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      熒光示蹤及斜向組織切片展示小鼠內(nèi)側(cè)韁核-腳間核神經(jīng)環(huán)路投射

      2022-06-28 11:56:18馬夢(mèng)欣吳海濤
      關(guān)鍵詞:環(huán)路腦區(qū)切片

      馬夢(mèng)欣 常 欣 李 燊 吳 燕 吳海濤 劉 磊

      (1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系,北京100069;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所 軍事認(rèn)知與應(yīng)激醫(yī)學(xué)研究室,北京 100850)

      內(nèi)側(cè)韁核(medial habenular nucleus,MHb)至腳間核(interpeduncular nucleus,IPN)神經(jīng)環(huán)路與腦內(nèi)眾多神經(jīng)環(huán)路一樣,在調(diào)控大腦生理功能方面發(fā)揮重要作用。以往研究[1]顯示,韁核損傷的大鼠在莫里斯水迷宮(空間學(xué)習(xí)和記憶的一項(xiàng)測(cè)試)中比對(duì)照組大鼠游得更快,韁核損傷的大鼠可能對(duì)壓力反應(yīng)較為敏感,并且被損傷的大鼠只有在足部電擊的強(qiáng)度較高(高應(yīng)激)狀態(tài)下,才表現(xiàn)出主動(dòng)回避學(xué)習(xí)受損,而此大鼠在低壓力條件下,回避學(xué)習(xí)行為卻不受影響,這表明韁核損傷的大鼠對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)障礙更敏感。同樣,對(duì)后屈束(fasciculus retroflexus,F(xiàn)r)連接組織造成損傷,則會(huì)導(dǎo)致大鼠血漿皮質(zhì)酮濃度的慢性升高[2]。綜上所述,MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路的主要功能是調(diào)節(jié)動(dòng)物在應(yīng)激狀態(tài)下的學(xué)習(xí)和決策能力。另外,一些使用大鼠、小鼠和斑馬魚(yú)進(jìn)行MHb損傷相關(guān)的研究[3]結(jié)果顯示,MHb-IPN通路在調(diào)節(jié)空間學(xué)習(xí)和記憶、恐懼獲得、被動(dòng)和主動(dòng)回避學(xué)習(xí)以及焦慮方面具有重要作用。

      韁核(habenula nucleus,Hb)被第三腦室[4]前后、背側(cè)和后方包圍。Hb有兩個(gè)明顯的成對(duì)分裂,即內(nèi)側(cè)和外側(cè)兩部分。每個(gè)部分都有不同的神經(jīng)纖維的傳入和傳出連接,包括彼此之間的相互連接[5]。兩側(cè)韁核對(duì)應(yīng)亞區(qū)之間存在大量的纖維聯(lián)系,形成韁連合。韁核是前腦與中腦及腦干信息傳遞的中繼站,前腦的傳入纖維主要經(jīng)髓紋到達(dá)韁核,而韁核的傳出纖維則主要經(jīng)Fr投射至中腦和腦干,這為其參與不同的功能提供了環(huán)路基礎(chǔ)[6]。MHb腹側(cè)的投射性神經(jīng)元主要為谷氨酸與乙酰膽堿共釋放的神經(jīng)元IPN的中間區(qū)域,背側(cè)則主要為谷氨酸與 P 物質(zhì)(substance P,SP)共釋放的神經(jīng)元,主要投射到腳間核周邊區(qū)[7]。盡管許多研究使用了腺相關(guān)病毒的順行和逆行追蹤方法,但還未精準(zhǔn)地確定以上兩個(gè)腦區(qū)以及連接組織出現(xiàn)在同一水平面下所能呈現(xiàn)完整的環(huán)路投射的腦組織切割角度,本文通過(guò)對(duì)腦組織進(jìn)行角度切割處理,利用小鼠腦組織切片,熒光成像方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法介紹,為MHb-IPN投射環(huán)路的結(jié)構(gòu)分析和功能研究提供有力技術(shù)手段,具有一定的實(shí)用借鑒價(jià)值。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      8周齡野生型(wild type, WT)成年雄性C57BL/6小鼠以及8周齡ChAT-Cre;Ai9紅色熒光報(bào)告小鼠均采購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,獲得審批的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。均飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(軍)2017-0023],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)操作獲軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):IACUC-DWZX-2020-668),符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則。

      1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

      PCR 儀(德國(guó)Eppendorf公司),冰凍切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司),常溫臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),凝膠成像儀(美國(guó)Alphared公司),微量注射(中國(guó)瑞沃德公司),玻璃電極(美國(guó)Sutter公司),立體定位儀(中國(guó)瑞沃德公司)等。

      1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

      4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(中國(guó)索萊寶公司),75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(中國(guó)利爾康醫(yī)療公司),MgCl2、NaCl(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司),冰凍切片包埋劑(日本櫻花公司),蓋玻片(中國(guó)中衫金橋公司),含DAPI 封片劑(中國(guó)中衫金橋公司),戊巴比妥鈉(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司),載玻片(中國(guó)中衫金橋公司),蔗糖(美國(guó)Thermo公司)等。

      1.1.4 實(shí)驗(yàn)工具病毒信息表

      所用腺病毒順行示蹤的含人突觸蛋白元件的綠色增強(qiáng)熒光腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus human synapsin enhanced green fluorescent protein,AAV-hSyn-EGFP),逆向示蹤的綠色增強(qiáng)熒光重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus2-retro-enhanced green fluorescent protein,rAAV2-retro-EGFP),詳見(jiàn)表1。

      表1 腺病毒列表Tab.1 Adenovirus list

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 小鼠基因型鑒定

      1)基因組制備:①基因提取: 消毒眼科剪刀快速剪下約0.5 mm 的鼠尾和腳趾,取下的組織樣品放在 1.5 mL EP 管中,注意標(biāo)記 EP 管上小鼠標(biāo)號(hào)。②配制裂解液:蛋白酶 K(2 μL)+Mg2+緩沖液(10 μL)+H2O(88 μL),每個(gè)EP管內(nèi)總體為 100 μL 體系,向放入組織并編好號(hào)的EP管中加入裂解液,離心機(jī)瞬時(shí)離心(確保樣品置于裂解液中)。③ 56 ℃水浴鍋裂解 5~6 h 或過(guò)夜。④取出后放入電磁爐 100 ℃煮沸樣品 10 min。⑤放入離心機(jī)12 000 r/min,5 min后置于 4 ℃保存。⑥制備反應(yīng)體系并放入PCR 儀中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為Ai9基因:94 ℃熱變性2 min,然后94 ℃變性20 s,65 ℃復(fù)性15 s,68 ℃延伸15 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸2 min,8 ℃保溫。ChAT基因:94 ℃熱變性3 min,然后94 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸2 min,8 ℃保溫。

      2)基因型鑒定:①制備瓊脂糖凝膠:稱質(zhì)量2 g的 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠溶于 100 mL 1×TAE 后,置于錐形瓶中微波爐加熱溶解后,稍作冷卻加入10 μL Gel Red 核酸染料后混勻,進(jìn)行插排梳、倒板,直至完全冷卻,液體轉(zhuǎn)為固體后拔梳。②上樣:每排第一個(gè)孔上加入標(biāo)記條帶Marker 10 μL,后面依次加入擴(kuò)增后的樣本體系液。③電泳程序: 電壓140 V,時(shí)間30 min。④紫外線下照膠,記錄結(jié)果,并核對(duì)小鼠編號(hào),選取符合條件的基因型小鼠,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)分組方法

      使用SPSS 13.0軟件對(duì)入組對(duì)象進(jìn)行編號(hào),為了使上述分組結(jié)果具有重現(xiàn)性,在分組之前設(shè)定隨機(jī)種子,然后通過(guò)生成一列隨機(jī)數(shù)字并將其命為Random,利用Rv-Uniform函數(shù)在設(shè)定范圍內(nèi)生成一系列隨機(jī)數(shù)字,最后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字大小進(jìn)行排序分組,使用Visual Binning功能快速分組,命名為新劃分的組別名稱,即可得到隨機(jī)分組結(jié)果。

      1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠分組

      ChAT-Cre;Ai9熒光報(bào)告小鼠則根據(jù)基因鑒定結(jié)果依次選出5只,設(shè)為熒光報(bào)告小鼠組(A組);將10只WT小鼠采用1.2.2中的分組方法隨機(jī)分配到B、C兩組,給予不同的病毒注射,其中B為順行病毒示蹤組,C為逆行病毒示蹤組,每組各5只。

      1.2.4 重組腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated virus,AAV)病毒注射前手術(shù)準(zhǔn)備過(guò)程

      1)動(dòng)物手術(shù)前麻醉、備皮:①小鼠腹腔注射濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉進(jìn)行小鼠麻醉。②用單層剃須刀片刮掉小鼠頭頂上的毛發(fā)。③將小鼠放在加熱墊上,以保持穩(wěn)定的體溫(注:小鼠麻醉后不能調(diào)節(jié)體溫,將其放在加熱墊上可以避免手術(shù)過(guò)程中體溫明顯下降)。④在小鼠的眼睛上涂上紅霉素軟膏,以防止手術(shù)中眼部的干澀以及強(qiáng)光照射導(dǎo)致的不適。⑤使用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對(duì)頭部皮膚進(jìn)行消毒。

      2)動(dòng)物固定以及病毒注射準(zhǔn)備:①將小鼠的門牙固定在立體定向儀上適配器的前夾上,調(diào)整適配器的位置,使耳桿可以很容易地插入耳道,使頭部較平穩(wěn)地固定住(注:確保小鼠頭部牢固地固定在適配器的前夾上)。②用手術(shù)刀做一個(gè)1.5 cm的前后切口。③用含0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)的無(wú)菌棉簽輕輕擦拭以清潔頭骨表面,確保前后囟點(diǎn)以及顱骨縫清晰可見(jiàn)。④將玻璃電極中注滿礦物油,用熱熔膠固定于10 μL的微量注射器上,并排出管內(nèi)以及玻璃電極內(nèi)所有氣泡。將制好的微量注射器固定于微量注射泵上吸取適量病毒準(zhǔn)備注射。

      1.2.5 腦立體定位及病毒微量注射

      1)腦立體定位與注射坐標(biāo):腦立體定位與注射坐標(biāo)示意圖詳見(jiàn)圖1A、B、C。

      2)顱鉆開(kāi)顱:①將針尖移動(dòng)到前囟點(diǎn)調(diào)平零點(diǎn),作為三個(gè)軸的參照點(diǎn),從這一點(diǎn)確定其他坐標(biāo)。②通過(guò)前后囟點(diǎn)顯示的高度,調(diào)整頭部至水平。③根據(jù)小鼠腦圖譜冊(cè)定位至MHb坐標(biāo)位點(diǎn)后利用顱骨鉆進(jìn)行直徑0.5 mm的淺小孔(切勿鉆入大腦,防止皮質(zhì)損傷)(圖1 D),同上操作,在IPN位點(diǎn)也進(jìn)行鉆孔(圖1 E)。

      3)AAV病毒微量注射方法:①隨后將注射器插入到已鉆好孔處MHb目標(biāo)腦區(qū)(圖1 F)、IPN目標(biāo)腦區(qū)(圖1G)進(jìn)行病毒注射。②MHb病毒注射具體坐標(biāo)為:小鼠腦背側(cè)到腹側(cè)(dorsal-ventral,DV):-2.50 mm、前端到后端(anterior-posterior,AP):-1.06-2.06 mm、內(nèi)側(cè)到外側(cè)(medial-lateral,ML):0.25 mm(圖1B);IPN具體坐標(biāo)為:DV:-4.65 mm、AP:-3.45~-3.52 mm、ML:0.00 mm(圖1C)。③順行示蹤病毒:AAV-hSyn-EGFP注射速度為8 nL/min,注射量為80 nL,逆行示蹤病毒:rAAV-retro-EGFP注射速度為30 nL/min,注射量為300 nL。等待病毒注射完成后至少停針10 min后緩慢移出。④手術(shù)完成后縫合切口,等待小鼠蘇醒,病毒注射完成后飼養(yǎng)3周后心臟灌流后取腦。

      圖1 立體定位注射腺病毒到成年小鼠內(nèi)側(cè)韁核和腳間核區(qū)域Fig.1 The virus was injected stereoscopically into the medial habenular nucleus and interpeduncular nucleus regions of adult mice

      1.2.6 小鼠腦組織切片樣本制備

      1)小鼠腦組織灌流固定:①首先稱小鼠體質(zhì)量,按照體質(zhì)量腹腔適量注射1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉,等待小鼠深度麻醉后,小心剪開(kāi)小鼠胸腔,充分暴露心臟。②分別用生理鹽水和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛從左心室緩慢灌流(在通風(fēng)櫥進(jìn)行),出現(xiàn)肝臟完全變白,右心耳處無(wú)血液流出以及推入 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液致小鼠尾巴輕輕顫動(dòng),小鼠四肢僵硬狀態(tài)后,即完成灌流過(guò)程。③隨后將腦組織完整取出,放入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中,于4 ℃冰箱中后固定24 h。

      2)腦片制備步驟:①固定完成后,依次用15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃度的蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水,直至腦組織樣品沉入蔗糖溶液底部,約48 h。②取出腦組織后用濾紙仔細(xì)吸干表面的蔗糖溶液.首先將腦組織兩側(cè)部分組織平行切割,兩側(cè)厚度約0.1 mm,保證整體組織的矢狀面放置在平面時(shí)較為穩(wěn)定,方便切割操作(圖2A,B)。③將其以矢狀呈現(xiàn)面放置在已制作好的34°平行切割角度的具有防水層的底板上(圖2C),矢狀腦組織切割完成后(圖2D~F),隨后以冠狀切片方向?qū)⒛X組織放入腦組織凍存模具中(圖2 G),使用聚乙二醇和聚乙烯醇(optimal cutting temperature compound,OCT)在冰凍切片機(jī)中進(jìn)行包埋固定(圖2 H)。④等待30 min后,樣品徹底固定后,使用冰凍切片機(jī)切成厚度一般為40 μm的冠狀腦片,貼在載玻片上晾干防止掉片。⑤最后使用PBS清洗3次,每次5 min,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。將含有DAPI的封片劑滴在玻片上進(jìn)行封片,盡量避免氣泡,然后用指甲油密封。

      圖2 小鼠斜向切片腦組織樣本修整以及制備Fig.2 Trimming and preparation of brain tissue samples from oblique sections of mice

      1.2.7 熒光成像及數(shù)據(jù)分析

      將封片后并晾干的小鼠腦組織切片用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集。首先對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描,以獲得高分辨率光學(xué)切片圖像,選用10×光學(xué)鏡頭,在軟件中選中Z-stack,顯示Multidimensional acquisition菜單,在此菜單分別設(shè)置起止點(diǎn),常用start/end設(shè)置起止點(diǎn)模式,在圖像預(yù)覽時(shí)設(shè)置成像范圍的起點(diǎn)和終點(diǎn),同時(shí)設(shè)置光學(xué)掃描切片之間的間隔層數(shù),若無(wú)確定把握可參考Optimal功能設(shè)置間隔層數(shù)和數(shù)量,采用系統(tǒng)推薦數(shù)值。下一步進(jìn)行目標(biāo)視野范圍下大視野拼圖過(guò)程,對(duì)目標(biāo)區(qū)域按照設(shè)置進(jìn)行每個(gè)局部組織的層掃,結(jié)束后拼接成完整成像,如圖3整體圖像拼接大小為9(長(zhǎng))×6(寬)左右。最后得到完整拼接圖后,導(dǎo)出圖像并利用Adobe Illustrator軟件下的文字和套索工具結(jié)合艾倫(Allen brain)小鼠腦圖譜冊(cè)對(duì)比分析,確定圖像中的解剖結(jié)構(gòu),對(duì)目標(biāo)腦區(qū)區(qū)域較為準(zhǔn)確地做出標(biāo)記。

      圖3 ChAT-Cre;Ai9紅色熒光報(bào)告小鼠MHb-IPN環(huán)路投射Fig.3 ChAT-Cre;Ai9 red fluorescence report mouse MHb-IPN projection display

      2 結(jié)果

      AAV是一種強(qiáng)大的工具,該技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值,腺病毒可用于特定腦區(qū)靶向注射從而發(fā)現(xiàn)上下游所關(guān)聯(lián)的腦區(qū),在MHb區(qū)域注射順行示蹤病毒(AAV2/9-hSyn-EGFP)用以示蹤其下游IPN腦區(qū)(圖4),在IPN注射逆行示蹤病毒(rAAV2-retro-EGFP)用以追蹤其上游MHb腦區(qū)(圖5)。分別注射綠色熒光病毒至小鼠大腦兩個(gè)腦區(qū),最后根據(jù)斜切的矢狀熒光圖均顯示MHb-IPN有穩(wěn)定的投射關(guān)系,是以兩條后屈束(Fr)從MHb區(qū)投射到下游IPN區(qū)。

      圖4 MHb(雙側(cè))注射順行示蹤病毒AAV2/9-hSyn-EGFP投射結(jié)果Fig.4 AAV2/9-hSyn-EGFP injected into bilateral MHb region was traced to IPN display

      圖5 IPN注射逆行示蹤病毒rAAV2-retro-EGFP投射結(jié)果Fig.5 Retrograde tracing of IPN injected virus rAAV2-retro-EGFP

      3 討論

      在內(nèi)側(cè)韁核-角間核通路存在大量乙酰膽堿能的神經(jīng)投射,本研究通過(guò)利用腺病毒工具以及ChAT-Cre;Ai9報(bào)告小鼠來(lái)展示在特定的角度34°斜向切片的技術(shù)下MHb-IPN兩腦區(qū)之間通過(guò)后屈束(Fr)連接結(jié)構(gòu)形成的完整的上下游投射關(guān)系。

      首先,MHb-IPN環(huán)路上存在非常多且重要的功能聯(lián)系,Hb是前腦和中腦及腦干之間信息傳遞的中繼站,與前額葉、隔核、被蓋和腦干的單胺類核團(tuán)有廣泛的纖維聯(lián)系[8]。因?yàn)檫@些腦區(qū)與精神障礙、情緒和認(rèn)知功能密切相關(guān),所以韁核在神經(jīng)和精神疾病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。現(xiàn)有研究[9]顯示,韁核在神經(jīng)病理性疼痛、抑郁癥、藥物成癮和精神分裂癥等多種神經(jīng)、精神疾病中發(fā)揮作用。

      IPN比大腦的其他任何部分都表現(xiàn)出更依賴膽堿能神經(jīng)傳遞的過(guò)程[10-11],但I(xiàn)PN對(duì)乙酰膽堿的利用途徑還未清晰確定,但可能主要來(lái)自MHb的投射[12]。MHb區(qū)神經(jīng)元和投射到IPN中央和中間亞核的末端區(qū)中都存在大量的ChAT[13-15]。然而,MHb也釋放其他神經(jīng)調(diào)節(jié)劑,包括SP物質(zhì),也稱速激肽 1[16-17],廣泛分布于扣帶回皮質(zhì)、海馬、杏仁核和下丘腦的各個(gè)區(qū)域,這可能與應(yīng)激和情感反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[18],研究者們將逐漸揭示韁核參與精神障礙相關(guān)疾病的分子及環(huán)路機(jī)制,并不斷開(kāi)發(fā)以韁核為靶點(diǎn)的治療措施。

      腦內(nèi)神經(jīng)環(huán)路是實(shí)現(xiàn)情感與記憶的生物學(xué)基礎(chǔ),大腦高級(jí)功能的實(shí)現(xiàn)依賴于多種神經(jīng)元之間的相互投射,而這些投射所構(gòu)成的神經(jīng)環(huán)路會(huì)對(duì)接收到的復(fù)雜信息進(jìn)一步傳遞與處理。想要揭示情感包括記憶在內(nèi)的腦功能原理以及腦疾病發(fā)病機(jī)制,首先需要掌握相應(yīng)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)與功能信息[19]。能夠深入了解特定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與發(fā)展、行為和學(xué)習(xí)的關(guān)系一直是神經(jīng)科學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo),隨著影像學(xué)、分子生物學(xué)和光遺傳學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,利用新型技術(shù)去了解大腦中MHb-IPN特定環(huán)路投射發(fā)揮的功能和機(jī)制作用,以及單個(gè)分子在這個(gè)環(huán)路中的影響,逐漸成為了熱門的研究領(lǐng)域,但是這些問(wèn)題在一定程度上的解決也依賴于神經(jīng)環(huán)路水平上的示蹤和功能研究,同時(shí)以上的神經(jīng)生物學(xué)研究的成功實(shí)施需要具有高度針對(duì)性、高效和精確的方法。

      在具體實(shí)驗(yàn)操作中需要注意以下技術(shù)細(xì)節(jié),例如①在對(duì)腦組織進(jìn)行修正和切割時(shí),使用吸水濾紙能夠吸附組織表面的液體,一方面在多維度進(jìn)行切割操作時(shí)不易造成切割失誤,同時(shí)能提高切割角度的準(zhǔn)確性;②小鼠腦組織在脫水過(guò)程時(shí),要盡量保證脫水完全,以減少后期在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶,一方面加快了冷凍速度,另一方面組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)就保存的越好,貼在載玻片上的腦組織切片的表面氣泡數(shù)量少并且質(zhì)量高,同時(shí)在鏡下所呈現(xiàn)出的圖像質(zhì)量也越高;③首次調(diào)整刀片與包埋組織夾角角度后,后續(xù)不可再次調(diào)整角度,以保證整個(gè)組織平面盡量以相同的角度與刀片接觸,避免偏差;④冰凍溫度和時(shí)間是切片的關(guān)鍵環(huán)節(jié),溫度不宜過(guò)冷或過(guò)高,小鼠腦組織質(zhì)地比較嫩,溫度不宜過(guò)低,-7 ℃~-10 ℃即可,冰凍時(shí)間取決于OCT包埋劑變?yōu)椴煌该鳡畹臅r(shí)間,不宜預(yù)先冷凍或過(guò)久冷凍,防止發(fā)生洗片過(guò)程出現(xiàn)脫片現(xiàn)象;⑤在保證MHb兩側(cè)病毒注射劑量一致的情況下,兩側(cè)熒光強(qiáng)度不同,可能是由于病毒注射后,玻璃電極需要在腦內(nèi)停留10 min,在留針時(shí)間內(nèi)和抽針過(guò)程中,病毒液體可能有部分滲漏導(dǎo)致,但實(shí)際注射深度確在MHb區(qū)范圍以內(nèi),理論上不影響目標(biāo)區(qū)域的示蹤及觀察。

      大腦神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析是研究大腦功能的基礎(chǔ),而傳統(tǒng)解析MHb-IPN投射的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的方法,是將冷凍后的腦組織按照常規(guī)冠狀或矢狀切法,將組織切成20~30 μm厚度的腦組織薄片,附著在載玻片上,隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察和多層拍照,但是這種傳統(tǒng)方法花費(fèi)人力、物力以及時(shí)間更多,并且會(huì)將神經(jīng)纖維切斷,很難完整地展示每一張切片上連續(xù)的纖維,從而導(dǎo)致部分有效信息丟失,觀察到的結(jié)果與真實(shí)結(jié)果之間,往往存在部分偏差,不利于精準(zhǔn)解析全腦的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。

      綜上,本文驗(yàn)證了MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路投射關(guān)系并介紹了一種能夠精準(zhǔn)把握腦組織切片角度并完整展示MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路投射的組織切片技術(shù)方法。通過(guò)對(duì)小鼠整體腦組織三個(gè)面不同角度和厚度的切割,可以實(shí)現(xiàn)將MHb、IPN和Fr三部分完整地呈現(xiàn)并且展示出整體的連接結(jié)構(gòu),能夠在同一水平面下較為清晰地觀察到以上兩個(gè)腦內(nèi)深部核團(tuán)中的神經(jīng)元活性以及細(xì)胞分泌水平的變化,并且可進(jìn)行直觀地分析和差異比較,在全腦尺度上獲得精確的MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)信息,為研究?jī)蓚€(gè)重要核團(tuán)連接之間發(fā)揮的功能和探索兩者存在的神經(jīng)環(huán)路調(diào)控機(jī)制提供了直觀、精準(zhǔn)的觀察和分析手段。本技術(shù)將為內(nèi)側(cè)韁核區(qū)域相關(guān)投射的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)與功能研究提供有效環(huán)路投射成像技術(shù)支撐。

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