朱煥錚 張濤 韓筠松 陳海 何仕均

1（中廣核達勝加速器技術(shù)有限公司 蘇州 215214）

2（中廣核達勝科技有限公司 蘇州 215214）

醫(yī)療廢棄物是醫(yī)院、診所等衛(wèi)生機構(gòu)在醫(yī)療以及其他相關(guān)活動中產(chǎn)生的具有直接或者間接感染性和其他危害的廢物［1-2］。醫(yī)療廢棄物中可能含有大量病原微生物和傳染性病毒［3］，如果處置不當(dāng)極易對土壤、水域、大氣造成不同程度的污染，危害人們的身體健康，因此，醫(yī)療廢棄物被列入《國家危險廢物名錄》（2021年版）［4］，感染性廢棄物代碼為841-001-01。2019年底，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的傳播導(dǎo)致醫(yī)療廢棄物產(chǎn)生量大幅增加［5］。目前，國內(nèi)疫情雖然已經(jīng)得到有效遏制，但仍有局部爆發(fā)。因此，醫(yī)用廢棄物亟需有效滅菌處理，否則很容易出現(xiàn)二次污染，甚至成為病毒的傳播源［6］。

依照國家相關(guān)法規(guī)，所有醫(yī)療垃圾和醫(yī)療污水都必須進行消毒處理。目前，醫(yī)療廢棄物的處理技術(shù)主要有焚燒處置（熱解焚燒［7-8］、回轉(zhuǎn)窯焚燒［9］和磁化裂解［10］）、非焚燒處置（高溫蒸汽處理［11-12］、化學(xué)處理［13］、微波處理［14］、等離子體法［15］和輻照［16］）。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，全球資源日益緊缺，在做好消毒的前提下，實現(xiàn)部分醫(yī)療廢棄物的資源化利用，有可能成為未來新的處理方式［17］。

電離輻照作為一項成熟的消毒滅菌技術(shù)，在醫(yī)療器械、制藥、食品及海關(guān)檢驗醫(yī)用材料等各個領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用［18］。電離輻照消毒滅菌的原理主要是作用于生物大分子上的高能射線，可以引起生物大分子的電離和激發(fā)，使DNA 或RNA 分子鏈斷裂、堿基脫落和氫鍵斷裂，或使機體的核酸、蛋白質(zhì)和酶等具有生命功能的物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞等，導(dǎo)致微生物新陳代謝紊亂或中斷［19］，引起微生物死亡。同時，醫(yī)療廢棄物中含有的水分子在吸收劑量后，會發(fā)生激活和電離，產(chǎn)生一系列的活性粒子。這些活性粒子可以與微生物體內(nèi)的生理性活性物質(zhì)發(fā)生一系列的氧化還原作用，最終引起微生物基體物理、化學(xué)和生理機能的變化，實現(xiàn)消毒與滅菌。

本文主要開展醫(yī)療廢棄物電子束滅菌的效果實驗，研究吸收劑量和醫(yī)療廢棄物材質(zhì)對微生物滅活效果的影響，為后續(xù)電子束滅菌技術(shù)的應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實驗所用微生物指示菌為短小芽孢桿菌ATCC27142， 批 次 211110， 菌 數(shù) 1.07×109CFU/mL；枯草芽孢桿菌ATCC9372，菌株批次21071905，菌數(shù)3.80×108CFU/mL，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 試劑

實驗所用試劑為0.9%無菌氯化鈉溶液，批次H21062603，廣西裕源藥業(yè)有限公司；胰酩大豆膿瓊脂培養(yǎng)基（TSA），批次200904，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器

臥式高壓蒸汽滅菌鍋，型號YX-600W，上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱，型號SPX-300B，上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；生物安全柜，型號BHC-1300ⅡA2，阿爾泰實驗室設(shè)備（北京）有限公司生產(chǎn)；電子加速器，型號RHODOTRON-TT200， 生產(chǎn)廠家 Ion Beam Applications S.A.。

1.1.4 染菌載體和模擬醫(yī)療廢棄物材料

染菌載體為2 cm×2 cm玻璃蓋玻片，醫(yī)療廢棄物模擬物為裁剪至Φ2 cm的棉球、2 cm×2 cm的紗布、2 cm×2 cm的SMMS無紡布手術(shù)服、長約4 cm的輸液管。

1.1.5 劑量片B3

薄膜劑量計。

1.2 方法

1.2.1 耗材滅菌

蓋玻片采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度為121 ℃，滅菌時間30 min。用于實驗的棉球、手術(shù)服、輸液管、紗布為環(huán)氧乙烷滅菌后的產(chǎn)品。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株準(zhǔn)備

從醫(yī)用冷藏冰箱中取出短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌定量菌株，冷卻至常溫備用。

1.2.3 蓋玻片染菌與裝配

實驗組：在一次性無菌培養(yǎng)皿（90 mm）中放置滅菌蓋玻片，吸取10 μL定量工作菌液均勻涂抹在蓋玻片上后，將培養(yǎng)皿置于生物安全柜中干燥（溫度18～26 ℃，濕度45%～65%），之后將培養(yǎng)皿蓋上后，用封口膜將培養(yǎng)皿側(cè)邊密封。將密封后的培養(yǎng)皿用雙面膠固定在塑料板表面，每個樣品設(shè)置3個平行樣。陽性對照組：與實驗組操作一致。陰性對照組：在一次性無菌培養(yǎng)皿（90 mm）中分別放置滅菌蓋玻片，不添加工作菌液，但在生物安全柜中與實驗組和陽性對照組干燥相同時間。劑量片的布放：在實驗組、陽性對照組和陰性對照組的每塊硬塑料板表面分別放置等同于實驗組數(shù)量的薄膜劑量片，用于檢測輻照過程中實際吸收劑量。劑量片的裝載模式同實驗組，置于無菌培養(yǎng)皿（90 mm）并密封。

1.2.4 醫(yī)療廢棄物模擬物染菌與裝配

實驗組：分別在一次性無菌培養(yǎng)皿（90 mm）中放置滅菌后的棉球、手術(shù)服片、輸液管、紗布片，然后分別吸取10 μL定量工作菌液均勻涂抹在上述載體上后，置于生物安全柜中干燥（溫度18～26℃，濕度45%～65%），干燥后將培養(yǎng)皿蓋上，并用封口膜將培養(yǎng)皿側(cè)邊密封，將密封后的培養(yǎng)皿用雙面膠固定在塑料板表面，每個樣品設(shè)置3 個平行樣。陽性對照組：與實驗組操作一致。陰性對照組：在一次性無菌培養(yǎng)皿（90 mm）中分別放置滅菌棉球、手術(shù)服片、輸液管、紗布片，不添加工作菌液，但在生物安全柜中與實驗組和陽性對照組干燥相同時間。劑量片的布放：在實驗組、陽性對照組和陰性對照組的每塊硬塑料板表面分別放置等同于各組實驗樣數(shù)量的薄膜劑量片，用于檢測輻照過程中實際吸收劑量。劑量片的裝載模式同實驗組，放置于無菌培養(yǎng)皿（90 mm）并密封。

1.2.5 輻照

將所有樣品干燥處理后，在中廣核達勝加速器技術(shù)有限公司輻照車間進行輻照。電子束掃描寬度86 cm，調(diào)節(jié)束流強度（3.6～8 mA）和傳輸速度（8.6～2.1 m/min）得到需要的吸收劑量。短小芽孢桿菌的輻照吸收劑量梯度設(shè)定為3 kGy、5 kGy、10 kGy、15 kGy、20 kGy 和25 kGy，枯草芽孢桿菌的輻照吸收劑量梯度設(shè)定為2 kGy、3 kGy、5 kGy、10 kGy、15 kGy和20 kGy。陽性對照組和陰性對照組：同批實驗樣送至輻照車間，在電子加速器不開機的狀態(tài)下傳輸。

1.2.6 樣品回收與計數(shù)

以無菌操作轉(zhuǎn)移實驗樣品至10 mL 洗脫液中，采用不同倍比稀釋法將洗脫液稀釋至合適的稀釋度，于漩渦振蕩器振蕩2 min后備用；產(chǎn)品洗脫液1 mL，接種于1 個平板。每平板注入約20 mL TSA，30～35°C 培養(yǎng)3～7 d。陽性對照組和陰性對照組：重復(fù)同樣操作。計數(shù)：按菌落計數(shù)原則進行計數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，計算出每個樣品的菌落數(shù)（CFU/SIP）。

1.2.7 吸收劑量

將輻照后的標(biāo)準(zhǔn)薄膜計量測試片進行測量，得出真正的吸收劑量。根據(jù)GB/T 25306—2010 輻射加工用電子加速器工程通用規(guī)范［20］中的劑量不均勻性公式所示，計算吸收劑量的不均性見式（1）。

式中：Ux為吸收劑量的不均勻性，%；Umax為最大吸收劑量，kGy；Umin為最小吸收劑量，kGy。

2 結(jié)果

2.1 吸收劑量對短小芽孢桿菌滅活效果的影響

輻照結(jié)束后，取出輻照箱里的B3 薄膜劑量計，測定吸光度并計算實際吸收劑量，然后根據(jù)公式計算劑量不均勻性。如表1所示，劑量的不均勻性最小為2.76%，最大為4.15%，劑量具有較好的平行性。

表1 吸收劑量的不均勻性Table 1 Nonuniformity of absorbed dose

電子束通過直接或間接作用產(chǎn)生的活性粒子破壞微生物的DNA、細胞內(nèi)膜的蛋白質(zhì)和脂肪（磷脂）分子，導(dǎo)致微生物新陳代謝紊亂、中斷，引起微生物死亡，實現(xiàn)消毒與滅菌［21］。由表2 可以看出，隨著吸收劑量的升高，短小芽孢桿菌的致死率逐漸增大，存活短小芽孢桿菌的菌落不斷減少。當(dāng)吸收劑量為3.4 kGy 時，菌落總數(shù)從9.13×106CFU/SIP降至2.92×105CFU/SIP；吸收劑量達到13.6 kGy 時，短小芽孢桿菌殺滅對數(shù)值達到6，電子束殺滅短小芽孢桿菌的效果較為顯著。王海宏等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在吸收劑量為2.36 kGy 時，電子束輻照使短小芽孢桿菌帶菌量從6.75×104CFU/g降至4.80×102CFU/g，較本實驗的輻照殺滅效果更好。分析原因可能為輻照時短小芽孢指示菌的介質(zhì)不同，文獻中短小芽孢桿菌的介質(zhì)為生理鹽水，輻照過程中水分子電離產(chǎn)生的活性自由基對短小芽孢桿菌的殺滅有一定的促進作用。

表2 吸收劑量對短小芽孢桿菌滅活效果的影響Table 2 Effect of absorbed dose on the inactivation of Bacillus pumilus

2.2 短小芽孢桿菌D10值

D10值是在一定電離輻射條件下，殺死90%原有殘存活菌數(shù)時所需劑量［23］，通過D10值可以了解微生物對射線的抵抗力，從而制定合理的吸收劑量和輻照工藝［19］。短小芽孢桿菌對射線具有較強的耐受力，因此在輻照過程中常被用作指示菌，以短小芽孢桿菌的殺滅來表征輻照滅菌的效果，同時根據(jù)它的D10值來確定輻照滅菌的劑量。

由圖1可以看出，輻照處理后存活短小芽孢桿菌菌落總數(shù)對數(shù)值與吸收劑量呈線性負相關(guān)。通過數(shù)據(jù)線性回歸分析，得到回歸方程，由回歸方程計算得D10為2.45 kGy。

圖1 吸收劑量與短小芽孢桿菌存活菌落對數(shù)的關(guān)系Fig.1 Effect of medical waste material on the inactivation of Bacillus pumilus

錢思敏等［24］研究發(fā)現(xiàn)，用短小芽胞桿菌E601株芽胞制作的電離輻射滅菌生物指示劑，對電子直線加速器照射的D10值為1.85 kGy。本文輻照的目標(biāo)菌株為短小芽孢桿菌輻照滅菌D10值與文獻報道的芽孢桿菌芽孢的D10值有較大差異，分析原因為菌片的干燥程度、載體的種類、輻照的均勻度以及初始微生物濃度等因素影響。孔秋蓮等［25］也證實了這一點，電子束輻照易殺滅存在于生理鹽水中的短小芽孢桿菌芽孢，其D10值為0.93 kGy；而存在于干濾紙片上的芽孢電子束輻照殺滅的D10值為2.75 kGy。因此研究載體對輻照殺滅微生物效果的影響，對于控制和殺滅醫(yī)療廢棄物中的微生物污染物具有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 醫(yī)療廢棄物材質(zhì)對短小芽孢桿菌滅活效果的影響

由表3可以看出，醫(yī)療廢棄物模擬物材質(zhì)對短小芽孢桿菌的提取與分離存在一定的影響。陽性對照實驗數(shù)據(jù)中，蓋玻片上芽孢存活數(shù)接近理論上稀釋后菌液的濃度，其次是輸液管。部分棉球樣品上檢測的芽孢存活對數(shù)值小于6，分析原因主要是蓋玻片和輸液管表面比較光滑，棉球比較粗糙，對芽孢有一定的吸附作用，影響了后續(xù)的分離檢測。

表3 醫(yī)療廢棄物材質(zhì)對短小芽孢桿菌滅活效果的影響Table 3 Effect of medical waste material on the inactivation of Bacillus pumilus

輻射對附著在醫(yī)療廢棄物上的短小芽孢桿菌都有較好的殺滅作用，菌株的致死率隨吸收劑量增大而明顯升高。當(dāng)吸收劑量為9 kGy時，可以發(fā)現(xiàn)，不同醫(yī)療廢棄物上的短小芽孢桿菌的殺滅效果不同，其中，紗布上短小芽孢桿菌的殺滅率為71.54%，蓋玻片上的殺滅對數(shù)值最小，短小芽孢桿菌菌落下降比率從大到小依次為紗布、棉球、無紡布、輸液管和蓋玻片，分析原因：可能為輻照后紗布上存活微生物較蓋玻片提取分離的難度更大，導(dǎo)致檢測到存活的微生物濃度偏低。在吸收劑量為13.6 kGy 時，蓋玻片、手術(shù)服、輸液管和紗布上的短小芽孢桿菌均已完全滅活。

2.4 吸收劑量對枯草芽孢桿菌滅活效果的影響

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，常被作為醫(yī)療用品消毒處理的微生物指示菌［26-27］，如現(xiàn)行HJ 228—2021 醫(yī)療廢棄物化學(xué)消毒集中處理工程技術(shù)規(guī)范［28］和HJ 229—2021醫(yī)療廢棄物微波消毒集中處理工程技術(shù)規(guī)范［29］均將其作為滅菌效果的指示菌。由表4可以看出，本組實驗劑量的不均勻性在2%～4%。由表5 可以看出，隨著吸收劑量的升高，枯草芽孢桿菌存活的菌落數(shù)量逐漸減少。當(dāng)吸收劑量為2.50 kGy 時，菌落總數(shù)從1.3×106CFU/SIP 降至1.13×104CFU/SIP；當(dāng)吸收劑量達到10.50 kGy 時，枯草芽孢桿菌殺滅對數(shù)值達到6。與短小芽孢桿菌相比，輻照對枯草芽孢桿菌殺滅的效果更為顯著。

表4 吸收劑量的不均勻性Table 4 Nonuniformity of absorbed dose

表5 吸收劑量對枯草芽孢桿菌滅活效果的影響Table 5 Effect of absorbed dose on the inactivation of Bacillus atrophaeus

2.5 枯草芽孢桿菌的D10值

由圖2可以看出，輻照處理后存活枯草芽孢桿菌菌落總數(shù)對數(shù)值與吸收劑量線性相關(guān)。通過數(shù)據(jù)線性回歸分析，得出D10為1.22 kGy。

圖2 輻照吸收劑量與枯草芽孢桿菌存活菌落對數(shù)的關(guān)系Fig.2 Effect of absorbed dose on the inactivation of Bacillus atrophaeus

有資料顯示，γ 射線滅活枯草芽孢桿菌的D10值為1.7～2.5 kGy［30-31］。韓偉等［32］研究不同化妝品基質(zhì)對輻照滅活枯草芽孢桿菌的效果，發(fā)現(xiàn)彩妝粉中的枯草芽孢桿菌的D10值最高達0.48，與本實驗研究存在一定差異，分析原因可能是基質(zhì)的含水率引起枯草芽孢桿菌D10的不同。

2.6 醫(yī)療廢棄物材質(zhì)對枯草芽孢桿菌滅活效果的影響

由表6可以看出，醫(yī)療廢棄物模擬物材質(zhì)對短小芽孢桿菌的提取與分離存在一定的影響。陽性對照組實驗數(shù)據(jù)中，蓋玻片上初始枯草芽孢桿菌菌落數(shù)對數(shù)值為6，其次為輸液管，棉球上檢出的初始枯草芽孢桿菌菌落對數(shù)值為5，分析原因主要為醫(yī)療廢棄物的粗糙程度不同所致。當(dāng)吸收劑量為5.5 kGy 時，附著在輸液管中的枯草芽孢桿菌的殺滅對數(shù)值達到6，枯草芽孢桿菌菌落下降比率從大到小依次為輸液管、蓋玻片、棉球和無紡布。較短小芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌的輻照耐受性略低。當(dāng)吸收劑量達到10.5 kGy 時，枯草芽孢桿菌的殺滅對數(shù)值全部達到6。

表6 醫(yī)療廢棄物材質(zhì)對枯草芽孢桿菌滅活效果的影響Table 6 Effect of medical waste material on the inactivation of Bacillus subtilis

駱琦［33］研究也發(fā)現(xiàn)，在吸收劑量為12 kGy時，枯草芽孢桿菌的殺滅對數(shù)值接近7，輻照后電鏡照片顯示枯草芽孢桿菌表面由光滑、平整變?yōu)榘枷莺婉薨?，說明電子束對枯草芽孢桿菌細胞造成嚴重破壞。

有資料證明，因微生物種類不同，其抗輻射性的能力可發(fā)生上百倍的差別，甚至同一菌群的不同菌株抗輻射能力亦不同，因此選擇合適的指示菌是必要的。目前，在世界范圍內(nèi)，用于輻照滅菌的生物指示菌尚未統(tǒng)一。但目前在醫(yī)療廢棄物處理技術(shù)規(guī)范中使用最多的為枯草芽孢桿菌，通過本文研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對電子束的耐受值較短小芽孢桿菌更低，因此輻照技術(shù)處理醫(yī)療廢棄物工程實踐中，選用短小芽孢桿菌作為指示菌較枯草芽孢桿菌更具有代陳表性。

3 結(jié)論

輻照殺滅短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌菌落6個對數(shù)值，所需的吸收劑量分別為13.6 kGy 和10.5 kGy，短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的D10值分別為2.45 kGy和1.22 kGy，短小芽孢桿菌較枯草芽孢桿菌的輻照耐受性更高。醫(yī)療廢棄物的材質(zhì)對于短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的提取分離具有不同的影響，可能存在輻照后存活微生物無法提取和分離完全，導(dǎo)致實測滅活效果偏大的現(xiàn)象。

作者貢獻說明朱煥錚和何仕均提出了本文的研究思路和試驗方案；朱煥錚和張濤完成了本工作中輻照和微生物分析檢測試驗及論文的撰寫；韓筠松協(xié)助完成輻照及微生物分析檢測試驗；陳海為數(shù)據(jù)分析整理和論文撰寫提供了指導(dǎo)。所有作者均已閱讀并認可該論文最終版的所有內(nèi)容。