朱永剛，王明博，孟令嬌，單保恩（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院.科研中心；.胸外科，河北 石家莊 050011）

食管癌是全球第七大常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第六大原因[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是中國人群食管癌的主要組織學(xué)類型[2]。盡管近年來關(guān)于ESCC 的治療方案已有很大改進(jìn)，但患者的5 年生存率仍不理想[3]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類由共價(jià)鍵形成的閉合環(huán)狀RNA[4-5]。由于缺乏Ploy A尾，circRNA與其相應(yīng)的線性RNA相比具有高度穩(wěn)定性[6-7]。越來越多的研究結(jié)果[8-12]表明，circRNA在人類細(xì)胞中廣泛表達(dá)并參與包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題分析了GEO 數(shù)據(jù)庫中ESCC 和癌旁組織差異表達(dá)的circRNA，并采用qPCR 法在中國人ESCC 組織標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，采用FISH 法在90 例ESCC 組織及癌旁組織中對(duì)篩選到的hsa_circ_0087378 進(jìn)行檢測(cè)，分析其表達(dá)與ESCC患者臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，為尋找ESCC的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

10對(duì)經(jīng)過病理驗(yàn)證的ESCC及癌旁組織新鮮標(biāo)本取自2020年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的ESCC 患者；進(jìn)行FISH 檢測(cè)的組織樣本取自于2015年10月至2016年4月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的90例ESCC患者。所有癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為ESCC，且患者術(shù)前未行放療、化療。研究方案征得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020ky357），入組患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 qPCR法檢測(cè)ESCC組織中hsa_circ_0087378的表達(dá)

采用TRIzol 試劑提取組織的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Promega公司）說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用GoTaq?qPCR Master Mix（購自Promega 公司）進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，所用引物序列：U6上游為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；hsa_circ_0087378上游為5'-CTGTGGTGGTGATTGCGTCT-3',下游為5'-ATG TCATTCGCTGCAGTTCC-3'。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以U6為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算hsa_circ_0087378的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 FISH法檢測(cè)ESCC組織中has_circ_0087387的表達(dá)

組織切片經(jīng)脫蠟入水后用PBS沖洗，加入預(yù)熱的蛋白酶K溶液37 ℃處理20 min，PBS沖洗，加入封閉液37 ℃處理1 h，加入生物素標(biāo)記的針對(duì)hsa_circ_0087378環(huán)化剪接點(diǎn)的特異性探針（序列為5'-TAATTT GGGTTTGCACCTTTCATGC-3'）在37 ℃下雜交過夜。次日，使用緩沖液洗脫非特異性結(jié)合位點(diǎn)，使用Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素（ZyMAXTM Grade，Invitrogen公司）檢測(cè)熒光信號(hào)。DAPI復(fù)染10 min，封片后采用LSM 900共聚焦顯微鏡（Zeiss公司）捕獲圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)分析circRNA 在組織中的表達(dá)情況。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用卡方檢驗(yàn)分析hsa_circ_0087378 的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。通過Kaplan-Meier 方法評(píng)估患者的總體生存率，通過Log-Rank檢驗(yàn)比較各組之間的差異，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中has_circ_0087378表達(dá)升高最為顯著

從GEO數(shù)據(jù)庫中查找ESCC及癌旁組織的circRNA芯片數(shù)據(jù)集GSE131969，以|log2(FC)|≥1 和P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到602 個(gè)在ESCC 中上調(diào)的circRNA，89個(gè)下調(diào)的circRNA。圖1A 為上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)居高端的20個(gè)circRNA的差異表達(dá)圖。選取10對(duì)ESCC組織及相應(yīng)癌旁組織，采用qPCR法對(duì)數(shù)據(jù)庫中篩查到的呈高上調(diào)前5 位的circRNA 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，hsa_circ_0087378、hsa_circ_0023984、hsa_circ_0000277、hsa_circ_0055038 在ESCC 組織中呈高表達(dá)，其中hsa_circ_0087378的表達(dá)水平最高（P＜0.01；圖1B）。

圖1 ESCC組織和相應(yīng)癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA

2.2 hsa_circ_0087378在ESCC組織中呈高表達(dá)

FISH檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，90例癌旁組織中，21例hsa_circ_0087378 呈高表達(dá)，高表達(dá)率為23.3%（21/95）；90 例ESCC 組織中，有65 例hsa_circ_0087378 呈高表達(dá)，高表達(dá)率為72.2%（65/95），結(jié)果表明，ESCC 組織中has_circ_0087387 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。

圖2 FISH法檢測(cè)ESCC組織和癌旁組織中hsa_circ_0087378的表達(dá)

2.3 ESCC 組織中hsa_circ_0087378 表達(dá)與ESCC 患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

分析ESCC 組織中has_circ_0087387 表達(dá)與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果（表1）顯示，hsa_circ_0087378 的高表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)聯(lián)（均P＜0.05）。

表1 ESCC組織中hsa_circ_0087378表達(dá)與ESCC患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.4 hsa_circ_0087378高表達(dá)的ESCC患者預(yù)后較差

生存分析結(jié)果（圖3）顯示，hsa_circ_0087378 高表達(dá)組的ESCC 患者5 年總生存率明顯低于低表達(dá)組患者（P=0.005），提示hsa_circ_0087378 可能是ESCC患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)。

圖3 hsa_circ_0087378的表達(dá)與ESCC患者5年總生存率的關(guān)系

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，circRNA 在食管癌的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，有望成為食管癌早期診斷、預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[13-16]。例如，hsa_circ_0000277 可以通過抑制miR-4766-5p的功能，從而上調(diào)層粘連蛋白α1（laminin alpha 1，LAMA1），促進(jìn)ESCC 的進(jìn)展[17]。circRNA has_circ_0006168 可通過調(diào)節(jié)miR-194-5p/JMJD1C 軸而增強(qiáng)ESCC 對(duì)紫杉醇的抗性[18]。hsa_circ_0000700 通過作為miR-1229 的分子海綿促進(jìn)ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移[19-20]。

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫分析了ESCC 組織和其相應(yīng)癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA，并以qPCR 法驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0087378、hsa_circ_0023984、hsa_circ_0000277、hsa_circ_0055038 在ESCC 組織中呈高表達(dá)，其中hsa_circ_0087378 表達(dá)水平最高。隨后采用FISH法檢測(cè)了hsa_circ_0087378在90例中國人ESCC組織及其相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在ESCC 組織中的表達(dá)明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織，并且其表達(dá)與ESCC 患者的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)聯(lián)。此外，生存分析結(jié)果表明，hsa_circ_0087378 的高表達(dá)與ESCC 患者的5 年總生存率較差有關(guān)聯(lián)，其可作為ESCC患者預(yù)后不良的指標(biāo)。以上結(jié)果表明，hsa_circ_0087378 可能在ESCC進(jìn)展中發(fā)揮了促癌作用，推動(dòng)了ESCC的發(fā)展進(jìn)程。

綜上，本研究為尋找ESCC的新型腫瘤生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，hsa_circ_0087378在ESCC中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制仍不明確，需要今后深入研究。