王瑛琦，徐世一，趙程程

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

氧化石墨烯（GO）是一種性能優(yōu)異的新型碳材料[1]。功能化氧化石墨烯因其在水溶性、生物相容性、載藥能力、緩控釋特性及靶向性等方面的卓越性能，在各個(gè)領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。但傳統(tǒng)氧化石墨烯制備過程存在操作危險(xiǎn)性高，氧化水平低的問題，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)及藥用價(jià)值的開發(fā)。

本文創(chuàng)新了氧化石墨烯的制備方法，采用五天氧化法制備氧化石墨烯，并利用紅外、紫外、電鏡等儀器重點(diǎn)考察氧化石墨烯樣品的各項(xiàng)性能。該方法增強(qiáng)了對(duì)氧化石墨烯表面的修飾，使其活性位點(diǎn)增加并改善了穩(wěn)定性。五天氧化法制備的氧化石墨烯可廣泛應(yīng)用在藥學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[3]，并可以通過π-π堆積或靜電作用負(fù)載抗腫瘤藥物[4]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鱗片石墨（500 目，99.9% 北京市紅星化工廠）；NaNO3（AR 天津巴斯夫化工有限公司）；KMnO4（AR鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司）；BaCl2（AR 天津市巴斯夫化工有限公司）；乙二胺四乙酸（AR 天津瑞金特化學(xué)品有限公司）；K2S2O8（AR 天津市博迪化工股份有限公司）；P2O5（AR 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）；氧化石墨烯標(biāo)準(zhǔn)品（150nm 南京吉倉(cāng)納米科技有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（AR 廣州蘇喏化工有限公司）。

WFZ UV-4802H 型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90 型激光粒度分析儀（馬爾文儀器有限公司）；IRTracer-100 型紅外分光光度儀（日本島津公司）；JEM-2100F 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)）。

1.2 氧化石墨烯的制備

將一定量的硝酸鈉（NaNO3）與濃硫酸（H2SO4）室溫下攪拌溶解。加入預(yù)氧化的石墨粉，并于0～4℃下，緩慢加入適量高錳酸鉀（KMnO4）攪拌2h，然后轉(zhuǎn)于室溫下繼續(xù)攪拌5d。加入H2SO4溶液室溫?cái)嚢?h，滴加過氧化氫（H2O2）溶液直至變?yōu)榻瘘S色，然后室溫下攪拌2h 備用。用3（wt）%的H2SO4和0.5（wt）%的H2O2混合液及蒸餾水反復(fù)離心清洗（10000r·min-1,10min），去上清液，直至溶液呈中性，冷凍干燥，干燥后產(chǎn)物呈棕色疏松片層。

將上述樣品用去離子水溶解，在60Hz 條件下超聲2h，分散液離心分離，并用去離子水洗3 遍，配制1mmol·L-1EDTA 溶液用2%（W/V）的碳酸氫鈉（NaHCO3）調(diào)節(jié)pH 值為8，透析，冷凍干燥36h，得到最終樣品。

1.3 氧化石墨烯的表征

1.3.1 產(chǎn)率及形態(tài) 將石墨的初始投放質(zhì)量與制備所得GO 產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較，觀察形態(tài)表征并計(jì)算產(chǎn)率。所用公式為產(chǎn)率=產(chǎn)量/投入量×100%。

1.3.2 粒徑分析 取GO 產(chǎn)品用去離子水復(fù)溶，用粒徑儀測(cè)得粒徑值（n=3）。

1.3.3 紫外分析 在波長(zhǎng)200～400nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，對(duì)GO 樣品與GO 標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收特征峰進(jìn)行對(duì)比。

1.3.4 紅外分析 取適量石墨、GO 標(biāo)準(zhǔn)品、GO 樣品，分別制成KBr 壓片，進(jìn)行紅外掃描分析。

1.3.5 透射電鏡分析 采用日本電子株式會(huì)200kV場(chǎng)發(fā)射JEM-2100 透射電子顯微鏡，對(duì)納米級(jí)GO的微觀形態(tài)進(jìn)行表征。根據(jù)照片中各處的灰度不同，可以看出GO 片層形態(tài)，換角度觀察可粗略分析GO層數(shù)及其相對(duì)厚度，以此來評(píng)價(jià)制備方法的優(yōu)良情況。

1.3.6 羧基含量的測(cè)定及分析 羧基含量可決定后續(xù)反應(yīng)中通過酰胺化反應(yīng)或酯化反應(yīng)相接連的有機(jī)小分子、高分子、生物大分子的數(shù)量。本部分實(shí)驗(yàn)采用透析法和返滴定法來測(cè)定羧基的含量。

1.3.6.1 氧化石墨烯溶液的配制 稱取GO 樣品約0.05g，蒸餾水配成濃度為1mg·mL-1的溶液。取上述溶液50mL，加入過量的NaOH（約0.40g），充分反應(yīng)后透析，每12h 換一次水，直至透析袋外的水接近中性，收集透析后的蒸餾水并記錄透析外液總體積。

1.3.6.2 NaOH 的標(biāo)定 配制0.1mol·L-1NaOH 溶液加入酚酞指示液2D。精密稱取干燥的鄰苯二甲酸氫鉀（KHC8H4O4）粉末0.60g，充分溶解于沸后冷卻的蒸餾水中。用NaOH 溶液滴定KHC8H4O4溶液，完全溶解且溶液顯粉紅色為滴定終點(diǎn)。記錄消耗NaOH 溶液的量，計(jì)算出NaOH 的濃度。

1.3.6.3 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用0.1mol·L-1NaOH溶液滴定HCl 溶液，記錄消耗NaOH 溶液的量，根據(jù)其計(jì)算出HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液的真實(shí)濃度。

式中 W：KHC8H4O4的稱樣量，g；V：標(biāo)定時(shí)消耗NaOH滴定液的體積，mL。

向透析所得的水樣中滴加甲基橙指示劑2D，用標(biāo)定過的HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液由黃色變?yōu)槌壬珪r(shí)即達(dá)到滴定終點(diǎn)，記錄此時(shí)所用HCl 體積。在標(biāo)定NaOH 時(shí)，要使用新煮沸過放涼的冷水溶解基準(zhǔn)物，其目的是可避免水中的CO2對(duì)標(biāo)定的影響。由于滴定時(shí)選用的KHC8H4O4粉末為強(qiáng)堿弱酸鹽顯堿性，所以，選用酚酞作為此滴定的指示劑。透析法與返滴定計(jì)算-COOH 含量的公式的如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 新工藝對(duì)樣品產(chǎn)率及形態(tài)的影響

3 次樣品質(zhì)量分別為：2.1838、2.2584、2.1980g，根據(jù)初始石墨投入量分別為2.010、2.011、2.009g，算得其平均產(chǎn)率110.12%?？芍獋鹘y(tǒng)制備方法制備GO的產(chǎn)率低于100.00%，五天氧化法制備結(jié)果見表1。

表1 五天氧化法制備結(jié)果Tab.1 Results of five - day oxidation method

由表1 可知，產(chǎn)率有顯著的提升。

2.2 新工藝對(duì)樣品粒徑的影響

將產(chǎn)品復(fù)溶平均分為3 份，用粒徑儀測(cè)出粒徑值分別為：153.7、137.2、151.3nm，平均粒徑為147.4nm，見圖1。

圖1 粒徑分布圖Fig.1 Particle size map

2.3 新工藝對(duì)樣品氧化程度的影響

2.3.1 氧化石墨烯樣品的含量分析 通過紫外檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)配制濃度溶液得到相應(yīng)吸光度，繪制GO 標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。得到線性方程回歸曲線為Y=38.243X+0.0106（R2=0.9997）。（Y 為峰面積，X 為氧化石墨烯濃度），配制GO 樣品0.01mg·mL-1的溶液，利用紫外分光光度計(jì)在231nm 處定點(diǎn)掃描其吸光度值，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算其濃度，重復(fù)3 次此操作，結(jié)果見表3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)配制濃度與吸光度數(shù)據(jù)Tab.2 Data of standard concentration and absorbance

表3 GO 樣品濃度Tab.3 GO sample concentration

由表3 可知，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出，定點(diǎn)231nm 3 次測(cè)得其吸光度平均值為A=0.3750，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到X=0.0095，即濃度為0.0095mg·mL-1與0.01mg·mL-1相近，證明本實(shí)驗(yàn)合成的GO 的符合研究標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 為GO 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖2 GO 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 GO standard graph

2.3.2 紫外吸收分析 我國(guó)氧化石墨烯產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜見圖3。

圖3 GO 樣品、GO 標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜圖Fig.3 Uv spectra of GO sample and GO standard

由圖3 可知，GO 在231nm 處表現(xiàn)出一強(qiáng)吸收峰，其為GO 上共軛C=C 的π→π 躍遷。在300nm處可見肩峰，其為GO 上C=O 雙鍵的n→π 躍遷。本實(shí)驗(yàn)中合成的GO 樣品的紫外吸收峰比GO 標(biāo)準(zhǔn)品更清晰，再次確認(rèn)了GO 結(jié)構(gòu)間碳骨架的存在，并且石墨片層中被成功插入了含氧官能團(tuán)。

2.4 紅外光譜分析

石墨、GO 標(biāo)準(zhǔn)品、GO 樣品紅外光譜圖見圖4。

圖4 石墨、GO 標(biāo)準(zhǔn)品、GO 樣品紅外吸收對(duì)比圖Fig.4 Comparison of infrared absorption of graphite, GO standard and GO sample

由圖4 可知，通過對(duì)石墨、GO 標(biāo)準(zhǔn)品及GO 樣品紅外吸收峰的比較發(fā)現(xiàn)，石墨無明顯的紅外吸收峰。而GO 樣品在3416.30cm-1處存在-OH 吸收峰，在1734.01 及1622.03cm-1處存在-COOH 的C=O 伸縮振動(dòng)峰，在1086.07cm-1處存在C-O-C 伸縮振動(dòng)，證明GO 上連有大量含氧基團(tuán)，表明含氧官能團(tuán)已成功的插入石墨片層中。也正是由于GO 表面豐富的羧基、羥基及環(huán)氧等官能團(tuán)，使GO 易與水分子形成氫鍵，體現(xiàn)了良好的水溶性。同時(shí)GO 標(biāo)準(zhǔn)品在3419.47 及3190.21cm-1處 存 在-OH 吸 收 峰，在1622.26cm-1處存在-COOH 的C=O 伸縮振動(dòng)峰，在1086.21cm-1處存在C-O-C 伸縮振動(dòng)峰，其與GO 標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰相對(duì)應(yīng)，再次證明GO 樣品被成功氧化。

2.5 工藝優(yōu)化后對(duì)材料表面形貌的影響

GO 標(biāo)準(zhǔn)品與GO 樣品電鏡圖見圖5。

圖5 透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopy

由圖5 可知，GO 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均呈現(xiàn)出薄紗狀織構(gòu)，并存在疊合體，其是由于少數(shù)層或單層GO之間重新堆垛引起堆疊。石墨烯自發(fā)卷曲堆垛成石墨烯納米片形成豐富褶皺，形成眾多的納米孔道和納米孔穴，從而使石墨烯具有超大的比表面積。GO樣品與標(biāo)準(zhǔn)品形態(tài)基本一致，說明GO 已經(jīng)成功分散成納米級(jí)褶皺片層，片層均勻，基本呈現(xiàn)單片層分布，且質(zhì)地輕薄。

2.6 羧基含量的測(cè)定及分析

NaOH 滴定結(jié)果見表4，透析法與返滴方法測(cè)羧基含量結(jié)果見表5。

表4 NaOH 滴定結(jié)果Tab.4 NaOH titration results

表5 透析法與返滴定法測(cè)羧基含量結(jié)果Tab.5 Results of carboxyl content measured by dialysis and back titration

由表4、5 可知，代入公式可得CNaOH=0.097mol·L-1，通過NaOH 滴定HCl 可得到CHCl=0.114mol·L-1，最終GO 的羧基含量=199.815mol·g-1。結(jié)果表明，一定的羧基含量代表GO 結(jié)構(gòu)中含氧基團(tuán)可包載更多的藥物，為后續(xù)作為藥物載體材料做好充分的準(zhǔn)備。

3 結(jié)論

本文采用五天氧化法制備樣品并進(jìn)行表征，操作安全且氧化程度高?？梢奊O 產(chǎn)品分散液呈棕褐色，凍干粉為棕色疏松片層，微觀結(jié)構(gòu)呈略有褶皺的薄片型，制備平均產(chǎn)率為110.12%，平均粒徑在147.40nm。產(chǎn)率增加且形態(tài)穩(wěn)定。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)試，GO 樣品較GO 標(biāo)準(zhǔn)品特征峰更加明顯，氧化程度提高。經(jīng)紅外光譜儀分析表明，其在3416.30，1734.0，1622.03 和1082.07cm-1處出現(xiàn)C-O 和C=O特征吸收峰，說明氧化程度高，表面存在大量含氧基團(tuán)，為日后作為藥用載體材料研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。