便攜式生物傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王沂雯，劉晏霖，付瑞杰，劉浩然，周 靜，趙其陽，王成秋，焦必寧,*，何 悅,*

（1.西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶 400712）

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的功能，降低細(xì)胞對(duì)毒素的抵抗能力，對(duì)人類和動(dòng)物的健康危害極大。目前，研究者們現(xiàn)已分離出400多種真菌毒素，并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了相關(guān)研究。由于其特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致毒性難以被外界條件所破壞。在眾多的真菌毒素中，對(duì)生命體具有較大毒性的主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、展青霉毒素（patulin，PAT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等。值得注意的是，大多數(shù)真菌可以同時(shí)產(chǎn)生多種真菌毒素。因此，被真菌感染的農(nóng)作物、飼料及食品往往同時(shí)受到多種真菌毒素的污染。

近年來，由真菌毒素造成的食品安全事件頻頻發(fā)生，眾多科學(xué)家們?yōu)閷?shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的有效監(jiān)測(cè)進(jìn)行了孜孜不倦地探索。目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于真菌毒素定量檢測(cè)的方法，如薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等。以上方法可以實(shí)現(xiàn)真菌毒素準(zhǔn)確、靈敏和多組分同時(shí)檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛的應(yīng)用。但這些用于真菌毒素定量檢測(cè)的方法通常需要大型且精密的儀器、熟練的操作人員以及復(fù)雜的樣品前處理，限制了它們?cè)谡婢舅噩F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，開發(fā)操作簡(jiǎn)單、設(shè)備輕便、檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高的生物傳感器以用于真菌毒素的即時(shí)檢測(cè)具有重要的科學(xué)意義。

便攜式生物傳感器由于其操作方便、體積小巧、檢測(cè)速度快、精確度高且檢測(cè)專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可滿足目標(biāo)分析物現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的需求，受到了研究者們的高度重視。其可以在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室外對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，縮短了數(shù)據(jù)輸出的時(shí)間，方便且快捷。近些年來，研究人員將一些成本低、簡(jiǎn)單易得的材料及商品化小型儀器用于便攜式生物傳感器的構(gòu)建，致力于實(shí)現(xiàn)真菌毒素的即時(shí)檢測(cè)。本文綜述試紙條、個(gè)人血糖儀（personal glucose meters，PGM）、手持式pH計(jì)、氣壓計(jì)、智能手機(jī)、微流控芯片以及基于可視化、電化學(xué)、等離子體等輸出信號(hào)的便攜式生物傳感器在真菌毒素現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用中的研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)這一領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行闡述。

1 便攜式生物傳感器中真菌毒素的識(shí)別元件

由于真菌毒素對(duì)食品的污染具有較高的風(fēng)險(xiǎn)性，并且還對(duì)人、畜、環(huán)境具有嚴(yán)重的危害性，因此，開發(fā)性能優(yōu)異的檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及食品中的真菌毒素進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成為迫切需要，以保障食品安全和人類健康。便攜式生物傳感器是對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行微量檢測(cè)的小型器件，其工作原理為當(dāng)識(shí)別元件和目標(biāo)分析物結(jié)合之后，信號(hào)探針會(huì)產(chǎn)生與目標(biāo)分析物濃度相關(guān)的信號(hào)，最后利用儀器儀表可讀出檢測(cè)信號(hào)。它具有便于攜帶、用戶友好的優(yōu)點(diǎn)，能夠作為目標(biāo)分析物即時(shí)檢測(cè)的有利工具。但其檢測(cè)靈敏度、響應(yīng)速度和特異性易受識(shí)別元件的影響，因而在便攜式生物傳感器中其識(shí)別元件起著至關(guān)重要的作用。目前用于真菌毒素檢測(cè)的最常見的識(shí)別元件為抗體、核酸適配體和分子印記聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs）。以下將對(duì)真菌毒素的抗體、核酸適配體和MIPs的制備和性能進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

1.1 抗體

1.1.1 單克隆抗體

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）是一種由效應(yīng)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的漿細(xì)胞分泌的，與抗原特異性結(jié)合的大型Y形蛋白質(zhì)。mAb是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，因其高度特異性而被廣泛應(yīng)用于疾病診斷及治療。隨著研究人員的深入研究，抗體已被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫層析法中，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)分析物的高靈敏、高特異性檢測(cè)。為了能夠?qū)⑵涓鼜V泛地應(yīng)用于科學(xué)研究中，研究者們還通過不同的化學(xué)試劑將酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、-半乳糖苷酶）、熒光染料（異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白等）、生物素等修飾到抗體上。楚金申利用生物素--羥基琥珀酰亞胺酯修飾的二抗建立了ELISA法檢測(cè)玉米中的ZEN，檢出限為0.42 ng/mL，該方法的檢測(cè)時(shí)間為50 min。盧江等利用辣根過氧化物酶修飾的二抗建立了一種間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米樣品中ZEN的檢測(cè)，檢出限為0.09 ng/mL。通過制備修飾型抗體可進(jìn)一步建立更多的檢測(cè)方法用于食品中真菌毒素檢測(cè)。

目前，也有越來越多的研究人員致力于真菌毒素的抗體篩選，部分已篩選出的真菌毒素單克隆抗體如表1所示。多數(shù)真菌毒素mAb已逐步實(shí)現(xiàn)商品化，如AF、OT、PAT、ZEN。對(duì)于單克隆抗體的制備多采用雜交瘤技術(shù)，主要包括免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合和選擇性培養(yǎng)等過程。由于真菌毒素分子質(zhì)量較小，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原，因此，為了得到真菌毒素的特異性抗體，必須選擇蛋白質(zhì)大分子作為載體對(duì)毒素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。常用的載體有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）等。人工抗原制備好后再對(duì)鼠、兔等進(jìn)行免疫以獲得高質(zhì)量的抗體，經(jīng)鑒定獲知抗體的類型及效價(jià)。例如，肖智等研制了AFBmAb。具體方法為：先將AFB轉(zhuǎn)化為其半縮醛形式AFB，接著AFB和BSA氨基發(fā)生醛胺縮合反應(yīng)，隨后在硼氫化鈉還原作用下得到免疫原AFB-BSA復(fù)合物。AFB-BSA免疫BALB/C小鼠后，3只小鼠第4次免疫后抗血清效價(jià)均高于1∶250 000。李華采用保護(hù)-去保護(hù)策略使DON的3位C上的羥基與琥珀酸酐反應(yīng)，使DON衍生后獲得一個(gè)羧基，得到衍生物3-半琥珀酰-DON（3-hemisuccinyl-DON，3-HS-DON）。再采用碳化二亞胺法將3-HS-DON與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)，利用快速蛋白液相層析系統(tǒng)對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確保制備得到3-HS-DON-BSA。用所制備的3-HS-DON-BSA作為免疫原，分別采用腹膜腔注射法和頸、背部多點(diǎn)注射法免疫BALB/C小鼠和豚鼠。經(jīng)過間接ELISA法檢測(cè)，豚鼠血清的效價(jià)為1∶6 400，小鼠血清的效價(jià)為1∶12 800。值得注意的是，雖然抗體的制備來源廣泛，不僅可以借助老鼠還可以借助兔等其他動(dòng)物來進(jìn)行制備，但是抗體制備過程繁瑣、生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性差、批次間差異大，因此近年來，廣大研究人員們致力于新型小分子抗體的研究。

表1 真菌毒素抗體Table 1 Antibodies against mycotoxins

1.1.2 納米抗體

研究者們發(fā)現(xiàn)駱駝科動(dòng)物（駱駝、羊駝）體內(nèi)存在一種抗體亞類，由重鏈的一個(gè)可變區(qū)域組成，完全沒有輕鏈，將其稱為重鏈抗體（heavy chain antibody，HCAB）。對(duì)重鏈抗體可變區(qū)（variable heavy chain domain，VHHs）進(jìn)行重組表達(dá)，便可得到僅包含VHHs的單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體（single domain antibody，sdAb），又稱VHH抗體，由于其大小只有普通抗體的1/10左右，故又被稱為納米抗體（nanobody，Nb）。Nb制備過程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構(gòu)建和抗體篩選3個(gè)階段。由于Nb具有分子質(zhì)量小、組織穿透性強(qiáng)、抗原親和力高、能識(shí)別隱藏表位、免疫原性低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，越來越多有毒有害物質(zhì)的Nb被分離出來，并用于食品分析中免疫分析的檢測(cè)。He Ting等用AFB-BSA免疫羊駝后，構(gòu)建了Nb的噬菌體顯示庫。選擇兩個(gè)AFB的特異性Nb進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，開發(fā)了一種Nb 26的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，其半抑制劑量（half inhibition concentration，IC）為0.754 ng /mL，線性范圍為0.117～5.676 ng/mL。結(jié)果顯示，所分離的Nb是測(cè)定AFB的理想選擇。Liu Xing等在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)OTA的Nb（Nb15、Nb28、Nb32、Nb36），并與OTA特異性mAb 6H8的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較。在95 ℃處理5 min或90 ℃處理75 min后，所有Nb仍然可以保持其抗原結(jié)合活性。然后選擇在ELISA中敏感度最高的Nb28進(jìn)一步研究，實(shí)驗(yàn)得出IC為0.64 ng/mL，線性范圍為0.27～1.47 ng/mL。

1.2 核酸適配體

核酸適配體簡(jiǎn)稱適配體，又被稱為“化學(xué)抗體”，是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)在體外核酸分子文庫中篩選獲得的堿基長(zhǎng)度通常在20～60之間的單鏈DNA或RNA序列。適配體作為一種新型分子識(shí)別元件，利用自身折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)與靶物質(zhì)高特異性結(jié)合。其靶物質(zhì)可以是小分子、蛋白質(zhì)、金屬離子，甚至是特定的細(xì)胞。與蛋白質(zhì)抗體相比，適配體具有分子質(zhì)量小、靶分子廣泛、穩(wěn)定性好、易功能性修飾、易合成、成本低等優(yōu)點(diǎn)。正是由于上述獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，適配體作為一種理想的分子識(shí)別元件，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。研究者們可根據(jù)檢測(cè)需要對(duì)目標(biāo)物的適配體進(jìn)行相應(yīng)的修飾，例如，陶醉將辣根過氧化物酶修飾到伏馬毒素B的適配體上，構(gòu)建了基于適配體-辣根過氧化物酶的檢測(cè)方法，通過肉眼觀察和測(cè)定450 nm處的吸光度實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物定性和定量檢測(cè)，在優(yōu)化條件下檢出限為0.30 ng/mL；喻婕將適配體修飾到金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）表面，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，通過AuNPs的特征吸收峰與待測(cè)AFB濃度的相關(guān)性來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)量濃度，AFB檢出限為4.1 pg/mL。對(duì)于適配體的修飾工作研究者們還在進(jìn)一步根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需要不斷完善。

為了豐富真菌毒素高效、高特異性的檢測(cè)手段，廣大研究人員也逐漸投入到真菌毒素適配體的篩選中。目前適配體的篩選仍然以SELEX技術(shù)為基礎(chǔ)，但是傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、過程繁瑣，已不能滿足實(shí)際需要，因此研究者們對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，如目前已報(bào)道的氧化石墨烯-SELEX、人類基因組-SELEX、石英晶體微天平-SELEX和計(jì)算機(jī)輔助-SELEX等。與傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)相比，氧化石墨烯-SELEX技術(shù)不需要對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行固定，簡(jiǎn)化固定程序，并保持了靶標(biāo)的天然構(gòu)象，篩選出的適配體親和力強(qiáng)；人類基因組-SELEX技術(shù)使用天然RNA/DNA作為核酸庫，減少了序列隨機(jī)性，與目標(biāo)物實(shí)際核酸序列更貼近；石英晶體微天平-SELEX可實(shí)時(shí)觀測(cè)篩選過程，不需要分離結(jié)合和游離的核酸分子；計(jì)算機(jī)輔助-SELEX可在提升篩選效率的同時(shí)節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。但這些改進(jìn)的SELEX技術(shù)仍存在一些不足，如：石英晶體微天平-SELEX技術(shù)在經(jīng)過多次輪篩之后會(huì)使篩選效率下降；計(jì)算機(jī)輔助-SELEX技術(shù)沒有統(tǒng)一軟件實(shí)現(xiàn)小分子適配體篩選。因此，在適配體高效篩選上仍有很大的發(fā)展空間。對(duì)于真菌毒素的篩選研究者們還在不斷的摸索。Ma Xiaoyuan等利用SELEX技術(shù)篩選出了AFB的適配體。經(jīng)過10 輪篩選和擴(kuò)增，富集后得到30個(gè)適配體序列。結(jié)合同源性和結(jié)構(gòu)分析以及親和力和特異性實(shí)驗(yàn)，最終獲得了對(duì)AFB具有最佳親和力和特異性的適配體序列。該適配體序列和AFB的解離常數(shù)（）為11.39 nmol/L。Malhotra等采用兩個(gè)SELEX過程（稱為SELEX1和SELEX2）來篩選AFM的適配體。在SELEX1中，使用外切核酸酶生產(chǎn)ssDNA，而在SELEX2中，使用快速冷卻將dsDNA轉(zhuǎn)化為ssDNA，共獲得41個(gè)不同的適配體序列（36個(gè)AFM適配體序列，5個(gè)AFB適配體序列）。值的測(cè)定結(jié)果表明，AFM適配體的值在35～1 515 nmol/L范圍內(nèi)，AFB適配體的值在96～221 nmol/L范圍內(nèi)。此外，同一種毒素經(jīng)不同課題組篩選，獲得了序列不相同的多條適配體，部分適配體序列詳見表2。

表2 真菌毒素適配體Table 2 Aptamer for mycotoxins

1.3 分子印記聚合物

MIPs表示能夠與目標(biāo)分析物相互作用從而選擇性地結(jié)合識(shí)別元件，它可以識(shí)別蛋白質(zhì)、紅細(xì)胞、病毒及毒素等物質(zhì)。與天然抗體相比，MIPs具有更好的結(jié)合性和選擇性，此外，MIPs耐高溫、高壓和酸堿，可回收，易于儲(chǔ)存，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物分析、食品質(zhì)量與安全、生物樣品分離與富集等多個(gè)領(lǐng)域。在MIPs合成過程中，所合成聚合物的官能團(tuán)對(duì)特定的模板分子具有選擇性，完成聚合之后，移除模板分子從而在聚合物基體中產(chǎn)生識(shí)別位點(diǎn)。MIPs有許多合成方法，其方法的選擇取決于MIPs的大小、應(yīng)用領(lǐng)域等，其中最為常用的是非共價(jià)鍵相互作用。MIPs合成技術(shù)的完善與進(jìn)步也推動(dòng)了基于MIPs生物傳感器的發(fā)展。Wang Qingling等建立了一種基于三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)]摻雜硅納米顆粒（RuSi NPs）結(jié)合MIPs的電化學(xué)發(fā)光傳感器，運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)以及印記技術(shù)檢測(cè)玉米樣品中的OTA，其檢出限為0.027 pg/mL。Huang Zhipeng等以MIL-101為載體，以香豆素-3-羧酸為ZEN的模板，甲基丙烯酸為功能性單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯羥基丙烯酸甲基乙酯為交聯(lián)劑，制備了MIPs用于谷物樣品中ZEN的檢測(cè)。Wyszomirski等以5,7-二甲氧基香豆素作為AFB的替代品用于MIPs合成。結(jié)果表明，甲基丙烯酸和烯丙胺都可作為功能單體，對(duì)AFB和5,7-二甲氧基香豆素均有類似的結(jié)合作用。MIPs是一項(xiàng)有前景的識(shí)別原件，在檢測(cè)方面有很大的創(chuàng)新空間，但是因其缺少天然生物識(shí)別分子的柔性結(jié)構(gòu)，在一定程度上影響了其親和力與靈敏度，從而限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2 便攜式生物傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 基于側(cè)流層析試紙條的便攜式生物傳感器

側(cè)流層析試紙條（lateral flow strips，LFSs）是以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細(xì)作用使樣品在層析材料上進(jìn)行移動(dòng)，并通過直接顯色的標(biāo)記物或酶促顯色反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)獲得直觀檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，基于LFSs的檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、成本低、易操作、不需要大型儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也是目前報(bào)道最多、應(yīng)用最廣的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。此外，基于LFSs的檢測(cè)方法可通過肉眼觀察判定檢測(cè)結(jié)果。因此，該類方法表現(xiàn)出的結(jié)果可視性和即時(shí)性為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，已被研究者們廣泛應(yīng)用于微生物、真菌毒素、農(nóng)藥等的檢測(cè)中?；贚FSs的檢測(cè)方法有三類信號(hào)輸出方式：一類為通過顏色變化判定目標(biāo)分析物的比色檢測(cè)方法；一類為通過熒光信號(hào)的變化判定目標(biāo)分析物的熒光檢測(cè)方法；一類為通過磁信號(hào)變化判定目標(biāo)分析物的檢測(cè)方法。下面分別對(duì)這三類信號(hào)輸出方法對(duì)真菌毒素的檢測(cè)進(jìn)行一一闡述。

2.1.1 比色側(cè)流層析試紙條

基于顏色變化的比色LFSs是LFSs的重要組成部分，因其制作成本低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快且不需要昂貴的檢測(cè)儀器而引起了研究者的廣泛興趣。比色LFSs可以根據(jù)其檢測(cè)線顏色的變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的可視化檢測(cè)，因此在真菌毒素分析領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1.1.1 納米金標(biāo)記側(cè)流層析試紙條

AuNPs具有合成技術(shù)簡(jiǎn)單、在多孔膜中的遷移率好、顏色鮮艷等優(yōu)點(diǎn)，在LFSs領(lǐng)域備受青睞。AuNPs在LFSs上大量聚集時(shí)會(huì)產(chǎn)生紅色或粉色的斑點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定性或半定量的檢測(cè)，被廣泛地應(yīng)用于真菌毒素的檢測(cè)中。Hu Shurong等首次采用AuNPs標(biāo)記的免疫LFSs用于根莖藥材中AFB的快速檢測(cè)。該方法采用AFB-BSA標(biāo)記試紙條的檢測(cè)線，二抗標(biāo)記控制線。當(dāng)陰性樣品溶液滴在樣品墊上時(shí)，通過毛細(xì)管力將AuNPs標(biāo)記的抗體復(fù)合物重新溶解在樣品溶液中，隨后該混合物遷移到檢測(cè)線和控制線。檢測(cè)線的AFB-BSA和控制線的二抗均能捕獲AuNPs標(biāo)記的抗體復(fù)合物，使AuNPs在試紙條的檢測(cè)線和控制線聚集，檢測(cè)線和控制線均顯色；而當(dāng)陽性樣品溶液滴在樣品墊上時(shí)，樣品溶液中AFB和檢測(cè)線上的AFB-BSA相競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致試紙條上檢測(cè)線顏色變淺，只在控制線上表現(xiàn)出明亮的顏色。試紙條上控制線的設(shè)置是為了確保試紙條的有效性。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，所構(gòu)建的免疫LFSs對(duì)AFB的檢出限低至0.1 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需15 min。盡管中藥基質(zhì)具有復(fù)雜性，但該方法仍以簡(jiǎn)單的程序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)藥材根莖中AFB的高選擇性、高靈敏性的快速檢測(cè)?；谙嗨频脑?，Anfossi等建立了基于AuNPs標(biāo)記的LFSs實(shí)現(xiàn)了葡萄酒和葡萄汁中OTA的快速檢測(cè)（5 min），檢測(cè)靈敏度為1 ng/mL。由于食品中真菌毒素的含量極低，為了提高AuNPs標(biāo)記的LFSs靈敏度，其通過引入了“金標(biāo)銀染”信號(hào)放大技術(shù)對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大。“金標(biāo)銀染”放大技術(shù)的基本原理為利用還原劑將銀離子還原并沉積在AuNPs的表面，形成一層銀外殼。由于銀具有較高的摩爾吸光系數(shù)，因此“金標(biāo)銀染”能顯著放大檢測(cè)信號(hào)，將該方法的靈敏度提高了10余倍。

基于先前的闡述，適配體相較于抗體具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、易于標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，因此科研工作者研究了以適配體為識(shí)別元件的LFSs對(duì)真菌毒素的檢測(cè)性能。例如，Zhou Weilu等開發(fā)了一種基于適配體的LFSs，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃芪中OTA的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在最佳條件下，所開發(fā)的LFSs對(duì)OTA的檢出限是1 ng/mL，且與幾種同源毒素沒有顯著的交叉反應(yīng)，整個(gè)檢測(cè)過程可在15 min內(nèi)完成。以上結(jié)果表明在LFSs開發(fā)方面，適配體具有與抗體相比擬的檢測(cè)靈敏度。此外，Wu Shijia等也采用適配體為識(shí)別元件，研制了檢測(cè)ZEN的LFSs，對(duì)ZEN的檢測(cè)范圍為5～200 ng/mL，檢出限為20 ng/mL。

值得注意的是，由于農(nóng)產(chǎn)品及食品往往同時(shí)受到多種真菌毒素的污染，當(dāng)用傳統(tǒng)檢測(cè)裝置對(duì)單一目標(biāo)物逐一檢測(cè)時(shí)，在增加時(shí)間成本同時(shí)也會(huì)增加經(jīng)濟(jì)成本。因此開發(fā)簡(jiǎn)單、快捷且可以同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的裝置顯得尤為重要。Zhang Xian等則研制出可同時(shí)定量檢測(cè)玉米、小麥和飼料樣品中OTA和ZEN的LFSs。該免疫LFSs對(duì)OTA的檢出限為0.32 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.53～12.16 ng/mL；對(duì)ZEN的檢出限為0.58 ng/mL，檢測(cè)范圍為1.06～39.72 ng/mL。隨后，Hou Silu等報(bào)道了一種基于25 nm AuNPs的多重免疫層析法，可同時(shí)定性檢測(cè)小麥和玉米樣品中的伏馬毒素B、DON和ZEN。該免疫LFSs具有較高的靈敏度，對(duì)伏馬毒素B、DON和ZEN的檢出限分別為60.0、12.5、6.0 ng/mL，且檢測(cè)結(jié)果與LC-MS檢測(cè)結(jié)果一致。

2.1.1.2 多色納米粒子標(biāo)記側(cè)流層析試紙條

雖然上述基于AuNPs的免疫層析法可實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的高靈敏和快速檢測(cè)，但由于同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素時(shí)，因其不同條帶表現(xiàn)相同的顏色，極易因?yàn)橐曈X干擾導(dǎo)致最終結(jié)果讀出錯(cuò)誤。因此，開發(fā)避免視覺干擾的免疫LFSs十分重要。例如，一些研究者通過增加測(cè)試線之間的距離來避免視覺的干擾，但是提高了膜的成本和延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。為了更好地解決這一問題，di Nardo等研制了一種基于藍(lán)色沙漠玫瑰狀A(yù)uNPs和紅色球形AuNPs的多色免疫LFSs實(shí)現(xiàn)了對(duì)小麥粉中AFB、伏馬毒素的同時(shí)檢測(cè)。AFB和伏馬毒素的檢出限分別是2 μg/kg和1 000 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間為10 min。此外，Xu Lin等開發(fā)了一種多色免疫LFSs實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米和谷類動(dòng)物飼料中AFB、ZEN和T-2毒素的同時(shí)測(cè)定。他們將以上3種毒素的mAb分別標(biāo)記綠色、藍(lán)色和紅色的羧基改性納米顆粒，得到信號(hào)探針。AFB、ZEN和T-2檢出限分別是0.5、2.0、30.0 ng/mL；檢測(cè)速度快，僅需20 min便可完成以上3種真菌毒素的分析，且該多色納米粒子標(biāo)記的LFSs具有較強(qiáng)特異性和較高穩(wěn)定性，在真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有巨大的應(yīng)用前景。

2.1.2 熒光側(cè)流層析試紙條

熒光LFSs離不開熒光標(biāo)記物質(zhì)的合理選擇。具有熒光特性的物質(zhì)是指一類在受到外界特定波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，吸收能量后電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，電子在返回基態(tài)時(shí)釋放出光子，產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。熒光物質(zhì)主要包括有機(jī)熒光染料和無機(jī)納米粒子。在眾多有機(jī)熒光染料中，屬于水溶性3-吲哚菁型生物熒光標(biāo)示染料的Cy5，易于與抗體進(jìn)行偶聯(lián)，并且具有較好的熒光強(qiáng)度，因而常用于熒光LFSs的開發(fā)中。例如，Zhu Chao等將Cy5標(biāo)記在AFB適配體上，檢測(cè)線和控制線分別標(biāo)記AFB和適配體的互補(bǔ)鏈，通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理，實(shí)現(xiàn)了AFB的高靈敏檢測(cè)，檢出限低至0.1 ng/mL。該Cy5標(biāo)記的熒光LFSs在11種食物和飼料樣本的AFB分析中表現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性。然而，由于Cy5為有機(jī)熒光染料，其具有熒光穩(wěn)定較差、易于被光漂白的缺點(diǎn)，不適宜于長(zhǎng)時(shí)間觀察檢測(cè)結(jié)果。量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）作為一種新型的熒光納米材料，與有機(jī)熒光染料相比，QDs具有較寬的激發(fā)光譜、較窄的發(fā)射光譜、一元激發(fā)多元發(fā)射、較高的熒光穩(wěn)定性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在熒光LFSs的構(gòu)建中具有較大的應(yīng)用潛力。例如，Wang Libing等首次提出了一種基于適配體修飾QDs的熒光LFSs。該熒光LFSs通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)OTA的檢測(cè)。當(dāng)樣品溶液中不存在OTA時(shí)，QDs標(biāo)記的適配體與測(cè)試線上標(biāo)記的DNA探針1雜交，測(cè)試線上顯示較強(qiáng)的熒光信號(hào)；當(dāng)樣品溶液中存在OTA時(shí)，OTA與QDs標(biāo)記的適配體結(jié)合，測(cè)試線上的熒光信號(hào)減弱，基于測(cè)試線上熒光信號(hào)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)了樣品中OTA質(zhì)量濃度的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)得到OTA檢出限為1.9 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需10 min。上轉(zhuǎn)換納米粒子（upconversion nanoparticle，UCNP）作為一類新型的熒光納米材料，與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料和QDs不同之處在于其具有反斯托克斯（Stocks）的發(fā)光特性。具體而言，UCNP具有長(zhǎng)波激發(fā)、短波發(fā)射的特點(diǎn)，因而在生物傳感領(lǐng)域可克服樣品或基質(zhì)自發(fā)熒光的缺點(diǎn)，使得背景熒光信號(hào)顯著降低，進(jìn)而提高了檢測(cè)的靈敏度，是當(dāng)前熒光生物傳感器領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究材料。例如，Wu Shijia等將UCNP與適配體相結(jié)合建立了用于OTA檢測(cè)的熒光LFSs。在該方法中，研究者先合成了羧基修飾的UCNP，再通過化學(xué)鍵合與氨基修飾的OTA適配體連接，形成信號(hào)探針。當(dāng)樣品中沒有OTA時(shí)，信號(hào)探針將與標(biāo)記在測(cè)試線上的OTA適配體互補(bǔ)DNA雜交，過量的探針與標(biāo)記在控制線上的聚腺苷酸進(jìn)行雜交。在980 nm激光激發(fā)下，控制線和測(cè)試線上均觀察到綠色熒光信號(hào)；當(dāng)樣品中含有OTA時(shí)，OTA首先會(huì)與信號(hào)探針上適配體結(jié)合，結(jié)合產(chǎn)物沿硝化纖維素膜移動(dòng)到達(dá)測(cè)試線時(shí)，信號(hào)探針和標(biāo)記在測(cè)試線上的OTA適配體互補(bǔ)DNA的結(jié)合被削弱，但是該結(jié)合產(chǎn)物仍會(huì)與控制線上的聚腺苷酸堿基進(jìn)行雜交反應(yīng)。因此，在980 nm激光激發(fā)下，測(cè)試線上觀察到綠色熒光信號(hào)減弱，控制線上綠色熒光信號(hào)變化不大。最后用分析軟件測(cè)量?jī)蓷l線的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該LFSs可在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)OTA的高靈敏檢測(cè)，線性范圍為5～100 ng/mL，檢出限為1.86 ng/mL。

2.1.3 磁信號(hào)側(cè)流層析試紙條

磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）主要包括四氧化三鐵納米粒子、三氧化二鐵納米粒子和鎳納米復(fù)合材料等。MNPs具有合成簡(jiǎn)便、生物安全性高、獨(dú)特的磁性能使其在生物傳感領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。MNPs在靶分子的檢測(cè)過程中可去除各種非目標(biāo)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)靶分子的分離和富集，減少基質(zhì)干擾，放大檢測(cè)信號(hào)。此外，基于MNPs磁信號(hào)變化的檢測(cè)技術(shù)，與光學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如，生物樣品幾乎不表現(xiàn)出磁性能，因此基于磁信號(hào)的檢測(cè)背景信號(hào)干擾小，使其在檢測(cè)食品基質(zhì)的真菌毒素時(shí)無需進(jìn)行復(fù)雜的前處理步驟便可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。此外，MNPs的磁信號(hào)穩(wěn)定性好，不會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生顯著的變化，方便對(duì)檢測(cè)結(jié)果隨時(shí)復(fù)查。Liu Daofeng等研發(fā)了一種改良的LFSs（兩步法）用于原乳中的AFM的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的LFSs相比，該LFSs使用了兩種免疫磁性納米粒子（immunoma-gnetic nanoparticles，IMNPs），分別偶聯(lián)了高抗體濃度的IMNPs用以捕獲試驗(yàn)樣品中的AFM、低抗體濃度的IMNPs用以AFM檢測(cè)信號(hào)的獲取。該LFSs對(duì)AFM的檢出限為0.02 mg/L，與傳統(tǒng)的LFSs相比較，靈敏度提高了25 倍。Guo Liang等將十八烷胺涂層的硒化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)和油酸改性氧化鐵納米顆粒封裝成兩個(gè)具有不同疏水性能的復(fù)合材料，合成了具有獨(dú)特核/殼結(jié)構(gòu)的雙功能的MNPs。在最佳檢測(cè)條件下，該方法線性范圍為5～150 pg/mL。在醬汁提取物和黑醬油中所得到的檢出限分別為3 pg/mL和49 pg/mL。

2.2 基于個(gè)人血糖儀的便攜式生物傳感器

PGM是一種測(cè)量血糖水平的電子儀器，因其便于攜帶、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果直觀且準(zhǔn)確而被廣泛應(yīng)用于家庭健康實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中。Yu Xiang等創(chuàng)新性地以蔗糖酶為紐帶，將PGM用于非葡萄糖分子的檢測(cè)中，研究結(jié)果發(fā)表在雜志上。受到該研究的啟發(fā)，以PGM為檢測(cè)器件的真菌毒素便攜式傳感器的研究陸續(xù)展開。為實(shí)現(xiàn)真菌毒素與葡萄糖分子的關(guān)聯(lián)，從而最終實(shí)現(xiàn)PGM對(duì)真菌毒素的檢測(cè)，目前的信號(hào)傳導(dǎo)方式主要有兩種：一種是基于酶介導(dǎo)葡萄糖生成的信號(hào)傳導(dǎo)方式，另一種是基于靶標(biāo)誘導(dǎo)葡萄糖釋放的信號(hào)傳導(dǎo)方式。

2.2.1 基于酶介導(dǎo)葡萄糖生成的信號(hào)傳導(dǎo)方式

Yu Xiang等利用PGM構(gòu)建了用于OTA定量檢測(cè)的便攜式生物傳感器。在該項(xiàng)研究中他們使用競(jìng)爭(zhēng)法定量檢測(cè)OTA。具體方法為制備OTA的mAb修飾的MNPs（MNPs-mAb）、DNA修飾的OTA（OTA-DNA）以及轉(zhuǎn)化酶修飾的DNA互補(bǔ)鏈（轉(zhuǎn)化酶-cDNA）用于OTA的檢測(cè)。當(dāng)樣品液中不含OTA時(shí)，OTA-DNA與MNPs-mAb結(jié)合，加入轉(zhuǎn)化酶-cDNA后，DNA與cDNA雜交，使得轉(zhuǎn)化酶被MNPs捕獲，加入蔗糖后，溶液中產(chǎn)生大量的葡萄糖，PGM檢測(cè)出的信號(hào)值大；當(dāng)樣品液中含有OTA時(shí)，OTA相較于OTA-DNA與MNPs-mAb的結(jié)合力更強(qiáng)，此時(shí)加入轉(zhuǎn)化酶-cDNA，轉(zhuǎn)化酶無法被MNPs捕獲，最終使得PGM檢測(cè)出的信號(hào)值小。在該工作中，以轉(zhuǎn)化酶為紐帶，通過樣品中OTA質(zhì)量濃度與PGM測(cè)定的葡萄糖濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了OTA的定量檢測(cè)，最終得到OTA檢出限為6.8 ng/mL。上述方法需將DNA修飾在OTA上，以便與食品中的OTA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mAb，這無疑增加了檢測(cè)成本以及操作難度。OTA適配體本質(zhì)上是一段DNA序列，因此以適配體為識(shí)別元件時(shí)則無需制備OTA-DNA，更易于構(gòu)建基于PGM的便攜式傳感器實(shí)現(xiàn)OTA的檢測(cè)。例如，Long Feng等使用適配體為識(shí)別元件，構(gòu)建了一種基于PGM的便攜式傳感器用于OTA檢測(cè)。具體方法為：首先，通過簡(jiǎn)單的親和素-生物素反應(yīng)制得了MNPs-適配體；其次，將轉(zhuǎn)化酶修飾連接在與適配體部分互補(bǔ)的DNA鏈上，得到轉(zhuǎn)化酶-cDNA。當(dāng)OTA不存在時(shí)，MNPs-適配體與轉(zhuǎn)化酶-cDNA結(jié)合，磁分離后上清液中無轉(zhuǎn)化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖無法水解產(chǎn)生葡萄糖，用PGM檢測(cè)時(shí)所得信號(hào)值低；當(dāng)OTA存在時(shí)，OTA與其適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化酶-cDNA從雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中解離，磁分離后，上清液中存在大量的轉(zhuǎn)化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖水解產(chǎn)生大量葡萄糖，用PGM進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所得信號(hào)值高。利用該便攜式傳感器對(duì)緩沖液和紅酒中的OTA進(jìn)行檢測(cè)，檢出限分別為3.31 μg/L和3.66 μg/L。

由于食品中真菌毒素的含量極低，研究者們將基于分子機(jī)器的信號(hào)放大技術(shù)用于構(gòu)建超敏便攜式傳感器，以實(shí)現(xiàn)食品基質(zhì)中痕量真菌毒素的檢測(cè)。DNA步行者傳感器包含軌道DNA鏈和步行DNA鏈，通常情況下研究者們將軌道DNA鏈固定于電極或納米材料上，步行DNA鏈的運(yùn)動(dòng)需要在在酶催化和鏈雜交反應(yīng)驅(qū)動(dòng)下才能進(jìn)行。步行DNA鏈一旦被激活，DNA步行者分子機(jī)器就可以重復(fù)機(jī)械周期，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。DNA步行者具有可預(yù)測(cè)、快速的可編程特性，已被應(yīng)用于不同的目標(biāo)生物傳感器的開發(fā)。Yang Xinsheng等構(gòu)建了基于脫氧核酶驅(qū)動(dòng)的DNA步行者分子機(jī)器，用于AFB的高靈敏檢測(cè)。該方法的具體原理是在軌道DNA鏈上設(shè)計(jì)脫氧核酶的底物序列，并在其一端修飾蔗糖酶，一端修飾巰基，通過金硫鍵的相互作用將軌道DNA鏈固定在電極表面，此外步行DNA鏈上設(shè)計(jì)了脫氧核酶的酶序列。無AFB存在時(shí)，AFB的適配體與軌道DNA鏈上的底物鏈互補(bǔ)配對(duì)，使得步行DNA鏈上的酶鏈無法與軌道DNA鏈上的底物鏈結(jié)合，致使DNA步行者分子機(jī)器無法啟動(dòng)；AFB存在時(shí)，AFB與其適配體特異性結(jié)合，脫離了金電極表面，此時(shí)加入步行DNA鏈，步行DNA鏈上的酶鏈與軌道DNA鏈上的底物鏈結(jié)合，在鉛離子輔助下，將軌道DNA鏈上的底物鏈切成兩段，從金電極表面釋放出軌道鏈上的蔗糖酶和步行DNA鏈。隨著步行DNA鏈在軌道鏈上的持續(xù)行走，大量的蔗糖酶被釋放。通過收集釋放的蔗糖酶，溶液中的蔗糖被蔗糖酶轉(zhuǎn)化成葡萄糖，最后通過PGM進(jìn)行檢測(cè)信號(hào)的讀取。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，該方法對(duì)面包中AFB的檢出限低至10 pmol/L。

2.2.2 基于靶標(biāo)誘導(dǎo)葡萄糖釋放的信號(hào)傳導(dǎo)方式

除了上文中所介紹的基于酶介導(dǎo)葡萄糖生成的信號(hào)傳導(dǎo)方式以外，還有基于靶標(biāo)誘導(dǎo)葡萄糖釋放的信號(hào)傳導(dǎo)方式。如Tang Dianping等制備了聚乙烯亞胺包覆的介孔二氧化硅納米容器（polyethylenimine-coated mesoporous silica nanocontainers，PEI-MSN）和AFB的mAb標(biāo)記的AuNPs（mAb-AuNPs），用于構(gòu)建均相免疫檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)了PGM對(duì)AFB快速、高靈敏在線檢測(cè)。該方法的具體原理是PEI-MSN可將大量的葡萄糖分子裝載進(jìn)入其孔道中，由于mAb-AuNPs與PEI-MSN帶有相反的電荷，它們之間的靜電作用可使mAb-AuNPs作為“門”以避免葡萄糖分子從PEI-MSN中逃逸出來；在AFB存在下，由于mAb與AFB的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其與PEI-MSN的親和力，從而導(dǎo)致mAb-AuNPs從PEI-MSN表面脫落，最終導(dǎo)致葡萄糖從孔道里釋放出來，利用PGM對(duì)釋放出來的葡萄糖進(jìn)行信號(hào)讀取，可實(shí)現(xiàn)AFB的高靈敏檢測(cè)，檢出限為5 ng/kg。

2.3 基于溫度計(jì)的便攜式生物傳感器

受到前文描述的將PGM應(yīng)用于非葡萄糖分子現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的啟發(fā)，科研工作者將越來越多的其他類型的小型化商用儀器作為信號(hào)讀取設(shè)備，只需建立適當(dāng)?shù)男盘?hào)傳導(dǎo)方式，便可實(shí)現(xiàn)靶分子的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在眾多小型化商用儀器中，溫度計(jì)在我們的日常生活中使用最為廣泛，是人們普遍會(huì)使用的小型儀器。并且，相較于血糖儀，溫度計(jì)的價(jià)格也更低廉。因此，溫度計(jì)可以用于構(gòu)建便攜式生物傳感器，用于農(nóng)藥殘留、真菌毒素、生物小分子等的檢測(cè)中。

由于真菌毒素分子質(zhì)量較小，采用傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)法對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)往往采用競(jìng)爭(zhēng)免疫法。在競(jìng)爭(zhēng)免疫法中，通常需要制備包被抗原或者抗原修飾的信號(hào)探針，以便和待測(cè)樣品中的游離抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其mAb，最終實(shí)現(xiàn)靶分子的檢測(cè)。需要注意的是，制備包被抗原或者抗原修飾的信號(hào)探針時(shí)，需要消耗大量的抗原，且在分離純化的過程中使得抗原進(jìn)入到環(huán)境中。由于真菌毒素作為抗原，其具有較大的毒性，因此采用該方法會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，也會(huì)對(duì)研究人員造成危害。為了克服這一問題，Chen Yanjie等創(chuàng)新性地通過噬菌體展示技術(shù)獲得ZEN的模擬表位肽，并在該模擬表位肽上修飾具有良好光熱性能的螺旋碳納米管作為信號(hào)探針（peptides@HN-HCNTs）。ZEN與peptides@HNHCNTs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相載體上的mAb，導(dǎo)致近紅外激光照射下的溫度升高量與ZEN的濃度成反比。該方法可成功應(yīng)用于谷物中ZEN的便攜式檢測(cè)，線性檢測(cè)范圍為10～10ng/mL，檢出限為1.06h10ng/mL。

2.4 基于pH計(jì)的便攜式生物傳感器

pH計(jì)是用來檢測(cè)溶液酸堿度的電子器件，可以準(zhǔn)確地測(cè)定溶液的pH值，作為易攜帶、操作簡(jiǎn)便、成本低和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可量化的儀器，在構(gòu)建生物傳感器中得到了廣泛的應(yīng)用。目前，研究者們已經(jīng)構(gòu)建了以pH計(jì)為讀出裝置的生物傳感器來檢測(cè)細(xì)菌、DNA、真菌毒素等不同類型的靶標(biāo)物。例如，Wang Lixu等將AFB標(biāo)記在脲酶上（AFB-脲酶），采用競(jìng)爭(zhēng)免疫法實(shí)現(xiàn)了pH計(jì)對(duì)AFB的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)。具體方法為：首先將AFB的mAb修飾在MNPs上，獲得用于AFB檢測(cè)的IMNPs。無AFB存在時(shí)，IMNPs與AFB-脲酶結(jié)合，加入尿素，脲酶催化尿素水解，導(dǎo)致溶液pH值升高；當(dāng)AFB存在時(shí)，IMNPs與AFB的結(jié)合能力強(qiáng)于與AFB-脲酶的結(jié)合能力，此時(shí)，IMNPs無法捕獲脲酶，加入尿素后，尿素?zé)o法被水解，導(dǎo)致溶液pH值不發(fā)生變化。AFB在0.62～23.42 ng/L范圍內(nèi)，pH值與AFB質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。該便攜式生物傳感器可以用于食品基質(zhì)中AFB高靈敏度、高選擇性檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用前景。需要注意的是使用該方法對(duì)AFB進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需進(jìn)行多次分離、洗滌步驟，導(dǎo)致操作過程比較繁復(fù)。該方法屬于非均相檢測(cè)，而均相檢測(cè)不需要進(jìn)行分離和洗滌的步驟，因此操作簡(jiǎn)便更適宜于現(xiàn)場(chǎng)分析。

DNA水凝膠是一種三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物，由兩條聚丙烯酰胺-DNA鏈和一條核酸適配體組成，其腔體可裝載酶分子以及納米粒子。當(dāng)靶標(biāo)物存在時(shí)，靶標(biāo)物與其適配體特異性結(jié)合導(dǎo)致適配體發(fā)生構(gòu)象變化，誘導(dǎo)DNA水凝膠瓦解，從而釋放出包被的酶分子或納米粒子，最終實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)物的均相檢測(cè)。例如，Zhao Mengmeng等制備可用于AFB檢測(cè)的DNA水凝膠，并將脲酶包裹在DNA水凝膠中。加入包含AFB的樣品溶液后，AFB與其適配體結(jié)合，導(dǎo)致DNA水凝膠瓦解，致使脲酶被釋放到溶液中，釋放的脲酶催化尿素水解，導(dǎo)致溶液pH值升高，通過pH計(jì)對(duì)溶液pH值的測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)AFB的便攜式檢測(cè)，該方法對(duì)AFB的檢出限為0.1 μmol/L。

2.5 基于手持氣壓計(jì)的便攜式生物傳感器

壓力的測(cè)量已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種檢測(cè)領(lǐng)域當(dāng)中。在封閉的器皿中，氣體的生成可使壓力增加。通過將分子識(shí)別轉(zhuǎn)化為密閉器皿中氣體的生成，便可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測(cè)及含量的推算。

Zhang Weiqi等利用競(jìng)爭(zhēng)免疫法實(shí)現(xiàn)了便攜式氣壓計(jì)對(duì)AFB的高靈敏檢測(cè)。具體方法為：首先將AFB的包被抗原AFB-BSA吸附在微孔板底部，再同時(shí)加入樣品提取液和AFB的mAb。當(dāng)樣品液中不含有AFB時(shí)，mAb與微孔板上的包被抗原特異性結(jié)合，接著加入二抗標(biāo)記的金-鉑核殼納米粒子（Au@PtNPs-IgG），Au@PtNPs-IgG與mAb特異性結(jié)合，由于Au@PtNPs具有過氧化氫酶活性，在該體系中加入HO后，HO被Au@PtNPs催化分解產(chǎn)生O，利用手持式氣壓計(jì)記錄體系的壓力，得到較高的壓力信號(hào)；當(dāng)樣品液中含有AFB時(shí)，mAb與AFB的結(jié)合能力強(qiáng)于其與AFB-BSA的結(jié)合能力，此時(shí)，微孔板無法捕獲Au@PtNPs-IgG，加入HO后，HO無法被分解，導(dǎo)致檢測(cè)體系無壓力信號(hào)的增大。該研究中，氣壓計(jì)的信號(hào)值與AFB質(zhì)量濃度成反比。在最優(yōu)條件下，AFB線性范圍為0.09～16.0 ng/mL，且其檢出限為0.03 ng/mL。

2.6 基于智能手機(jī)的便攜式生物傳感器

當(dāng)今社會(huì)，因?yàn)橹悄苁謾C(jī)的普遍存在且便于攜帶，研究者們將智能手機(jī)也運(yùn)用到了生物傳感器的構(gòu)建當(dāng)中。Jin Birui等開發(fā)了一種新的LFSs，用于同時(shí)檢測(cè)水樣中的Hg、OTA、沙門氏菌。具體方法為：首先合成具有紅、綠、藍(lán)發(fā)射峰的UCNPs，作為產(chǎn)生熒光信號(hào)的檢測(cè)探針；其次將不同的UCNPs分別修飾在不同目標(biāo)物的適配體上裝載于樣品墊上，將不同目標(biāo)物的適配體互補(bǔ)鏈固定在3 條檢測(cè)線上。向樣品墊上加入樣品，若樣品中沒有目標(biāo)物時(shí)，UCNPs修飾的適配體與測(cè)試線上互補(bǔ)鏈結(jié)合，將LFSs插入便攜式閱讀器，智能手機(jī)上軟件所顯示的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度強(qiáng)；相反，智能手機(jī)上軟件所顯示的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度弱。該生物傳感器使我們能夠使用LFSs同時(shí)檢測(cè)和量化多個(gè)目標(biāo)，最終從智能手機(jī)上所顯現(xiàn)的相應(yīng)色帶的顏色強(qiáng)度得出結(jié)果。該方法可在30 min內(nèi)完成檢測(cè)，其中對(duì)OTA的檢出限為3 ng/mL。

2.7 基于微流控芯片的便攜式生物傳感器

在眾多的便攜式生物傳感器構(gòu)建當(dāng)中，微流控芯片也是近些年來備受親睞的便攜式檢測(cè)的理想工具。微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過程的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，是檢測(cè)細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物樣品重要手段，具有方便快捷、靈敏且成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于便攜式快速檢測(cè)中。

Ma Yanli等利用DNA水凝膠和微流控芯片構(gòu)建了便攜式生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB的檢測(cè)。具體方法為：用兩條聚丙烯酰胺-DNA鏈和AFB適配體構(gòu)建成DNA水凝膠，在其腔體裝載PtNPs。加入含有AFB的樣品液后，AFB與適配體特異性結(jié)合使適配體構(gòu)象變化，導(dǎo)致水凝膠迅速瓦解，釋放出PtNPs，將上清液加入到微流控芯片中，PtNPs催化HO分解生成O，通過氣體驅(qū)動(dòng)芯片中的紅色墨水移動(dòng)，通過測(cè)量紅色墨水移動(dòng)的距離計(jì)算出樣品中AFB的濃度。用該方法對(duì)啤酒中AFB進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為1.77 nmol/L。

2.8 其他便攜式生物傳感器

除了上述所提到的LFSs、PGM、pH計(jì)和微流控芯片等以外，研究者們還用到了其他設(shè)備對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。

便攜式阻抗探測(cè)器也受到了研究人員的關(guān)注，因其體積較小、便于攜帶、結(jié)果讀出快捷方便被用來構(gòu)建生物傳感器以實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的檢測(cè)。Goud等設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)阻抗探測(cè)器傳感器用于檢測(cè)AFB。該檢測(cè)是以絲網(wǎng)印刷碳電極（screen printed carbon electrodes，SPCEs）為基底進(jìn)行的，通過重氮鹽共價(jià)結(jié)合將AFB的適配體固定在電極表面，AFB與適配體結(jié)合導(dǎo)致阻抗發(fā)生變化，最后通過阻抗探測(cè)器結(jié)果變化進(jìn)而判定AFB的質(zhì)量濃度。同時(shí)在該研究中，研究人員還對(duì)兩個(gè)適配體序列（seq A和seq B）的分析性能進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，使用seq A和seq B對(duì)AFB的檢出限分別為0.12 ng/mL和0.25 ng/mL。研究者們?yōu)閷?shí)現(xiàn)更快捷、方便的檢測(cè)，通過3D打印技術(shù)將電極制成USB兼容傳感器。Li Zhanming等提出了一種基于絲網(wǎng)印刷交錯(cuò)微電極（screenprinted interdigitated microelectrodes，SPIMs）和阻抗探測(cè)器相結(jié)合的電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻中AFB低成本、高選擇、高靈敏度檢測(cè)。采用3D打印技術(shù)制成USB兼容傳感器，在該USB傳感器內(nèi)部設(shè)計(jì)有一凹槽，凹槽中放置SPIMs，并在其表面修飾AFB的mAb，最后用BSA對(duì)其進(jìn)行封閉。AFB與mAb的結(jié)合將導(dǎo)致阻抗發(fā)生變化，在檢測(cè)中將該USB兼容傳感器與阻抗探測(cè)器相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)樣品中的AFB便攜式檢測(cè)，在最佳條件下，該方法對(duì)AFB的檢出限為5 ng/mL，總檢測(cè)時(shí)間小于1 h。

光電化學(xué)生物傳感器由于獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)得到了廣泛的研究和應(yīng)用。但是電化學(xué)工作站和光源的需求限制了便攜式光電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展。Hao Nan等開發(fā)了一種便攜式太陽能驅(qū)動(dòng)的光電化學(xué)可視化生物傳感器用于檢測(cè)玉米汁中OTA，該生物傳感器是在一個(gè)小的銦錫氧化物電極上制作的，它分為兩個(gè)模塊，一個(gè)是檢測(cè)模塊，另一個(gè)是參考模塊，每個(gè)模塊由兩個(gè)區(qū)域組成，分別為光電傳感區(qū)域和視覺區(qū)域。光電傳感區(qū)域采用三維石墨烯水凝膠納米復(fù)合材料構(gòu)建，視覺區(qū)域采用電致變色材料普魯士藍(lán)構(gòu)建。當(dāng)OTA質(zhì)量濃度變化時(shí)將導(dǎo)致電子遷移量變化從而引起視覺區(qū)域顏色變化，通過這兩個(gè)模塊上的視覺區(qū)域的色度比得到檢測(cè)物的質(zhì)量濃度。線性檢出范圍為1～500 ng/mL，檢出限為0.29 ng/mL。該傳感器由于其高精度和便攜性，將為生物分析、食品檢測(cè)等領(lǐng)域的研究帶來光明的前景。

Joshi等構(gòu)建了一種利用便攜式表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器，對(duì)啤酒中DON和OTA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定。SPR即為一種光入射金屬表面產(chǎn)生的物理光電現(xiàn)象，通過測(cè)折射率進(jìn)而判定目標(biāo)物含量的技術(shù)。應(yīng)用該方法對(duì)啤酒中DON、OTA進(jìn)行檢測(cè)，得出DON檢出限為17 ng/mL，OTA的檢出限為7 ng/mL（或濃縮75 倍后OTA檢出限為0.09 ng/mL）。該方法可用于啤酒中DON現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，無需預(yù)濃縮；而啤酒中的OTA則需要額外的富集步驟，該方法不太適用于OTA的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

表3整理了上述基于便攜式生物傳感器的毒素檢測(cè)方法。

表3 基于便攜式生物傳感器的毒素檢測(cè)方法Table 3 Mycotoxin detection method based on portable biosensor

3 結(jié) 語

真菌毒素的廣泛存在使食品安全問題頻發(fā)。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測(cè)方法大多需要大型儀器設(shè)備、專業(yè)人員和成本偏高的材料，這些因素極大地限制了這些檢測(cè)方法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的推廣使用。因此開發(fā)操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏且可用于即時(shí)檢測(cè)真菌毒素的便攜式生物傳感器十分重要。便攜式生物傳感器的構(gòu)建是現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)的必然趨勢(shì)。

目前不斷出現(xiàn)的便攜式生物傳感器在檢測(cè)真菌毒素方面取得了很好的成就，但是仍存在一些問題，有待進(jìn)一步的完善：1）在食品當(dāng)中往往會(huì)存在有兩種或多種真菌毒素，在檢測(cè)不同真菌毒素時(shí)，會(huì)因檢測(cè)所需條件的差異而導(dǎo)致檢測(cè)程序復(fù)雜化，因此開發(fā)多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的生物傳感器很有必要；2）食品基質(zhì)復(fù)雜，在真菌毒素的檢測(cè)當(dāng)中會(huì)帶來影響，因此，需要進(jìn)一步提高這些傳感器的抗干擾能力。

未來的便攜式檢測(cè)儀器將往更靈敏、抗干擾能力更強(qiáng)、質(zhì)量輕、功能豐富、電池工作時(shí)間長(zhǎng)、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方便、價(jià)格便宜、有防撞防水外殼、在戶外顯示清晰的方向發(fā)展，以滿足實(shí)際生活中對(duì)樣品即時(shí)檢測(cè)的需要?？傊瑥V大研究者們需要拓寬思維，實(shí)現(xiàn)多學(xué)科的結(jié)合，從而構(gòu)建出操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、抗干擾的便攜式生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。