中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

許文博，王美寧，田 沛

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020）

近年來(lái)，禾草內(nèi)生真菌共生體的研究受到人們的廣泛關(guān)注。禾草內(nèi)生真菌是指在植物體內(nèi)渡過(guò)部分或者全部生命周期的一大類(lèi)真菌，內(nèi)生真菌與禾草共生不會(huì)使禾草產(chǎn)生外部癥狀[1-2]，目前對(duì)內(nèi)生真菌的研究主要集中于Epichlo?屬內(nèi)生真菌[3]。內(nèi)生真菌與禾草互惠互利，一方面內(nèi)生真菌生存于宿主植物的細(xì)胞間隙，獲取宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持生長(zhǎng)；而另一方面，內(nèi)生真菌可以合成生物堿等來(lái)提高宿主植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性，增強(qiáng)宿主的適應(yīng)性[3-4]。已證實(shí)內(nèi)生真菌可以提高宿主的生長(zhǎng)以及抗逆性，研究發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草(Lolium perenne)內(nèi)生真菌(Epichlo? festucaevar. lolii)對(duì)小麥(Triticum aestivum)根腐離蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、新月彎孢菌(Curvularia lunata)、細(xì)交鏈孢菌(Alternaria alternata)、德氏霉(Drechslerasp.)等病原菌有明顯的抑制作用[5]。被內(nèi)生真菌感染的禾草(endophyte-infected, E+)具有較強(qiáng)的抗旱、耐寒和耐鹽堿性[6-7]，尤其在羊茅屬的植物中，內(nèi)生真菌能顯著提高禾草地上與地下部分的生長(zhǎng)，增加宿主植物的生物量[8]。與未被內(nèi)生真菌感染的植物相比，禾草-內(nèi)生真菌共生體對(duì)外界環(huán)境中重金屬的耐性更強(qiáng)，被內(nèi)生真菌侵染可以提高紫羊茅(Festuca rubra)、細(xì)羊茅(F. rubrassp.commutata)對(duì)鋁(Al)、鋅(Zn)、銅(Cu)的耐受性，增加其生物量，降低鎘（Cd）對(duì)宿主植物的毒害作用[9]。

中華羊茅(F. sinensis)是分布在我國(guó)西北地區(qū)的多年生羊茅屬植物，絕大多數(shù)中華羊茅均被內(nèi)生真菌感染，部分帶菌率高達(dá)100%。帶菌的中華羊茅具有抗旱、抗寒、再生性好等優(yōu)良特性，是天然草地上垂穗披堿草(Elymus nutans)和垂穗鵝觀草(Roegneria nutans)的優(yōu)良伴生種[10-11]。垂穗披堿草是分布于青藏高原地區(qū)的多年生披堿草屬植物，部分植株也被內(nèi)生真菌感染，其植株帶菌率低至10%，平均帶菌率為35%[12]。中華羊茅與垂穗披堿草在天然草地上廣泛分布，混播時(shí)中華羊茅可提高垂穗披堿草的產(chǎn)量與抗性，增強(qiáng)草地群落穩(wěn)定性，提高生產(chǎn)力[13-14]。然而，中華羊茅內(nèi)生真菌在宿主伴生中的作用尚不得而知。

基于此，本研究從不同地理種群的中華羊茅種子中分離得到3 株內(nèi)生真菌，探究其不同濃度的發(fā)酵液對(duì)不帶菌(E?)的垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響，以期為中華羊茅內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)和利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

純化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基，參照Li 等[15]的制作方法。本試驗(yàn)采用馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth, PDB)發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

團(tuán)隊(duì)成員前期從來(lái)自甘肅(35°12′ E，102°31′N(xiāo))、四川(32°48′ E，102°33′ N)、青海(36°20′ E，102°06′ N)的中華羊茅種子中分離出3 株中華羊茅內(nèi)生真菌(Epichlo? sinensis)，分別為菌株1、菌株111 和菌株41D，內(nèi)生真菌經(jīng)分離純化后轉(zhuǎn)接至90 mm 的PDA 培養(yǎng)基上，然后放置于25 ℃真菌培養(yǎng)箱中，保存于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)研究所。

1.1.3 供試種子

團(tuán)隊(duì)成員于2016 年8 月在青海省門(mén)源縣(101°24′ E，37°25′ N)采集垂穗披堿草種子，帶回實(shí)驗(yàn)室清選后并鏡檢確認(rèn)不帶內(nèi)生真菌后，放置于4 ℃冰箱中，保存于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌的活化

將保存的3 株中華羊茅內(nèi)生真菌從培養(yǎng)箱中取出，挑取邊緣部分菌絲接種在PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃、黑暗條件下生長(zhǎng)1 個(gè)月備用。

1.2.2 中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備

將已活化的內(nèi)生真菌菌株用6 mm 打孔器打孔，放入250 mL 錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中含有150 mL PDB 培養(yǎng)基，每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)均放入3 枚菌餅，用封口膜封口后放入搖床，于25 ℃、150 r·min?1條件下培養(yǎng)。21 d 后將菌液過(guò)濾，此部分為100%濃度，并將部分內(nèi)生真菌發(fā)酵液用超純水稀釋為20%和60%兩個(gè)濃度。

1.2.3 不同濃度發(fā)酵液對(duì)種子發(fā)芽的影響

參照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程》中發(fā)芽試驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定采用紙上發(fā)芽法[16]，將冰箱中保存的垂穗披堿草種子在5%的次氯酸鈉溶液消毒8 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3 次，然后用75%的酒精消毒5 min，接著用無(wú)菌水沖洗3 次，再用無(wú)菌濾紙輕輕將種子表面的水分吸干，最后將種子均勻地?cái)[放于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，每皿含有50 粒種子，加入3.5 mL 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液，對(duì)照為不同濃度的PDB 液體培養(yǎng)基。本試驗(yàn)總共設(shè)置3 個(gè)菌株(1、111、41D)及1 個(gè)無(wú)菌株對(duì)照(CK)，每個(gè)菌株及對(duì)照均設(shè)置3 個(gè)濃度(20%、60%和100%)，共計(jì)12 個(gè)處理，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。將種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照種子胚根長(zhǎng)度超過(guò)2 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，并添加適量相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液以保持濾紙的濕潤(rùn)狀態(tài)，發(fā)芽期為12 d。第5 天測(cè)定種子發(fā)芽勢(shì)，21 d 后每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10 株幼苗，測(cè)定并記錄其胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、鮮重及干重，計(jì)算發(fā)芽率(germination rate, GR)、發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)、活力指數(shù)(vigor index,VI)、胚根胚芽比(root/shoot, R/S)、幼苗含水量、萌發(fā)抗旱指數(shù)(germination drought resistance index,UDRI)、活力抗旱指數(shù)(vigor drought resistance index,VDRI)。

指標(biāo)計(jì)算方法[17-24]：

發(fā)芽率 = (發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)) × 100%；

發(fā)芽勢(shì) = (發(fā)芽數(shù)達(dá)高峰的前1/3 天數(shù)內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)) × 100%；∑

發(fā)芽指數(shù)= (Gt/Dt)；

式中：Gt為在時(shí)間t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

活力指數(shù)=GI×Sx；

式中：GI為發(fā)芽指數(shù)；Sx為平均單株鮮重。

幼苗含水量 = 幼苗單株鮮重 ? 幼苗單株干重；

胚根胚芽比 = 胚根長(zhǎng)度/胚芽長(zhǎng)度；

萌發(fā)抗旱指數(shù) = 處理組萌發(fā)指數(shù)/對(duì)照組萌發(fā)指數(shù)；

活力抗旱指數(shù) = 處理組活力指數(shù)/對(duì)照組活力指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 錄入并繪圖，SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析。采用雙因素方差(two-way ANOVA)分析比較分析不同處理間的差異，根據(jù)方差分析的結(jié)果，對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、胚根胚芽比和幼苗含水量進(jìn)行雙因素方差分析，通過(guò)LSD 法(least significant difference test)檢驗(yàn)其差異顯著性，用Duncan 法進(jìn)行多重差異比較；而對(duì)種子萌發(fā)抗旱指數(shù)和活力抗旱指數(shù)采用單因素(發(fā)酵液或內(nèi)生真菌)進(jìn)行分析，結(jié)果用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

雙因素方差分析結(jié)果(表1)表明，內(nèi)生真菌菌株及發(fā)酵液濃度顯著影響了所有檢測(cè)的指標(biāo)(P＜0.05)；而二者相互作用顯著影響了發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、胚根胚芽比和幼苗含水量(P＜ 0.05)。

表1 發(fā)酵液濃度和菌株對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)指標(biāo)的雙因素方差分析結(jié)果Table 1 Two-way ANOVA on seed germination indicators of Elymus nutans affected by endophyte strain and fermentation broth concentration

2.1 不同內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)特性的影響

在不同發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草種子的發(fā)芽率有顯著差異(P＜ 0.05) (圖1)。發(fā)酵液濃度為20%時(shí)，菌株111 發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽率顯著低于菌株1 (P＜ 0.05) ，降低了19%；濃度為60%時(shí)，菌株111 發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽率最高且顯著高于對(duì)照(P＜ 0.05)，提高了14%；濃度為100%時(shí)，3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽率無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但均顯著高于對(duì)照組發(fā)芽率(P＜ 0.05)，菌株1、111和41D 分別比對(duì)照提高了28%、30%和32%。對(duì)照處理下垂穗披堿草種子發(fā)芽率隨著PDB 發(fā)酵液濃度升高而顯著下降(P＜ 0.05)；菌株1 和菌株41D 發(fā)酵液濃度為100%處理時(shí)種子發(fā)芽率顯著低于其他兩個(gè)處理(P＜ 0.05)，菌株111 發(fā)酵液濃度為60%處理時(shí)種子發(fā)芽率顯著高于其他兩個(gè)濃度處理(P＜ 0.05)。

圖1 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of different fermentation broths of Epichlo? sinensis strains on germination rate of Elymus nutans seeds

垂穗披堿草種子發(fā)芽勢(shì)也受到內(nèi)生真菌發(fā)酵液及濃度的顯著影響(P＜ 0.05) (圖2)。發(fā)酵液濃度為20%時(shí)，3 株菌株發(fā)酵液以及對(duì)照處理發(fā)酵液間種子發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)；濃度為60%和100%時(shí)，3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下垂穗披堿草種子發(fā)芽勢(shì)均顯著高于對(duì)照(P＜ 0.05)，且3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理之間種子發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。對(duì)照處理下垂穗披堿草種子發(fā)芽率隨著PDB 發(fā)酵液濃度升高而顯著下降(P＜ 0.05)；菌株111 發(fā)酵液濃度為60%時(shí)種子發(fā)芽勢(shì)顯著高于其他兩個(gè)濃度處理(P＜ 0.05)，分別比20%濃度和100%濃度增加了41%和52%；菌株41D 發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽勢(shì)在20%和60%濃度處理時(shí)均顯著高于100%濃度處理(P＜ 0.05)；菌株1 發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽勢(shì)在60%濃度處理時(shí)最高，顯著高于100%濃度處理(P＜0.05)，而與20%濃度處理無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。

圖2 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子發(fā)芽勢(shì)的影響Figure 2 Effects of different fermentation broths of Epichlo? sinensis strains on germination force of Elymus nutans seeds

垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)也受到內(nèi)生真菌發(fā)酵液及濃度的顯著影響(P＜ 0.05) (圖3)。發(fā)酵液濃度為20%時(shí)，3 株菌株發(fā)酵液以及對(duì)照處理發(fā)酵液間種子發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)；濃度為60%和100%時(shí)，3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對(duì)照PDB 發(fā)酵液處理(P＜ 0.05)，且3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理之間種子發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)。對(duì)照處理下種子發(fā)芽指數(shù)隨著PDB 發(fā)酵液濃度的升高而顯著下降(P＜0.05)。菌株1 和41D 內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下種子發(fā)芽指數(shù)在20%和60%濃度處理時(shí)顯著高于100%濃度處理(P＜ 0.05)，而菌株111 發(fā)酵液濃度為60%時(shí)種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他兩個(gè)濃度處理(P＜0.05)，分別比20%和100%濃度提高了17%和27%。

圖3 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)的影響Figure 3 Effects of different fermentation broths of Epichlo? sinensis strains on germination index of Elymus nutans seeds

在不同發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草種子活力指數(shù)也有顯著差異(P＜ 0.05) (圖4)。發(fā)酵液濃度為20%時(shí)，菌株41D 處理的種子活力指數(shù)顯著高于其他兩個(gè)菌株和對(duì)照(P＜ 0.05)，分別比菌株1 和111以及對(duì)照提高了41%、49%和11%，且菌株1 和111發(fā)酵液處理下的種子活力指數(shù)顯著低于對(duì)照和菌株41D 處理(P＜ 0.05)。發(fā)酵液濃度為60%時(shí)，菌株41D 處理下種子活力指數(shù)顯著高于同濃度其他處理(P＜ 0.05)，分別比菌株1 和111 以及對(duì)照提高了41%、49%和43%。發(fā)酵液濃度為100%時(shí)，3 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下種子活力指數(shù)均顯著高于對(duì)照處理(P＜ 0.05)，菌株1、111 和41D 分別比對(duì)照提高了59%、49%和62%。對(duì)照處理下垂穗披堿草種子活力指數(shù)隨PDB 發(fā)酵液濃度升高而顯著下降(P＜0.05)，菌株1 和111 內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下種子活力指數(shù)在不同濃度間差異不顯著(P＞ 0.05)，菌株41D 的發(fā)酵液濃度為20%、60%處理下種子活力指數(shù)顯著高于100%處理(P＜ 0.05)，均提高了36%。

圖4 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子活力指數(shù)的影響Figure 4 Effects of different fermentation broths of Epichlo? sinensis strains on vigor index of Elymus nutans seeds

2.2 不同內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子幼苗根和芽生長(zhǎng)的影響

不同發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草幼苗的胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)以及胚根胚芽比有顯著差異(P＜ 0.05)(表2)。濃度為20%時(shí)，菌株111 發(fā)酵液處理下幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)以及胚根胚芽比均最低，胚根長(zhǎng)顯著小于其他3 個(gè)處理(P＜ 0.05)，而胚芽長(zhǎng)顯著小于菌株1 處理(P＜ 0.05)，胚根胚芽比顯著小于對(duì)照和菌株1 處理(P＜ 0.05)。濃度為60%時(shí)，菌株41D 發(fā)酵液處理下幼苗胚根長(zhǎng)均顯著高于其他3 個(gè)處理(P＜ 0.05)，胚芽長(zhǎng)與菌株1 和菌株111 處理無(wú)顯著差異(P＞ 0.05)，胚根胚芽比與菌株111 處理無(wú)顯著差異但顯著高于菌株1 處理和對(duì)照(P＜ 0.05)；對(duì)照處理下幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)以及胚根胚芽比均最低，胚根長(zhǎng)顯著小于其他3 個(gè)處理(P＜ 0.05)，胚芽長(zhǎng)顯著小于菌株41D 處理(P＜ 0.05)，而胚根胚芽比顯著低于菌株111 和41D 處理(P＜ 0.05)。濃度為100%時(shí)，菌株41D 處理下幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和胚根胚芽比均顯著大于對(duì)照和其他兩個(gè)菌株發(fā)酵液處理(P＜ 0.05)，且菌株111 處理下幼苗胚根長(zhǎng)顯著高于菌株1 和對(duì)照處理(P＜ 0.05)，菌株111 處理下胚根胚芽比顯著高于菌株1 和(P＜ 0.05)。對(duì)照處理和菌株1 發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草幼苗胚根長(zhǎng)以及胚根胚芽比隨PDB 發(fā)酵液濃度升高而顯著下降(P＜ 0.05)，而菌株1 幼苗胚芽長(zhǎng)在濃度20%處理下顯著高于其他兩個(gè)菌株處理(P＜ 0.05)；菌株1 發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草幼苗胚根長(zhǎng)在濃度100%處理下顯著低于其他兩個(gè)菌株處理(P＜ 0.05)；菌株111 和41D 發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草胚根胚芽比在濃度100%處理下顯著低于60%處理(P＜ 0.05)。

表2 3 株中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)和胚根胚芽比的影響Table 2 Effects of three Epichlo? sinensis endophyte fermentation broths on Elymus nutans plumule length, radicle length, and root to shoot ratio

不同處理對(duì)垂穗披堿草幼苗含水量也有顯著影響(P＜ 0.05) (圖5)。濃度為20%時(shí)，菌株1 發(fā)酵液處理的垂穗披堿草幼苗含水量顯著高于對(duì)照和其他兩個(gè)菌株處理(P＜ 0.05)，分別比菌株111 和41D以及對(duì)照提高了15%、18%和17%。濃度為60%時(shí)，內(nèi)生真菌菌株1 和菌株111 發(fā)酵液處理下幼苗含水量顯著高于對(duì)照處理(P＜ 0.05)，且菌株111 發(fā)酵液處理下幼苗含水量顯著高于菌株41D 處理(P＜0.05)。濃度為100%時(shí)，內(nèi)生真菌菌株41D 發(fā)酵液處理下幼苗含水量顯著高于對(duì)照處理和菌株111 處理(P＜ 0.05)，且菌株111 發(fā)酵液處理下幼苗含水量顯著高于對(duì)照處理(P＜ 0.05)。對(duì)照處理和菌株111發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草幼苗含水量隨PDB 發(fā)酵液濃度升高而顯著下降(P＜ 0.05)；菌株1 和41D 發(fā)酵液濃度為20%處理時(shí)幼苗含水量顯著高于其他兩個(gè)濃度處理(P＜ 0.05)。

圖5 不同濃度中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草幼苗含水量的影響Figure 5 Effects of different fermentation broths of Epichlo? sinensis strains on water content of Elymus nutans seedlings

2.3 不同地理種群中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)抗旱性的影響

不同發(fā)酵液處理下垂穗披堿草種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)與活力抗旱指數(shù)不同(表3)。同一濃度不同菌株處理下，20%濃度下菌株41D 處理時(shí)種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)和活力抗旱指數(shù)均顯著大于菌株111 (P＜0.05)；60%濃度的菌株111 處理時(shí)，垂穗披堿草種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)顯著大于菌株1 和41D (P＜0.05)，而菌株41D 處理時(shí)種子的活力抗旱指數(shù)均顯著大于菌株1 和111 (P＜ 0.05)；100%濃度時(shí)，菌株41D 和111 處理下種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)顯著高于菌株1 (P＜ 0.05)，而菌株41D 處理下種子的活力抗旱指數(shù)均顯著大于菌株1 和111 (P＜ 0.05)。同一菌株發(fā)酵液處理下，垂穗披堿草種子萌發(fā)抗旱指數(shù)在60%和100%濃度處理下顯著大于20%濃度處理(P＜0.05)，而活力抗旱指數(shù)均隨發(fā)酵液濃度的增加而顯著增加(P＜ 0.05)，同一菌株濃度為100%處理時(shí)，垂穗披堿草種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)與活力抗旱指數(shù)達(dá)到最大。

表3 3 株中華羊茅內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)抗旱指數(shù)和活力抗旱指數(shù)的影響Table 3 Effects of fermentation broths of three Festuca sinensis endophyte strains on Elymus nutans germination drought resistance index and vigor drought resistance index

3 討論

對(duì)高羊茅(Festuca arundinacea)與多年生黑麥草-內(nèi)生真菌共生體研究中，已開(kāi)展了有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)宿主以外其他植物生長(zhǎng)影響的研究，比如Renne 等[25]發(fā)現(xiàn)高羊茅提取物對(duì)南美草原植物種子萌發(fā)的抑制作用與是否感染內(nèi)生真菌并無(wú)顯著關(guān)系，但Vázquez-de-Aldana 等[26]的研究表明感染內(nèi)生真菌(E+)的高羊茅對(duì)車(chē)前草(Plantago lanceolata)、百脈根(Lotus corniculatus)等幼苗的抑制作用顯著高于未感染內(nèi)生真菌(E?)的高羊茅。Sutherland 等[27]研究發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生真菌的多年生黑麥草對(duì)三葉草(Trifolium repens)生長(zhǎng)的影響顯著高于E?多年生黑麥草。而中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)中華羊茅和醉馬草(Achnatherum inebrians)種子萌發(fā)有不同程度的促進(jìn)或者抑制作用，同時(shí)發(fā)酵液濃度對(duì)其也有影響，表現(xiàn)為稀釋液促進(jìn)作用較強(qiáng)，而原液則表現(xiàn)為抑制作用[28]。而Epichlo? bromicola內(nèi)生真菌發(fā)酵液促進(jìn)了擬南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗鮮重、干重、葉片數(shù)和不定根數(shù)等生物量的增加[29]。閆繼辰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，真菌發(fā)酵液可以顯著促進(jìn)大豆(Glycine max)種子的萌發(fā)與活力指數(shù)。本研究以不同地理種群中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液為材料處理E?垂穗披堿草種子，結(jié)果表明，高濃度(100%)內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理下垂穗披堿草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對(duì)照PDB 發(fā)酵液處理，說(shuō)明內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)非宿主植物種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。在田間條件下，可能通過(guò)化感作用影響垂穗披堿草的生長(zhǎng)。高濃度內(nèi)生真菌(菌株111 和41D)發(fā)酵液處理下垂穗披堿草種子的培根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)均顯著高于對(duì)照PDB 發(fā)酵液處理，而菌株1 發(fā)酵液處理與對(duì)照處理間無(wú)顯著差異，說(shuō)明不同菌株的內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)非宿主植物種子萌發(fā)的促進(jìn)作用并不一致。

真菌發(fā)酵液的抑制或促進(jìn)作用與其濃度有明顯關(guān)聯(lián)。孫鋒[31]利用不同濃度哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株發(fā)酵液處理抗蟲(chóng)棉(Gossypium herbaceum)種子，發(fā)現(xiàn)稀釋10、50、100 倍的木霉發(fā)酵液處理的種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)狀況均顯著優(yōu)于對(duì)照，其中以稀釋50 倍處理抗蟲(chóng)棉種子生長(zhǎng)最為良好。本研究用分離自不同地理種群中華羊茅的內(nèi)生真菌發(fā)酵液及對(duì)照PDB 處理垂穗披堿草種子，除菌株1 發(fā)酵液在100%濃度處理下的胚根長(zhǎng)小于對(duì)照處理外，3 株中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃度為60%和100%時(shí)垂穗披堿草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、幼苗含水量、胚根胚芽生長(zhǎng)均大于對(duì)照，說(shuō)明中華羊茅內(nèi)生真菌對(duì)垂穗披堿草種子有促進(jìn)作用。但是隨著發(fā)酵液濃度增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)；除菌株41D 在100%濃度處理下的胚芽長(zhǎng)外，胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這與以前真菌發(fā)酵液促進(jìn)種子萌發(fā)且與其濃度有關(guān)的研究結(jié)果一致[28,31]。

真菌發(fā)酵液對(duì)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響與其產(chǎn)生的化合物有關(guān)。內(nèi)生真菌不僅在體外產(chǎn)生次生代謝物，在宿主體內(nèi)也產(chǎn)生代謝物，也能誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一些次生代謝物。內(nèi)生真菌對(duì)宿主的有益作用和對(duì)家畜健康的影響均與共生體產(chǎn)生的次生代謝物有關(guān)[32-34]。趙昕梅等[35]從野生鐵皮石斛(Dendrobium officinale)中分離的4 株內(nèi)生真菌菌株中，鐮刀菌屬(Fusarium)菌株發(fā)酵液對(duì)宿主生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其中菌株TPSH4 發(fā)酵液的促進(jìn)作用最為顯著。王偉等[36]研究發(fā)現(xiàn)，核桃(Juglans regia)內(nèi)生真菌菌株可以產(chǎn)生對(duì)小麥(Triticum aestivum)的幼芽和幼根有不同程度抑制作用的代謝產(chǎn)物。陳頤輝等[37]研究發(fā)現(xiàn)從水稻(Oryza perennis)具有化感作用的品系中分離得到的11 株內(nèi)生真菌中多數(shù)其發(fā)酵液對(duì)常規(guī)非化感水稻品系種子的萌發(fā)均有一定的促進(jìn)作用，對(duì)稗草(Echinochloa crusgalli)種子萌發(fā)均有一定程度抑制作用，其中從水稻化感品系中分離得到的燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)和塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的發(fā)酵產(chǎn)物能促進(jìn)非化感水稻幼苗生長(zhǎng)，并能大幅度提升水稻超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性，這兩種內(nèi)生真菌處理稗草其脂肪酶與抗氧化酶活性均顯著低于對(duì)照，說(shuō)明這兩種內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中具有能夠影響水稻與稗草生長(zhǎng)的物質(zhì)。本研究中中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)垂穗披堿草種子的促進(jìn)作用可能也與內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝物有關(guān)。目前已從Epichlo?發(fā)酵液中分離鑒定出多種化合物，比如倍半萜烯(sesquiterpenes)，chokol A、B 和 C[38]，3 種酚醛甘油酯[39]，4 種C-18 羥基不飽和脂肪酸[40]，一種環(huán)狀芳香甾醇化合物[41]以及一些吲哚衍生物和二乙?；穂42]。但是是否是這些化合物對(duì)宿主或宿主以外植物種子萌發(fā)產(chǎn)生影響尚未開(kāi)展研究。文先[29]在Epichlo? bromicola發(fā)酵液中鑒定出生長(zhǎng)素如吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)、吲哚乙醇(indole-3-ethanol)和吲哚甲醛(indole-3-carboxaldehyde)等物質(zhì)，這些化合物可能是影響擬南芥生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。而中華羊茅內(nèi)生真菌是否在發(fā)酵條件下產(chǎn)生生物堿還需進(jìn)一步檢查。因此，今后繼續(xù)對(duì)發(fā)酵液的次生代謝物成分進(jìn)行分析，以期尋找出對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用的化合物。

本研究從不同地理種群中華羊茅種子中分離出3 株內(nèi)生真菌菌株，用其發(fā)酵液處理E?垂穗披堿草種子，結(jié)果表明不同菌株處理下種子生長(zhǎng)狀況不同，分離自青海省平安縣的中華羊茅內(nèi)生真菌(即菌株41D)處理下在濃度為20%和60%時(shí)垂穗披堿草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)顯著高于菌株41D 發(fā)酵液在濃度為100%時(shí)，濃度為100%時(shí)種子抗旱指數(shù)、幼苗含水量均大于同濃度下其他菌株處理，且幼苗胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、胚根胚芽比顯著大于其他濃度處理，因此，高濃度下的菌株41D 發(fā)酵液處理對(duì)種子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用強(qiáng)于對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照、菌株1、菌株111。而來(lái)自不同地理區(qū)域的這3 株內(nèi)生真菌對(duì)種子萌發(fā)作用的差異，這與前期開(kāi)展的關(guān)于其他生理生化特性以及生長(zhǎng)速度的研究結(jié)果一致，均明確了這3 株菌株存在差異。從中華羊茅分離出的內(nèi)生真菌是一個(gè)新種，命名為Epichlo? sinensis[43]，雖然這3 個(gè)菌株為同一個(gè)種，但不同菌株存在差異，可能是不同的基因型。

本研究結(jié)果表明從中華羊茅分離出的內(nèi)生真菌對(duì)與其伴生的垂穗披堿草的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但是促進(jìn)的機(jī)制和內(nèi)生真菌在化感中所起的作用尚未可知。明確發(fā)酵液中的化合物成分及功能將有助于解釋內(nèi)生真菌在中華羊茅與垂穗披堿草混生中的化感作用。