電（DBD）、大氣壓等離子射流放電（APPJ）、電暈放電（CD）等。盡管處理裝置不同，但NTP產(chǎn)生的機制存在普遍共識［9］：放電環(huán)境下產(chǎn)生活性氮氧物種（RONS），例如O、O2-、H2O+、·OH 等活性粒子以及O3、NOx、H2O2等穩(wěn)定分子，通過產(chǎn)生的帶電粒子的撞擊、活性物種的影響以及輻射與電場等物理因素作用于生物材料。現(xiàn)已應(yīng)用在擬南芥［10］、大麥［11］、小麥［12］、甜椒［13］以及綠豆［14］等種子上，對種子表面抑菌具有顯著效果，同時影響種子的萌發(fā)、生長、抗逆性、酶活性以及DNA變化等［8］。

接觸輝光放電等離子體（CGDP）［15］是一種新興的NTP 方法：與水溶液接觸的電極在高壓直流電的作用下發(fā)生輝光放電，陰陽兩極共同與水分子作用產(chǎn)生O2-、H2O+、OH-、·OH、O3、H2O2等高能活性粒子。即包含自由基物種的等離子體活性粒子在溶液界面形成，不斷向溶液中擴(kuò)散，從而誘導(dǎo)溶液中物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)［16］。目前，已在合成化學(xué)、廢水處理、有機降解、光敏和催化表面材料等領(lǐng)域有著廣泛的研究及應(yīng)用［17］。然而，關(guān)于影響種子萌發(fā)的研究尚未見報道。本實驗以隴東紫花苜蓿種子為研究對象，通過Box-behken 實驗設(shè)計，以萌發(fā)率（Gr）與活力指數(shù)（Vi）為評價指標(biāo)，將等離子體處理種子的時間、電壓以及氣體環(huán)境作為考察因素，優(yōu)化CGDP 處理種子的工藝。進(jìn)而為提高苜蓿種子的萌發(fā)提供一種可行、有效的處理方式，為探索CGDP促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

隴東紫花苜蓿種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供。選擇飽滿均一的供試種子，預(yù)先進(jìn)行消毒。首先用濃度為75%乙醇溶液浸泡30 s，接著用2%的次氯酸鈉浸泡5 min，置于室溫下晾干，消毒后將供試樣品放入無菌袋里密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CGDP裝置

CGDP 裝置由直流高壓電源（0～1 000 V）和反應(yīng)器兩部分組成，反應(yīng)裝置示意圖見圖1。陰極為電極長度10 cm、直徑10 mm的石墨棒；陽極為電極長度10 cm、直徑0.5 mm的鉑絲。為確保反應(yīng)器中的溫度恒定，反應(yīng)器外附有循環(huán)冷卻水系統(tǒng)。調(diào)整兩電極極距，使電流控制在（27±2）mA內(nèi)［18］。將種子置于等離子體體系中進(jìn)行處理，磁力攪拌促使等離子體中活性成分與種子充分接觸。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

1.3 方法

1.3.1 CGDP處理種子

選擇時間、電壓、氣體環(huán)境3個直接影響輝光放電的重要條件進(jìn)行單因素實驗。常壓大氣540 V電壓條件下，分別進(jìn)行15 min、30 min、45 min和60 min 處理，以研究處理時間對種子萌發(fā)的影響。常壓大氣處理30 min 條件下，分別進(jìn)行500 V、520 V、540 V、560 V、580 V和600 V處理，以研究處理電壓對種子萌發(fā)的影響。在540 V電壓、處理時間30 min 的條件下，分別通入常壓大氣、O2和N2，以研究氣體環(huán)境對種子萌發(fā)的影響。

1.3.2 種子的萌發(fā)與指標(biāo)測定

根據(jù)Roy 的方法［19］采用紙培法培養(yǎng)，測定相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)。每組樣品含30 粒苜蓿種子，將種子均勻放入直徑90 mm、內(nèi)含雙層濾紙的培養(yǎng)皿容器中，加入3.5 mL 無菌水，利用密封膜封口來防止水分蒸發(fā)。置于恒溫恒濕光照箱中模擬光照，光照強度為54 μmol/（m2·s）（16 h 光照，8 h 黑暗），濕度50%～60%。每天補水以保持第一次培養(yǎng)時濾紙的潤濕程度，培養(yǎng)7 d，每組平行實驗3 次。根長1 mm以上，且胚芽鞘伸出時認(rèn)定種子發(fā)芽。每天記錄種子的發(fā)芽數(shù)，連續(xù)3 d無新發(fā)芽的種子為止。由公式（1）、（2）、（3）計算萌發(fā)率（Gr）、萌發(fā)指數(shù)（Gi）和活力指數(shù)（Vi）。

式中：N7、Nts、Ntg、Gd、Lt分別為7 d 內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)、供試種子的總數(shù)、種子t天的萌發(fā)數(shù)、萌發(fā)天數(shù)以及苗長，mm。

1.3.3 葉綠素含量

準(zhǔn)確稱取20.0 mg 葉片，參照舒展的方法［20］，利用丙酮提取法提取待測液，測定吸光值（OD）。利用Arnon公式［21］（4）～（7）計算提取液中葉綠素a 濃度（Ca，mg/L）、葉綠素b 濃度（Cb，mg/L）、葉綠素總濃度（Ca+b，mg/L）、類胡蘿卜素濃度（Cx.c，mg/L），然后用公式（8）換算為每克鮮葉光合色素含量（Cp，mg/g）。

式中：A645、A663、A470分別為波長645 nm、663 nm、470 nm 下的吸光度；V表示提取液總量，mL；W為鮮葉重，g。

1.3.4 葉片光合氣體交換參數(shù)

利用GFS-3000 便攜式光合作用儀測定紫花苜蓿分枝期葉片第50 天的光合速率。分別分析了氣孔導(dǎo)度（Gs，mmol/（m2·s））、蒸騰速率（Tr，mmol/（m2·s））、胞間CO2濃度（Ci，μmol/mol）、凈光合速率（Pn，mmol/（m2·s））等光和作用參數(shù)，并按公式（9）、（10）計算水分利用效率（WUE）和葉片氣孔限制值（Ls）［22］。

式中：Co表示外界CO2濃度。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以處理時間（A）、電壓（B）、氣體環(huán)境（C） 3個因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken design 實驗。Gr以及Vi為響應(yīng)值R1，R2。以得到等離子體裝置處理苜蓿種子的最優(yōu)條件。響應(yīng)面的實驗因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組平行實驗均3次進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)繪制分別利用Desian-Expert11.1.01和Origin2019軟件進(jìn)行。使用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯檢驗評估各組之間的差異，并在p＜0.05 時認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 時間、電壓和氣體環(huán)境對萌發(fā)指標(biāo)的影響

各單因素實驗的Gr以及播種后4 d的生長趨勢見圖2，單因素對種子萌發(fā)的影響見圖3。隨著處理時間的增加，苜蓿種子的Gr、Gi與Vi等相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)呈先上升后下降趨勢。經(jīng)過30 min 的處理，各指標(biāo)均達(dá)到最佳值，分別為對照組（0 min）的1.08倍、1.10倍和1.15倍，因此處理30 min后的種子活力最強。處理30 min 后，隨著處理時間的延長各數(shù)值明顯下降。甚至處理45 min 后與對照組相比活力指數(shù)（Vi）下降了3.6 倍。Los 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，將處理時間延長到一定時間會對小麥的生物參數(shù)產(chǎn)生一些負(fù)面影響，種子發(fā)芽率下降；M?gureanu［24］的實驗結(jié)果表明，處理時間過長不利于生長，處理45 min 后番茄苗長的增長開始逐漸降低，這與我們的實驗結(jié)果一致。氧化還原生物化學(xué)中，活性氮（RNS）和活性氧（ROS）對植物有重要的調(diào)節(jié)作用。等離子體產(chǎn)生的RONS通過附著在粗糙的種皮表面，擴(kuò)散到內(nèi)部，從而提高了種子儲備化合物的氮含量，對促進(jìn)種子萌發(fā)十分重要。Billah 等［25］的研究結(jié)果表明，介質(zhì)阻擋放電（DBD）大氣等離子體處理，使黑豆種子中氮復(fù)合物含量增加，從而使發(fā)芽速度加快，氮復(fù)合物含量與黑豆種子的發(fā)芽率呈正相關(guān)關(guān)系。然而，長時間處理會導(dǎo)致過度氧化和氮脅迫［26］，一旦超出植物體內(nèi)抗氧化酶的調(diào)節(jié)范圍，例如過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化酶（APX）、過度的H2O2以及RONS 脅迫，就會造成威脅或毒害，降低發(fā)芽能力，是種子失活的主要原因［27］。綜上所述，確定處理時間30 min為最佳處理條件。

圖2 播種4 d后單因素對萌發(fā)率以及生長趨勢的影響：(a)時間；(b)電壓；(c)氣體環(huán)境Fig.2 Influence of single-factor on germination rate and growth trend after 4 d of sowing：(a)time；(b)voltage；(c)gas environment

圖3 單因素對紫花苜蓿種子萌發(fā)指標(biāo)的影響：(a)時間；(b)電壓；(c)氣體環(huán)境Fig.3 Effect of single factor on germination index of Alfalfa：(a)time；(b)voltage；(c)gas environment

當(dāng)電壓為540 V時，相對于其他電壓條件時各項萌發(fā)指標(biāo)達(dá)到最大值。萌發(fā)率高達(dá)90%，萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)較對照組相比分別增長1.34 倍和1.49倍。而當(dāng)電壓超過540 V后，各項指標(biāo)均隨著電壓的增大而大幅下降，甚至萌發(fā)率降低了4.1倍。這與徐文倩等［4］的研究結(jié)果一致：當(dāng)電壓增加到一定程度后，苗長出現(xiàn)一定程度的降低。等離子體處理時，會通過氧化損傷影響植物代謝。對于化學(xué)脅迫，植物的保護(hù)機制依賴于抗氧化酶的活性［24］，抗氧化酶主要包括APX、CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）等。Billah［28］研究結(jié)果表明，低壓介質(zhì)阻擋放電（LPDBD）等離子體使水稻植株整體抗氧化酶活性（APX、CAT、SOD）增強，產(chǎn)生清除ROS 的酶，有助于調(diào)節(jié)抗氧化酶防御系統(tǒng)，增強滲透調(diào)節(jié)能力，有助于植株的生長發(fā)育。另外，等離子產(chǎn)生的活性化合物還會與相關(guān)內(nèi)源激素（生長素，細(xì)胞分裂素等）［29］協(xié)同作用，加速種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的分解，刺激了細(xì)胞的分裂和增殖，加速細(xì)胞伸長，促進(jìn)幼苗生長［30］。而過強的電壓產(chǎn)生的ROS 含量過高，一旦超出植物細(xì)胞抗氧化酶的最大調(diào)節(jié)范圍，就會導(dǎo)致細(xì)胞與組織損傷，與生物生長量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系［31］。因此確定540 V為最佳電壓進(jìn)行下一步的實驗。

氮氣環(huán)境使種子相應(yīng)的萌發(fā)指標(biāo)均有顯著提高。特別是活力系數(shù)（Vi），氧氣環(huán)境下僅為344.0，常壓空氣下為564.4，而氮氣環(huán)境下高達(dá)1 382.0 左右，相比于其他兩組氣體環(huán)境下增長了1.5～3.0 倍。選用氮氣作為載氣可以避免初始濃度的活性氧，例如·OH、O2-，這些活性物質(zhì)具有很高的氧化電位，會對植物造成不利影響。特別是過量的臭氧，據(jù)報道，臭氧濃度過高會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜損傷和溶質(zhì)泄露，直接影響種子的萌發(fā)與生長［32］。因此，綜合考慮選擇氮氣作為處理的最佳氣體環(huán)境。

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 設(shè)計與結(jié)果

以單因素實驗為基礎(chǔ)，利用Design Expert11設(shè)計Box-Behnken。以時間、電壓、氣體環(huán)境為響應(yīng)變量A、B、C，Gr、活力指數(shù)為響應(yīng)值R1、R2，結(jié)果見表2。通過多元回歸擬合數(shù)據(jù)，得到二次多項回歸方程式（11）和（12）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

響應(yīng)值的回歸方程方差分析如表3所示，Gr及Vi二次回歸模型的p＜0.05，失擬項p＞0.10，表明模型顯著，無失擬因素存在；相關(guān)系數(shù)R2分別為0.989 6、0.914 5，校正系數(shù)R2Adj分別為0.966 6、0.804 5，即自變量與響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，實驗結(jié)果分別為96.66%、80.45%，受實驗因素的影響，模型可以準(zhǔn)確反映擬合實驗的真實情況。因此，該模型可以由兩個響應(yīng)值Gr與Vi的結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

回歸模型方差分析表明，F(xiàn)值檢驗可以確定自變量影響下因變量的大小，因此各因素對發(fā)芽率（R1）影響的主次順序依次是是C、B、A，即氣體環(huán)境影響最大，其次是電壓，最后是時間。一次項C、交互項AB、AC、BC和二次項B2、C2對萌發(fā)率的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），二次項A2對萌發(fā)率的影響極其顯著（p＜0.000 1）。結(jié)果表明：各實驗因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系并不僅是單純的線性關(guān)系，而是各因素間存在顯著的交互作用關(guān)系；影響活力指數(shù)（Vi）的因素主次順序分別為處理時間、處理電壓、氣體環(huán)境。交互項AB、二次項A2、B2、C2對活力指數(shù)的影響達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），是影響活力系數(shù)的重要模型項。

2.2.2 響應(yīng)面交互分析

為直觀反映實驗各因素相互交互對響應(yīng)值的影響結(jié)果，利用二次回歸方程繪制等高線以及三維響應(yīng)面。響應(yīng)面越陡峭說明因變量對響應(yīng)量影響越大。圖4為三因素之間交互作用對Gr影響的響應(yīng)面圖，圖5為三因素交互作用對Vi的響應(yīng)面圖。

圖4 各種因素交互作用對發(fā)芽率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on germination rate

圖5 各種因素交互作用對活力指數(shù)影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on the vivo index

圖4 中處理時間與電壓交互的響應(yīng)面坡度陡峭，這表明A、B因素交互作用影響紫花苜蓿種子的發(fā)芽率較強；圖5 中，A和B之間因素交互作用明顯，其他因素之間交互作用不明顯，例如：處理時間（A）與氣體環(huán)境（C）對種子活力系數(shù)交互影響較弱，響應(yīng)面坡度平緩。這與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.3 最佳處理條件驗證

由響應(yīng)面軟件優(yōu)化的等離子體的最佳處理條件為：時間30.03 min、電壓534.62 V、氣體環(huán)境0.317 8，在該條件下萌發(fā)率和活力指數(shù)的預(yù)測值分別為92.931%以及1 869.63。綜合實際考慮，調(diào)整最佳處理條件為：時間30 min、電壓540 V、氣體環(huán)境為N2。采取最佳條件處理的驗證實驗的種子相關(guān)萌發(fā)參數(shù)見圖6。與對照組相比，等離子體處理后紫花苜蓿種子的萌發(fā)率增長了8.26%。Gi反映了種子的發(fā)芽速率和整齊程度，是決定種子萌發(fā)效果的重要指標(biāo)，處理后的Gi增加了14.50%。另外，處理組的Vi較對照組相比升高了36.7%，為1 710.81。各項指標(biāo)與對照組相比均顯著增加，與預(yù)測值相符。因此表明可利用該模型對條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖6 驗證實驗種子的萌發(fā)參數(shù)Fig.6 Seed germination parameters for verification test

2.4 CGDP對光合作用特性的影響

圖7～8分別表示CGDP對苜蓿葉片光合色素含量以及光合作用的影響。圖7顯示，在最佳優(yōu)化條件下，等離子體處理使葉片的光合色素的含量均有所增加，其中，Ca+b含量發(fā)生顯著變化。相較于對照組葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素含量分別增加25.41%、25.46%、25.42%以及39.65%。光合色素含量增加，表明等離子體處理可以提高苜蓿植株的生理活性，能夠直接促進(jìn)植物的光合作用。由圖8可知，苜蓿葉片的凈光合速率（Pn）顯著高于對照組，其增加幅度為98.39%。

圖7 CGDP對苜蓿葉片中光合色素含量的影響Fig.7 Effects of CGDP on photosynthetic pigment content in alfalfa leaves

圖8 CGDP對光合作用的影響：（a）氣孔導(dǎo)度；（b）蒸騰速率；（c）胞間CO2濃度；（d）凈光合速率；（e）水分利用效率；（f）葉片氣孔限制值Fig.8 Effects of CGDP on photosynthesis：(a)stomatal conductance；(b)transpiration rate；(c)intercellular CO2；(d)net photosynthesis rate；(e)water use efficiency；(f)stomatal limitations of leaves

氣孔導(dǎo)度（Gs）為平衡氣體交換，也發(fā)生了顯著變化，相比于對照組提升43.04%。植株會利用氣孔將細(xì)胞內(nèi)的水分以水蒸氣的形式散發(fā)出去產(chǎn)生蒸騰效應(yīng)［21］，因此，Gs會影響植物的蒸騰速率（Tr）。CGDP 處理后，Tr提高了41.59%，Gs與Tr的大幅增大，加速了植物與外界間氣體交換，進(jìn)一步增加植物細(xì)胞對CO2的利用率，最終顯著增加了植物的光合作用。WUE也顯著提高，增長了40.72%，說明在消耗相同單位重量的水情況下，CGDP會使苜蓿擁有更高的干物質(zhì)量及生物量，創(chuàng)造更好的生產(chǎn)效益。

胞間CO2濃度沒有明顯變化，氣孔限制值（Ls）有所增加。說明氣孔調(diào)節(jié)并不是導(dǎo)致光合速率增加的主要原因，而是由于產(chǎn)生CGDP的過程中選擇N2作為氣體環(huán)境，RNS 提供了豐富氮源，使種子中氮復(fù)合物的含量增加。等離子為種子提供足夠的氮源，可以通過氮復(fù)合體的代謝產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)與氨基酸，提供種子所需的營養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生長，對提高葉綠素含量發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［28］。另外，由于植株中氮積累量增加，與氮代謝和光合作用有關(guān)的硝酸鹽還原酶和谷氨酰胺合成酶的活性增加，最終促進(jìn)植株的光合作用［19］。這一觀察結(jié)果與Billah［28］的研究結(jié)果一致，低壓介質(zhì)阻擋放電（LPDBD）使水稻幼苗葉片中葉綠素含量發(fā)生了顯著變化。因此，說明CGDP可以提高植株的生物活性，高效地促進(jìn)體內(nèi)光合色素的產(chǎn)生，進(jìn)而提高植株的光合速率，最終促進(jìn)生長，產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

CGDP具有促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)以及幼苗生長的作用。CGDP影響種子萌發(fā)的3個主要因素為處理種子的時間、產(chǎn)生等離子體的電壓以及氣體環(huán)境。各因素與種子的萌發(fā)和生長有良好的響應(yīng)關(guān)系。本文確定CGDP促進(jìn)紫花苜蓿種子的最佳工藝為：N2環(huán)境、540 V電壓、處理30 min。該條件下萌發(fā)率高達(dá)93%，活力指數(shù)為1 869.6。輝光放電等離子體不僅能顯著促進(jìn)紫花苜蓿的萌發(fā)，還使其幼苗葉片中光合色素含量顯著增加，提高植株光合作用，最終促進(jìn)作物生長。因此，接觸輝光放電等離子體是一種合理、可行、有效的種子前處理方法。對紫花苜蓿種子的萌發(fā)和幼苗生長有顯著促進(jìn)作用。

作者貢獻(xiàn)說明徐毓鴻是本研究的實驗設(shè)計者和實驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；王婷、董文科、薛華麗參與實驗設(shè)計和試驗結(jié)果分析；蒲陸梅、龍海濤是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。所有作者均已閱讀并認(rèn)可該論文最終版的所有內(nèi)容。