吳德靜，范 芳，陳佳瑜，葛正龍

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

衰老是一種不可抗拒的自然規(guī)律，生物體的衰老發(fā)生在機體的各個層面，包括細胞、組織及器官，而細胞是生命的基本組成單位，細胞衰老被認為是人類衰老的基礎(chǔ)[1]。

何首烏苷(2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是傳統(tǒng)中藥何首烏的主要活性成分，具有多種生物活性和藥用價值，包括抗衰老、抗氧化(通過清除自由基)、抗高膽固醇血癥、抗動脈粥樣硬化、抗炎、保肝和抗腫瘤作用等[2]。何首烏的抗衰老機制可以通過調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能，清除衰老動物體內(nèi)自由基和抗氧化作用來達到抗衰老延年作用[3-4]，但具體分子機制還未明了。Gstm3(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶 M3)是一種 II 期轉(zhuǎn)移酶，有研究指出，Gstm3與許多氧化應(yīng)激及年齡相關(guān)疾病的發(fā)病機制有關(guān)[5-6]，但在細胞水平上探討Gstm3在何首烏苷延緩衰老中的作用還未見報道。本研究以SH-SY5Y細胞為研究對象，通過轉(zhuǎn)染Gstm3干擾載體下調(diào)Gstm3的表達，進而探討Gstm3在何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞衰老中發(fā)揮的作用及可能的機制，為探索何首烏苷延緩衰老的作用靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株 SH-SY5Y，購自北納生物公司。

1.2 藥物與試劑 何首烏苷(成都埃法生物，批號：AF21042756)；胎牛血清(BI，批號：2106043)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco，批號：8121340、8121308)；Anti-β-Tubulin、Anti-Gstm3 antibody、Anti-Bax antibody、二抗山羊抗兔(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號分別為：00090708、00047625、50599-2-Ig、20000258)；Anti-Bcl-2 antibody(沈陽萬類生物科技有限公司，批號：L12161556)；D-半乳糖、二抗稀釋液、RIPA 裂解液、5% BSA 封閉液(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：SLCH96、MB9888-Aug-04F、20201126、20210609)；CCK-8 試劑盒(碧云天生物技術(shù)，批號：061521210723)凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA1024)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore,批號：2017801);蛋白Marker(美國Thermo，批號：01003978)；TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本Takara，批號：AJF2575A)；Gstm3shRNA 載體類型：pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO。

1.3 儀器 Western blot 電泳儀、實時熒光定量 PCR 儀、全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國 BIO-RAD 公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；核酸定量儀(美國Thermo公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本松下公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱、震搖型加熱金屬浴(上海一恒公司)；低溫高速離心機(德國艾本德公司)、-80℃超低溫冰箱(澳柯瑪公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細胞從液氮中取出，細胞復(fù)蘇后移入細胞培養(yǎng)瓶，并加入DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 mg/mL、10%FBS)4 mL，放入細胞培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)中孵育。培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)瓶底部約 80%～90% 時進行傳代后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.4.2 細胞轉(zhuǎn)染及Gstm3干擾載體的篩選 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，按5×105個/(2 mL·孔)的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，當(dāng)細胞生長至孔板面積70%時，移去6孔板中的原培養(yǎng)基，并加入1 mL含polybrene(終濃度為3 μg/mL)的無FBS的DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)病毒滴度和細胞量加入相應(yīng)體積的病毒原液，培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)孵育4 h后每孔補充1 mL含10% FBS的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，移去6孔板中含病毒的培養(yǎng)基，換上無病毒的含10% FBS完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置分組為：空白對照組(NC)、陰性對照組(shNC)、Gstm3-shRNA1組(sh1)、Gstm3-shRNA2組(sh2)和Gstm3-shRNA3組(sh3)，每組均設(shè) 3 個平行樣。轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞，絕大部分細胞被轉(zhuǎn)染上病毒，移去6孔板中的培養(yǎng)基，換上濃度為3 μg/mL含puromycin培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)1周，進行后續(xù)實驗。隨后收集細胞，提取 RNA和蛋白，篩選沉默效率最高的干擾載體，后續(xù)試驗將轉(zhuǎn)染該組的SH-SY5Y細胞設(shè)為Gstm3沉默組(shGstm3-P/D組)。

1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測Gstm3 mRNA水平 提取轉(zhuǎn)染后及藥物處理后的各組細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，實時熒光定量PCR進行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增40循環(huán)。繪制擴增曲線和融解曲線，采用2-ΔΔCT法計算mRNA表達水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列見表 1 所示。

1.4.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中Gstm3、Bcl-2、Bax蛋白表達 收集細胞，加入一定量含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，制備成上樣蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% BSA室溫封閉1h后，用 Gstm3、Bcl-2、Bax、β-Tubulin 抗體(1∶2 000，1∶1 000，1∶4 000，1∶5 000)置于4 ℃冰箱孵育過夜，再用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，經(jīng)ECL反應(yīng)，最后采用BIO-RAD ChemiDocTMtouch imaging System 檢測蛋白條帶ECL化學(xué)發(fā)光信號，并用 ImageLab 軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對含量=目的條帶灰度值/對應(yīng) β-Tubulin 灰度值。

1.4.5 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測細胞端粒長短 將NC組、D-Gal組、P/D組、shGstm3-P/D組細胞按實驗方案給與何首烏苷和D-Gal處理后，應(yīng)用細胞DNA提取試劑盒提取各組細胞基因組DNA后，實時熒光定量PCR進行反應(yīng)，反應(yīng)體系為12 μL，以36B4為內(nèi)參。端粒PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min；95 ℃，15 s，69 ℃，1min，69 ℃收集熒光，40個循環(huán)。內(nèi)參PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min；95 ℃，15 s，62 ℃，1 min，60 ℃收集熒光，40個循環(huán)。繪制擴增曲線和融解曲線，采用2-ΔΔCT法計算mRNA表達水平。引物序列見表1所示。

表1 RCR引物序列

1.4.6 CCK-8檢測細胞活力 將NC組、D-Gal組、P/D組、shGstm3-P/D組細胞以2×104cells/孔的密度接種于96孔板中，且每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時設(shè)無細胞的空白對照孔，每組6個平行樣。先用2 μg/mL何首烏苷處理各組細胞24 h后，再用200 mM D-Gal和何首烏苷共同處理48 h，處理結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度A值，并根據(jù)A值計算細胞活力。

1.4.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的空白對照組(NC-P/D，SH-SY5Y細胞)、陰性對照組(shNC-P/D)和Gstm3沉默組(shGstm3-P/D)細胞系，按5 × 104個/(2 mL·孔)接種至 6 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，每組3個平行樣。按實驗方案給予何首烏苷和D-Gal處理后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞后，用PBS洗滌細胞二次(離心1 000 r/min，5 min)；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；再加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD，混勻；于室溫避光反應(yīng)15 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。

2 結(jié)果

2.1Gstm3干擾載體的篩選 qPCR和WB檢測結(jié)果顯示，Gstm3-shRNA1組SH-SY5Y細胞中Gstm3 mRNA和蛋白表達水平最低，且較NC組和shNC組明顯降低(P<0.01，見圖1)。熒光倒置顯微鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染Gstm3干擾載體的SH-SY5Y 細胞生長狀態(tài)良好，可見綠色熒光蛋白表達，轉(zhuǎn)染效率較高(見圖2)。篩選出沉默效率最高的 Gstm3-shRNA1 進行后續(xù)試驗。

A：mRNA表達情況；B:蛋白表達情況；*、**：與 NC 和 shNC 組比較，P<0.05，P<0.01；n=3。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y熒光鑒定

2.2 轉(zhuǎn)染Gstm3干擾載體后SH-SY5Y細胞中Gstm3 mRNA和蛋白水平的表達 結(jié)果顯示，與NC-P/D組和shNC-P/D組比較，shGstm3-P/D組中Gstm3的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，見圖3。

A：mRNA表達情況；B:蛋白表達情況；**、***：與 NC-P/D 和 shNC-P/D 組比較，P<0.01，P<0.001；n=3。

2.3 何首烏苷對攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞端粒長度的變化 結(jié)果顯示，與NC組比較，D-Gal組端粒長度明顯縮短(P<0.05)；與D-Gal組比較，P/D組端粒長度明顯增加(P<0.05)；而與P/D組比較，shGstm3-P/D組端粒長度明顯縮短(P<0.01)，見圖4。

*：與NC組比較，P<0.05；#：與D-Gal組比較，P<0.05；**：與P/D組比較，P<0.01；n=3。

2.4 何首烏苷對攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞活力的影響 結(jié)果顯示，與NC組比較，D-Gal組細胞活力明顯下降(P<0.001)；與D-Gal組比較，P/D組細胞活力明顯升高(P<0.01)；而與P/D組比較，shGstm3-P/D組細胞活力明顯下降(P<0.001)，見圖5。

**：與D-Gal組比較，P<0.01；***：與NC組比較，P<0.001；###：與P/D組比較，P<0.001；n=3。

2.5 何首烏苷對攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，與NC-P/D組及shNC-P/D組比較，shGstm3-P/D組SH-SY5Y細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯降低，促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖6。

*：與NC-P/D組和shNC-P/D組比較，P<0.05；n=3。

2.6 何首烏苷對攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞凋亡率的影響 結(jié)果顯示，與NC-P/D組及shNC-P/D組比較，shGstm3-P/D組SH-SY5Y細胞凋亡率增加(P<0.001)，見圖7。

***：與NC-P/D組和shNC-P/D組比較，P<0.001；n=3。

3 討論

衰老是一個普遍的過程，伴隨著認知和身體損傷的逐漸累積以及患多種疾病的風(fēng)險增加，包括癌癥、糖尿病及神經(jīng)退行性疾病等。因此，探索衰老本質(zhì)和尋求抗衰老的方法、藥物的研究已成為當(dāng)今熱門課題。何首烏(Polygonum multiflorum thunb，PM)是一種傳統(tǒng)中草藥，具有烏發(fā)，強筋骨，補肝腎，延年益壽等作用，何首烏苷(2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是從PM中提取的主要活性成分之一，已被證明具有很強的抗氧化和清除自由基的活性，在抗衰老和抗衰老相關(guān)疾病治療中表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能[7-8]。Gstm3屬于超基因酶家族，參與毒素和酶的II期解毒，可消除氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物，已被證實參與多種腫瘤及年齡相關(guān)性疾病如白內(nèi)障、阿爾茨海默病、骨關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生發(fā)展[9-12]，并且與細胞凋亡密切相關(guān)[13-14]，但對于Gstm3在何首烏苷延緩衰老中的作用及可能的機制研究還未見報道。

慢病毒干擾技術(shù)能夠高效、特異地沉默基因的表達，是重要的下調(diào)基因的手段之一，該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用[15-17]。本研究以SH-SY5Y細胞為基礎(chǔ)，通過轉(zhuǎn)染Gstm3干擾載體成功下調(diào)Gstm3表達，探討Gstm3在何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞衰老中的作用及可能的機制，為探索何首烏苷延緩衰老的作用靶點提供實驗基礎(chǔ)。qPCR和WB檢測結(jié)果顯示，Gstm3-shRNA1組SH-SY5Y細胞中Gstm3 mRNA 和蛋白表達水平最低，且較NC組和shNC組明顯降低，故選取沉默效率最高的Gstm3-shRNA1進行后續(xù)試驗，同時觀察攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞中Gstm3 mRNA和蛋白水平的表達變化，結(jié)果顯示，下調(diào)Gstm3后，shGstm3-P/D組SH-SY5Y細胞Gstm3 mRNA和蛋白水平降低。

目前判斷細胞衰老的指標(biāo)有端粒長短、細胞活力及活性氧等。端粒是存在于染色體末端的基因序列，作為衰老的生物標(biāo)志物，隨著年齡的增長長度逐漸縮短[18-19]，同時細胞衰老時會出現(xiàn)細胞活力下降[20]。為了探討Gstm3在何首烏苷延緩細胞衰老中的作用，本研究觀察了下調(diào)Gstm3后對細胞的端粒長短和細胞活力的影響。結(jié)果顯示，與NC組比較，D-Gal組端粒長度明顯縮短，細胞活力下降；與D-Gal組比較，P/D組端粒長度明顯增加，細胞活力升高；而與P/D組比較，shGstm3-P/D組端粒長度明顯縮短，細胞活力明顯下降，說明Gstm3參與了何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞的衰老。

細胞衰老與細胞凋亡密切相關(guān)，表現(xiàn)為凋亡相關(guān)蛋白及細胞凋亡率的增加[21-24]。而細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，對正常的生物體發(fā)育、組織維持和整體生物體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[25]。在調(diào)控細胞凋亡的過程中，抗凋亡蛋白Bcl-2在細胞周期的任何階段均可抑制細胞凋亡，促凋亡Bax蛋白作為Bcl-2家族的一個重要成員，在凋亡途徑中可與抗凋亡蛋白結(jié)合并抑制其活性，降低Bcl-2/Bax 的比值而啟動細胞凋亡[26-27]。為進一步了解Gstm3在何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞衰老中可能的機制，對三組細胞(NC-P/D組、shNC-P/D組、shGstm3-P/D組)給予何首烏苷和D-Gal處理后，觀察攜帶Gstm3 shRNA序列的SH-SY5Y細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax蛋白水平的表達變化和細胞凋亡率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shGstm3-P/D組細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，促凋亡蛋白Bax的表達增加，同時流式細胞術(shù)凋亡結(jié)果顯示，shGstm3-P/D組細胞的凋亡率較NC-P/D組及shNC-P/D組明顯增加，上述結(jié)果提示Gstm3參與了何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞的衰老，這一過程可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達及細胞凋亡率變化相關(guān)。

綜上所述，本研究表明Gstm3參與了何首烏苷延緩SH-SY5Y細胞的衰老，這一過程可能是通過降低抗凋亡蛋白的表達，增加促凋亡蛋白的表達以及提高細胞凋亡率來實現(xiàn)，但確定Gstm3是否是何首烏苷延緩衰老的作用靶點還有待進一步研究。