張申平，周靜，杜茹蕓，徐紅斌，劉洋

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)），上 海200233)

0 引言

液體乳含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，種類繁多的液體乳產(chǎn)品備受消費者喜愛。但近年來液體乳中農(nóng)藥[1-3]、獸藥[4-6]、有機污染物[7]殘留已經(jīng)敲響了液體乳質(zhì)量安全警鐘。液體乳的農(nóng)藥殘留往往容易被忽視，這是因為飼料中的農(nóng)藥經(jīng)過奶牛消化吸收后，進入奶中的濃度較低，但這種微量、長期性的毒害勢必影響人體健康[8-9]。各國已然制定了液體乳中農(nóng)藥殘留的最大限量值，歐盟規(guī)定了奶中460余種農(nóng)藥的限量值，其中林丹的限量值低至0.001 mg/kg；美國規(guī)定了牛奶中190余種農(nóng)藥的最大限量值，樂果的限量值低至0.002 mg/kg；日本規(guī)定了奶中300余種農(nóng)藥的限量值，部分農(nóng)藥一律不得檢出。我國的GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[10]已將牛乳中農(nóng)藥殘留限量增加至125項。

液體乳中脂肪含量高、基質(zhì)復雜、農(nóng)藥含量低，因此需要更加高效的樣品前處理及儀器方法。目前主要的檢測方法有氣相色譜法[11-13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[14-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[17-19]，主要集中在單一類別農(nóng)藥的檢測。近年來高分辨質(zhì)譜在農(nóng)藥殘留分析方面的應用日益增多，高分辨質(zhì)譜相對于常規(guī)HPLC-MS/MS具有更高的分辨率，在痕量組分的分析中具有獨特優(yōu)勢，以一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素豐度比和二級特征離子為篩查條件，可以快速完成復雜樣品中痕量物質(zhì)的篩查和確證。黃合田[20]等人建立了Sin-QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速非靶向篩查綠茶中38種農(nóng)藥及其代謝物殘留的分析方法。孟志娟[21]等建立了氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜同時篩查農(nóng)產(chǎn)品中70種農(nóng)藥殘留的方法。吳潔珊[22]等人建立氣相色譜高分辨飛行時間質(zhì)譜法快速篩查水果中283種農(nóng)藥殘留量的分析方法。液體乳基質(zhì)復雜，常規(guī)樣品提取液凈化方法難以實現(xiàn)痕量物質(zhì)的分析，新型的Captiva EMR-Lipid小柱可通過體積排阻和疏水作用捕獲脂質(zhì)，使體積較大的物質(zhì)被阻止在外，達到凈化目的。張崇威[23]等人利用Captiva EMR-Lipid固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時分析豬肉、雞肉、雞蛋中51種藥物殘留。胡巧茹[24]等人用Captiva EMR-Lipid小柱凈化，建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證糧谷產(chǎn)品中20種真菌毒素的方法。肖曉峰[25]等人對比分析了QuEChERS dSPE EMRLipid試劑盒和Captiva EMR-Lipid試劑盒對橄欖油食品模擬物中7種對苯二甲酸酯或苯甲酸酯的凈化效果。目前還未見Captiva EMR-Lipid小柱在液體乳農(nóng)殘檢測中的應用報道。

本文利用Captiva EMR-Lipid小柱的超強凈化作用和靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜建立液體乳中59種農(nóng)藥殘留的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法。涵蓋了有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類等農(nóng)藥；采用全掃描和二級質(zhì)譜掃描相結(jié)合的方式，方便數(shù)據(jù)回溯；利用基質(zhì)匹配標準溶液定量，降低了背景干擾，分析方法的各項參數(shù)可以滿足液體乳中農(nóng)藥殘留的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Q Exactive PLUS四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜及Vanquish VF-P10-A高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國Thermo公司；電子天平，梅特勒-托利；5804離心機；渦旋振蕩器，德國heidolph；超純水器，MILLIPORE；Captiva EMR-Lipid凈化柱（6 mL，600 mg），美國Agilent公司；Thermo Accucore VDX色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），美國Thermo公司；Cleanert S C18凈化柱和Cleanert MAS-Q dSPE凈化管，天津博納艾杰爾科技有限公司。

乙腈、甲醇（色譜純），美國Thermo公司；乙酸銨（分析純，≥98%）、甲酸（Aladdin，色譜級，≥98%），國藥集團化學試劑有限公司；萃取鹽包（QuEChERS Extract Pouch，EN Method，4 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉二水合物，0.5 g檸檬酸氫鈉），美國Agilent公司。

農(nóng)藥標準品：59種農(nóng)藥混合標準品購自月旭上?？萍加邢薰?，濃度50μg/mL（乙酸乙酯）。

1.2 樣品前處理

稱取5 g牛奶（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈，同時加入萃取鹽包，渦旋混勻1 min，劇烈振蕩5 min。待離心管冷至室溫后，5 000 r/min離心2 min，取5 mL上清液于10 mL離心管中，加入1 mL超純水，輕微振蕩混勻。將混合液直接上樣至Captiva EMR-Lipid凈化柱，僅靠重力作用凈化，用1.5 mL乙腈-水（8∶2）混合溶劑沖洗凈化柱，結(jié)束后用洗耳球排空凈化柱。取3 mL流出液于40℃氮吹濃縮至1 mL，過0.22μm濾膜，上機測試。

1.3 標準溶液配制

基質(zhì)匹配標準工作溶液配制：按照1.2的樣品前處理方法處理空白基質(zhì)樣品，得到空白基質(zhì)提取液，配制濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/kg的基質(zhì)匹配標準工作溶液，該工作液應現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Thermo Accucore VDX色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），柱溫：30℃，流速：0.4 mL/min，流動相A：5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水溶液，流動相B：5 mmol乙酸銨0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～4 min，0～20%B；4～5.5 min，20%～40%B；5.5～10.5 min，40%～100%B；10.5～12.9 min，100%B；12.9～15 min，100%～0 B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：可加熱電噴霧離子源（HESI）；離子源溫度：325℃；噴霧電壓：3.60 kV；透鏡電壓：50.0 V；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；輔助氣溫度：350℃；質(zhì)量分析器：Orbitrap；掃描模式：Full MS-ddMS2；采集范圍：120.0～1500.0 m/z；一級質(zhì)譜分辨率為70 000 FWHM；C-trap最大容量（AGC target）：1×106；C-trap最大注入時間：200 ms；二級質(zhì)譜分辨率17 500 FWHM；C-trap最大容量（AGC target）：2×105；C-trap最大注入時間：60 ms；歸一化碰撞能（NCE）：20/40/60 eV；動態(tài)排除：8.0 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

利用一級質(zhì)譜全掃描的母離子精確質(zhì)量數(shù)對應的色譜峰峰面積進行定量分析，全掃描范圍為120.0～1 500.0 m/z，利用保留時間和二級質(zhì)譜的特征離子進行定性分析，根據(jù)響應強度，每個化合物指定兩個定性離子。黃合田[20]等人在高分辨質(zhì)譜快速篩查綠茶中農(nóng)藥及代謝物的研究中發(fā)現(xiàn)，乙硫甲威和滅蟲威的精確質(zhì)量數(shù)相同，但可通過不同的保留時間和特征碎片離子（乙硫甲威：107.04927，滅蟲威：121.06472）進行區(qū)分。以O(shè)rbitrap作為質(zhì)量分析器的質(zhì)譜系統(tǒng)，其一級質(zhì)譜的分辨率可達140 000，可以保證實測質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量數(shù)之間的相對偏差足夠小，排除假陽性結(jié)果。孟志娟[21]等人報道當質(zhì)譜分辨率低于60 000時，嘧霉胺的定性離子m/z 199.11049與干擾離子m/z 199.09990無法分開，容易造成假陽性結(jié)果。本研究中將一級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000，二級質(zhì)譜分辨率為17 500，相對質(zhì)荷比偏差閾值設(shè)定為5×106。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動相的pH、是否添加緩沖鹽及不同的色譜柱對液相色譜分離化合物的效果至關(guān)重要。本研究比較了Thermo Accucore VDX色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）和Thermo Accucore C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6μm）。結(jié)果表明，農(nóng)藥化合物在兩根色譜柱上均有保留，但C18柱對部分化合物的響應略低，如四螨嗪和雙苯氟脲對應的峰面積僅為VDX柱峰面積的50%。流動相的pH及緩沖鹽影響目標化合物的離子化效率和分析靈敏度，分別考察了以甲醇、乙腈、5 mmol乙酸銨0.1%甲酸甲醇對目標物的分析靈敏度。發(fā)現(xiàn)以甲醇為流動相，基質(zhì)匹配工作液中的氟蟲酰胺和丙硫菌唑未出峰；以乙腈作為流動相，咪唑菌酮和敵敵畏的響應值明顯降低，相比于5 mmol乙酸銨0.1%甲酸甲醇流動相，降低10倍。本研究采用梯度洗脫程序，15 min內(nèi)，各化合物均能得到較好分離。基質(zhì)匹配標準工作液中部分化合物的提取離子流圖如圖1所示。

2.3 前處理方法優(yōu)化

在提取液中加入適量有機酸，有利于提高氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率[26-28]。本研究涉及的農(nóng)藥極性范圍廣，提取液的選取對回收率至關(guān)重要。分別考察了乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈對59種農(nóng)藥的回收率，結(jié)果如圖2所示，隨著提取液中甲酸含量的增加，回收率＜70%的農(nóng)藥個數(shù)減少，回收率＞120%的農(nóng)藥個數(shù)增加，當提取液中甲酸濃度為0.2%時，回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥個數(shù)為51個，回收率＜70%和回收率＞120%的農(nóng)藥個數(shù)分別為1和7個。

液體乳樣品提取液的凈化對農(nóng)藥殘留檢測至關(guān)重要。本研究比較了Captiva EMR-Lipid凈化柱、Cleanert S C18凈化柱和Cleanert MAS-Q dSPE凈化管對液體乳樣品的凈化效果，采用Full MS模式采集凈化液的質(zhì)譜信息。結(jié)果如圖3所示，Captiva EMRLipid凈化柱有效地隔絕了提取液中干擾物質(zhì)的流出，凈化效果最優(yōu)，而Cleanert MAS-Q dSPE凈化管幾乎沒有凈化效果。

2.4 基質(zhì)效應

色譜分析中與目標物共流出的干擾組分會產(chǎn)生基質(zhì)效應（Matrix Effect，ME），影響分析方法的靈敏度和定量結(jié)果的準確性。基質(zhì)效應通常以目標物在基質(zhì)匹配標準溶液和純?nèi)軇藴嗜芤褐许憫档牟町惓潭冗M行評估，一種方法[29]是比較目標物峰面積，另一種方法[30]是比較基質(zhì)匹配標準曲線的斜率和純?nèi)軇藴是€的斜率，后者可以更為全面地體現(xiàn)基質(zhì)效應。本研究以基質(zhì)匹配標準曲線斜率對純?nèi)軇藴是€斜率的相對偏差表示基質(zhì)效應，作為ME值。若ME＜10%，基質(zhì)效應可忽略不計；ME值在10%～20%之間，則存在弱基質(zhì)效應；ME值＞20%，存在強基質(zhì)效應。

實驗結(jié)果表明，54種農(nóng)藥的ME≤10%，咪唑煙酸、滅蠅胺的ME＞20%，多菌靈、氯氰菊酯、氟苯蟲酰胺的ME值在10%～20%之間，可見90%以上的農(nóng)藥受基質(zhì)影響較小。為進一步降低基質(zhì)的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線定量。

2.5 方法評價

基質(zhì)匹配標準曲線中以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）作圖，得到各農(nóng)藥的標準曲線。各農(nóng)藥化合物在0.005～0.1 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R＞0.99。對濃度為0.005 mg/kg的標準溶液進行逐級稀釋后進樣測試，根據(jù)3倍信噪比（S/N=3）估算檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N=10）估算定量限（LOQ）。其中甲拌磷、塞普洛、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1A的定量限分別為0.012 mg/kg、0.0007 mg/kg和0.003 mg/kg，略高于GB 2763-2019國家標準中對牛乳規(guī)定的0.01 mg/kg、0.0004 mg/kg和0.002 mg/kg，其余農(nóng)藥化合物的定量限均在0.0007～0.017 mg/kg之間，滿足國家標準中0.004～1 mg/kg的限量規(guī)定。加標回收實驗中3個加標濃度分別為0.005、0.02和0.05 mg/kg，每個濃度重復測定6次。以加標濃度為0.02 mg/kg的樣品為例，除雙甲脒回收率偏低，其余農(nóng)藥化合物的回收率均在70%～130%之間，相對標準偏差（RSD）為2.54%～13.18%。

2.6 實際樣品分析

采用本研究建立的分析方法對20個市售液體乳樣品進行快速篩查與定量，樣品主要包含巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、調(diào)制乳。篩查條件約束為質(zhì)荷比偏差小于5×106、同位素豐度比大于90%、至少一個碎片離子與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配。兩個樣品中分別有丙溴磷、螺螨酯同時符合上述3個篩查條件，視為陽性檢出。利用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析，3次平行實驗中丙溴磷的檢出濃度為3.705、4.144、3.592μg/kg，螺螨酯檢出濃度為0.38、0.382、0.416μg/kg。我國國家標準GB 2763-2021規(guī)定牛乳中丙溴磷、螺螨酯最大限量值分別為10、4μg/kg，歐盟規(guī)定的最大限量值分別為10、4μg/kg，日本規(guī)定的最大限量值分別為10、10μg/kg，對比發(fā)現(xiàn)均未超標。陽性樣品中丙溴磷的色譜和質(zhì)譜圖如圖4～6所示。

圖1 基制匹配標準工作液中部分農(nóng)藥的提取離子流圖

圖2 提取溶劑中甲酸含量對目標物回收率的影響

圖3 不同凈化方式下空白樣品的色譜圖

圖4 陽性樣品中丙溴磷色譜圖

圖5 陽性樣品中丙溴磷一級質(zhì)譜圖

圖6 陽性樣品中丙溴磷二級質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了液體乳中59種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查與定量分析方法。樣品提取液經(jīng)Captiva EMR-Lipid凈化柱一步凈化，簡化了凈化過程，提高了凈化效果；在15 min內(nèi)可實現(xiàn)59種農(nóng)藥殘留的色譜分離與質(zhì)譜定量分析；利用自建農(nóng)殘高分辨數(shù)據(jù)庫，以精確離子質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級質(zhì)譜特征碎片離子為篩查條件完成了快速篩查。在后續(xù)研究中還需要進一步擴展農(nóng)藥高分辨質(zhì)譜信息庫，將更多的農(nóng)藥納入篩查范圍，尤其是極性較強、需使用特殊前處理方法和色譜條件的農(nóng)藥分子，如矮壯素、敵草快、百草枯等。