原發(fā)性肝癌主要發(fā)病原因為乙型肝炎病毒慢性感 染，其發(fā)病初期多無明顯癥狀，但病情發(fā)展迅速，預(yù)后較差，生存期較短。其在中醫(yī)學(xué)中并無準(zhǔn)確對應(yīng)的病名，但是歷代醫(yī)家結(jié)合臨床癥狀及體征將其歸于“肝積”、“癥積”、“脅痛”、“黃疸”、“積聚”等中醫(yī)范疇，且認(rèn)為其發(fā)病根本原因為正氣不足。原發(fā)性肝癌被發(fā)現(xiàn)時多已為中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會，以中醫(yī)治療可緩解患者現(xiàn)有癥狀，延長生存期。本研究團(tuán)隊張國梁教授總結(jié)出益氣解毒方用于治療原發(fā)性肝癌：益氣解毒方中包括生黃芪30 g、炒白術(shù)20 g、白花蛇舌草12 g、半枝蓮12 g、川芎10 g、半邊蓮15 g、枸杞子15 g。黃芪、白術(shù)益氣固表止汗利水，研究表明其可有效提高機(jī)體免疫力，可抗腫瘤、抗病毒等。據(jù)目前報道，可從白術(shù)中分離的化學(xué)成分有80余種，這些成分主要起到抗炎、抗腫瘤等作用。白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮清熱解毒、散結(jié)止痛消腫，白花蛇舌草主要成分為白花蛇舌草多糖，其是抗炎、抗腫瘤、提高免疫力等活性的有效免疫調(diào)節(jié)劑，而白花蛇舌草與半枝蓮中的總多糖、半邊蓮的提取物對眾多癌病均有著治療作用。川芎行氣活血止痛，枸杞子補(bǔ)益肝腎、調(diào)和諸藥，川芎與枸杞子其對機(jī)體多個系統(tǒng)有著藥理活性，主要作用為抗腫瘤、細(xì)胞保護(hù)、抗炎等。

目前對于以上七味中藥的單個研究較多，但尚無對于將七味藥綜合而用的研究，而本研究團(tuán)隊的張國梁教授將七味藥合用，在臨床可達(dá)益氣化瘀、散結(jié)止痛利水之功?，F(xiàn)尚未有明確研究報道說明益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接，研究益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，并構(gòu)建體外實驗，進(jìn)一步驗證其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 信息收集

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）、Uniport數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）、人類基因數(shù)據(jù)庫（Genecards）篩選出益氣解毒方主要藥物成分及靶點、靶點對應(yīng)的基因名以及原發(fā)性肝癌疾病的相關(guān)靶點基因。根據(jù)口服利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18條件篩選有效成分。將益氣解毒方主要有效成分及基因，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，得出“藥物-成分-基因”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 核心基因提取

將疾病相關(guān)靶點、藥物對應(yīng)的共有基因?qū)隫enny 2.1在線工具，繪制韋恩圖，得到共同靶點基因。將其名稱輸入String數(shù)據(jù)庫（https:/ string-db.org/cgi/input.pl），研究物種為“Homo sapiens”，獲得蛋白與蛋白之間互作關(guān)系。導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，采用2倍中位數(shù)法提取核心基因，再通過計算核心基因網(wǎng)絡(luò)中各個屬性值，提取出最終核心基因。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

采用David 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為“HomoSapiens”，提交后在GO Molecular Functions、GO Biological Processes、GO Cellular Components、KEGG Pathway導(dǎo)出結(jié)果。對藥物-疾病基因進(jìn)行GO功能分析以研究益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌的主要生物過程；進(jìn)行KEGG通路富集分析以研究藥物治療疾病的相關(guān)信號通路。再使用“微生信”，將GO、KEGG分析結(jié)果輸入，得出氣泡圖、條形圖進(jìn)行分析。

從意境來看，就不得不提及一個時空的問題。中國繪畫藝術(shù)通過視覺的轉(zhuǎn)換變化，賦予空間以時間性的運動特征，還透過獨特的透視方法“三遠(yuǎn)法”達(dá)到畫面層次的豐富，從而使得其在內(nèi)部成為了時空結(jié)合體。使得繪畫空間在流動中變換，此時謂之有意境。

實時熒光定量PCR實驗：收集HepG2細(xì)胞沉淀，加入1 mL TRIzol裂解，裂解完全后加入0.2 mL氯仿經(jīng)劇烈震蕩、離心后取上清（約500 μL）加入到另一EP 管中。再加入0.5 mL預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃孵育30 min后離心，棄去上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇離心5 min，棄上清，重復(fù)后可得室溫干燥RNA沉淀，加入20～50 μL DEPC水，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取RNA 1 μg行RT反應(yīng)得出為cDNA，-80 ℃保存。取出cDNA 作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系10 μL，包括2×SYBR Green mixture 5 μL、Forward primer（10 μmol/L）1 μL、Reverse primer（10 μmol/L）1 μL、cDNA 1 μL、RNase Free water 2 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃PCR反應(yīng)20 s，60 ℃延伸1 min，共循環(huán)40次，最終得出擴(kuò)增曲線、溶解曲線以及相對表達(dá)量。本次實驗所采用Relative Quantification Study，計算方法為2。實驗所需指標(biāo)引物序列如表2。

1.4 分子對接

將最終核心基因、益氣解毒方有效成分分別導(dǎo)入RCSB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）、Pubcham數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下載對應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)。再將3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoduckTools予以加氫、去電荷等處理后計算二者結(jié)合力。

1.5 實驗驗證

將各個藥物對應(yīng)靶點輸入Uniport數(shù)據(jù)庫中，選擇“UniProtKB，Reviewed，Human”篩選出藥物靶點對應(yīng)基因名，通過去除無效靶點，最終得出七味中藥對應(yīng)基因各有450、22、249、574、42、439、356個。

1.5.2 驗證實驗 細(xì)胞活力檢測：分為LO-2（正常人肝細(xì)胞株）和HepG2（人肝癌細(xì)胞株）2組細(xì)胞。胰酶消化上述2組對數(shù)期細(xì)胞，將其處理后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）；5%CO，37 ℃孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。將HepG2分為4組，每組分別加空白血清、5%、10%、20%含藥血清，再將每組都分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10μL/孔CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的吸光值。同時設(shè)置空白孔。細(xì)胞活力=［（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）］×100%。

此時，曾先生也失去了理智，他把背包扔到地上，然后向前撲倒在地上號叫。曾先生表示，當(dāng)時沒有考慮這種方式是否妥當(dāng)，只是想控訴警方的作為，并向路人求助。

將“primary carcinoma of the liver”輸入Genecards數(shù)據(jù)庫中，得出原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點基因共1598個。將其與益氣解毒方中藥物對應(yīng)的共有基因?qū)隫enny 2.1 在線工具，繪制韋恩圖，得到共同蛋白基因共101個（圖2）。

GO分析結(jié)果顯示，涉及益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌的生物過程共605個，主要的生物過程是：BP-ephrin receptor signaling pathway，movement of cell or subcellular component；CC-blood microparticle，focal adhesion；MF-iron ion binding等；分別按照FDR降序排列，選擇前10位進(jìn)行條形圖展示分析（圖4）。KEGG分析結(jié)果顯示，涉及益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌的相關(guān)信號通路共89個，其中主要相關(guān)信號通路包括：Platelet activation、Tyrosine metabolism、AMPK信號通路、RIGI-l樣受體信號通路、Wnt信號通路、趨化因子信號通路、Ras 信號通路、ErbB 信號通路、Salmonella infection等。按照FDR降序排列，選擇前20位進(jìn)行氣泡圖展示分析（圖5）。

在20世紀(jì)70年代，美國學(xué)者T.L.Saaty提出了層次分析法，一經(jīng)推出就引起了世界系統(tǒng)工程人員的興趣。層次分析法把與決策始終相關(guān)的元素進(jìn)行分解，分為方案、準(zhǔn)則、目標(biāo)等層次，同時進(jìn)行定量定性分析。根據(jù)定量和程度等級方法的結(jié)果，可以從很大程度上出現(xiàn)定性分析的可能性。這種方法符合人們的主觀判斷思維，有利于從客觀的角度去整理和思索。由于層次分析的方法具有實用性、科學(xué)性和系統(tǒng)性，運用這種方法能夠在很多領(lǐng)域解決實際問題，例如在煤礦運營領(lǐng)域。

反思：凡是遇到關(guān)于鐵的題時,首先想到的就是鐵的價態(tài)。多種物質(zhì)之間同時進(jìn)行的反應(yīng),究竟是誰先反應(yīng),是考生往往容易犯的錯誤,也是命題者常設(shè)的陷阱。一般的規(guī)律是:一種氧化劑與多種還原劑反應(yīng),或一種還原劑與多種氧化劑反應(yīng),強(qiáng)的氧化劑和強(qiáng)的還原劑優(yōu)先反應(yīng),也稱“強(qiáng)強(qiáng)反應(yīng)”或“強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合”。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

將共同蛋白基因名稱輸入String 數(shù)據(jù)庫，選擇Multipleproteins，研究物種為Homo sapiens，獲得蛋白與蛋白之間互作關(guān)系。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，將數(shù)據(jù)進(jìn)行Analyze Nexbook計算出degree值，再采用2倍中位數(shù)法卡出degree值2倍中位數(shù)對應(yīng)的數(shù)據(jù)，再通過計算核心基因網(wǎng)絡(luò)中各個屬性值的中位數(shù)，卡出最終核心基因（圖3）。最終核心基因為：DDX5，HNRNPK，PABPC1，DHX9，RPS3A，RPS3，RPL13，NCL。

2 結(jié)果

2.1 益氣解毒方中主要藥物的有效成分及靶點

篩選出黃芪、白術(shù)、白花蛇舌草、半枝蓮、川芎、半邊蓮、枸杞子七味中藥各有19、4、5、23、6、16、37個有效成分。根據(jù)各個藥物的有效成分通過TCMSP中related targets 得出七味中藥各有靶點465、23、256、584、42、409、359個，共2138個。

1.5.1 主要材料 藥物-益氣解毒方（生黃芪30 g、炒白術(shù)20 g、白花蛇舌草12 g、半枝蓮12 g、川芎10 g、半邊蓮15 g、枸杞子15 g）（安徽省中醫(yī)院中藥房）；細(xì)胞株-LO-2（正常人肝細(xì)胞株）、HepG2（人肝癌細(xì)胞株）、空白血清、5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清（安徽中抗生物技術(shù)有限公司）；CCK8檢測試劑盒、HNRNPK（相對分子質(zhì)量51 000）、PABPC1（相對分子質(zhì)量70 000）（BIOSS），胰酶（碧云天），β-Actin（相對分子質(zhì)量42 000，Zsbio），Nucleolin（相對分子質(zhì)量76 000，abcam），DHX9（相對分子質(zhì)量141 000，abclonal），RIPA細(xì)胞裂解液（強(qiáng)）、Western一抗二抗去除液（Beyotime），SDS、PAGE 膠促凝劑（Solarbio），PVDF 膜（Millipore），ECL超敏發(fā)光試劑盒（Thermo），Trizol（Life technogies），氯仿（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇、異丙醇（上海廣諾化學(xué)科技有限公司），Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(熒光染料)（novoprotein），PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）（TaKaRa）；常溫微量離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司），熒光定量PCR儀、PIKO Plate Illuminator（Thermo Scientific）。

將藥物、靶點、基因整理導(dǎo)入Cytoscape軟件中，得出“藥物-靶點-基因網(wǎng)絡(luò)”圖（圖1）和共有靶點（表3）。

2.2 疾病靶點基因

Western blot實驗：LO-2、HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，HepG2細(xì)胞分4組，每組分別加入空白血清、5%、10%、20%含藥血清培育48 h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液600 μL進(jìn)行裂解、提取組織總蛋白；根據(jù)TRAKRA產(chǎn)品目錄進(jìn)行SDS-PAGE凝膠配置，濃縮膠（2 mL）10%分離膠（10 mL）。在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。將濾紙和PVDF膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中5 min，通過轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后，蛋白膜放置到Western洗滌液中漂洗5 min，加入Western封閉液（5%脫脂奶粉）封閉2 h。后按照合適的比例（表1）在4 ℃用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000稀釋）反應(yīng)1.2 h。參考相關(guān)說明書，使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。

2.3 核心基因篩選

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用獨立樣本檢驗，對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用秩和檢驗。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

我們可以感受到一種力量的美，它剛勁而又柔美。陶瓷工匠們需要在窯爐前等待很久。然后，在某個黎明時分，帶著預(yù)期中的悲喜交集，當(dāng)窯爐的門再次開啟，土坯們已然露出幽微的冷光，它們像一條條蛻皮的蛇，安靜地躺在窯里。輕煙翻滾，從窯洞里源源涌出，直上天穹。燒瓷人忍不住跪倒在地，頂禮膜拜……

2.4 GO、KEGG分析

如果燒燙傷達(dá)二度以上，就會在痊愈后留下疤痕。為了減輕疤痕給寶寶帶來的癢和不適感，也為了減輕疤痕的生長程度，在傷口痊愈后一周左右，可以開始做疤痕按摩。建議您按摩前應(yīng)先清洗皮膚且涂上潤膚露，然后用手掌肥厚部位或大拇指指腹輕壓在皮膚上，在原處作旋轉(zhuǎn)式的按摩或按壓，不可以用推揉的方式摩擦傷口，以免表皮無法承受而受損。

2.5 分子對接結(jié)果

通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫得出HNRNPK、PABPC1、DHX9、NCL 分別對應(yīng)的ID 為1ZZK、3KUJ、3VYX、2FC8，下載3D結(jié)構(gòu)；通過Pubcham數(shù)據(jù)庫得出益氣解毒方有效成分的3D結(jié)構(gòu)，兩者進(jìn)行分子對接（圖6）。結(jié)果顯示大多數(shù)均可以在自然條件下進(jìn)行對接，其中53對對接結(jié)果良好（表4）；PABPC1與Stigmasterol結(jié)合能最高，為-7.46 kcal/mol。

2.6 驗證實驗結(jié)果

細(xì)胞活力檢測實驗顯示，當(dāng)含藥血清濃度逐漸增大時，細(xì)胞活力逐漸受到抑制（＜0.01），含藥血清濃度大于10%后細(xì)胞活力抑制水平基本穩(wěn)定；其中細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h，細(xì)胞活力受抑制作用基本一致（圖7，＞0.05）。蛋白檢測的結(jié)果顯示，隨著含藥血清濃度逐漸增大，HepG2中蛋白的相對表達(dá)量逐漸降低（＜0.05）（圖8）。實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，加入含藥血清后HepG2中蛋白的mRNA相對表達(dá)量逐漸增高（＜0.05），但10%與20%的表達(dá)量基本相同（圖9），即10%含藥血清為最適宜量。

3 討論

本研究通過對益氣解毒方與原發(fā)性肝癌進(jìn)行核心靶點篩選、主要通路研究、結(jié)合能計算等了解到益氣解毒方與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)，對于治療原發(fā)性肝癌有著重要作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出藥物-疾病核心靶點共8 個，分別為DDX5、HNRNPK、PABPC1、DHX9、RPS3A、RPS3、RPL13、NCL。已有研究表明敲低DDX5可抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程；生物信息學(xué)分析顯示在肝癌中，PABPC1為真正樞紐基因，多因素分析顯示肝癌的獨立預(yù)后因素為PABPC1，PABPC1mRNA在肝癌組織中的表達(dá)亦處于最高位。在人癌細(xì)胞中DHX9發(fā)揮著抗病毒活性的作用，可靶向于提高溶瘤痘病毒對癌細(xì)胞的活性的限制。RPS3A的降解可能抑制核糖體翻譯功能的啟動，從而使某些參與細(xì)胞生命活動的重要蛋白質(zhì)無法合成，影響腫瘤細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。RPS3在細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)等核糖體外功能和翻譯中發(fā)揮著多種作用；多種細(xì)胞功能表明HNRNPK參與腫瘤發(fā)生，具有抑制腫瘤形成的作用；肝癌中NCL的表達(dá)水平與腫瘤分化程度和患者生存期息息相關(guān)。RPL13能通過促進(jìn)核因子κB和IFN-β基因啟動子的誘導(dǎo)和激活，增強(qiáng)抗病毒因子IFN-β和促炎細(xì)胞因子白介素-6的表達(dá)和蛋白分泌。而本研究分子對接結(jié)果則顯示藥物有效成分能夠與核心基因中DHX9、HNRNPK、NCL、PABPC1存在良好的結(jié)合能力，表明益氣解毒方可能是通過核心基因?qū)υl(fā)性肝癌產(chǎn)生治療作用。

對于益氣解毒方治療原發(fā)性肝癌主要生物過程及相關(guān)信號通路而言，有研究對于子宮內(nèi)膜樣腫瘤的全基因組基因表達(dá)進(jìn)行microRNA-mRNA靶向分析，結(jié)果顯示大量靶向基因參與ephrin receptor signaling pathway。微粒是主要由各種類型的細(xì)胞在血液中脫落的磷脂囊泡，這些微粒包含其親代細(xì)胞蛋白質(zhì)組的一個子集，它們在生物體液中存在現(xiàn)成可用性，因此其可能為細(xì)胞損傷的標(biāo)志物。自噬介導(dǎo)的粘著斑降解的阻斷或逆轉(zhuǎn)可使腫瘤轉(zhuǎn)移抑制增強(qiáng)。大多數(shù)中醫(yī)血瘀證患者存在血小板活化現(xiàn)象，而活血化瘀類中藥主要通過抑制血小板上CD62p的表達(dá)來抑制血小板活化。據(jù)報道，酪氨酸在肝臟中得以降解，主要是通過一系列酶促反應(yīng)完成的；酪氨酸分解代謝酶酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在原發(fā)性肝癌患者中表達(dá)異常。AMPK在肝臟中參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)主要通過磷酸化來完成，其活化能夠減輕肝損傷和炎癥。RIG-I樣受體通過識別病毒及多種信號通路和調(diào)控機(jī)制來控制病毒感染反應(yīng)。Wnt信號通路參與胚胎發(fā)育和致癌過程中的生理病理過程，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在Wnt信號傳導(dǎo)途徑的異常激活，可通過阻斷Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以達(dá)到治療肝癌的目的。趨化因子信號是腫瘤微環(huán)境中的一部分,其在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。RAS兩大功能軸對于機(jī)體平衡及疾病發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵性作用，具體表現(xiàn)在經(jīng)典軸通過介導(dǎo)多種信號傳導(dǎo)級聯(lián)參與多種疾病的病理過程，非經(jīng)典軸通過反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來逆轉(zhuǎn)經(jīng)典軸介導(dǎo)的損傷。若ErbB發(fā)生突變，則會導(dǎo)致多種癌發(fā)生，其包括四個酪氨酸激酶受體，當(dāng)受體與其對應(yīng)配體結(jié)合后，激活相關(guān)基因，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷徙和凋亡等過程。由此可看出益氣解毒方可通過多條通路影響原發(fā)性肝癌的表達(dá)，減輕肝臟損傷。本研究體外實驗進(jìn)一步認(rèn)證了益氣解毒方能夠影響原發(fā)性肝癌蛋白的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到治療肝癌的目的。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接對益氣解毒方進(jìn)行了深入解讀，說明了益氣解毒方與原發(fā)性肝癌之間密不可分，而體外實驗進(jìn)一步證明了益氣解毒方能夠?qū)υl(fā)性肝癌肝癌起到治療作用。本研究為原發(fā)性肝癌的治療提供新思路、新途徑，也為中醫(yī)能夠治療原發(fā)性肝癌提供科學(xué)依據(jù)。