劉英敏，陳 飛，年 薇，范志勤

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院日間手術(shù)病房，烏魯木齊 830011）

食管癌是常見的上消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國食管癌的發(fā)病率為32.4/10 萬，其中90%以上為食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）[1]，食管鱗癌的發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、診治手段有限導(dǎo)致患者預(yù)后不良，5 年生存率約為15%～20%[2]。正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)的改變，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力。相關(guān)研究表明賴氨酰氧化酶樣蛋白2（Lysyl oxidase like 2，LOXL2）作為銅依賴性氨基氧化酶家族成員之一，可通過催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的賴氨酸殘基分子交聯(lián)，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為轉(zhuǎn)化過程[3]。I 型膠原蛋白α1 鏈(Collagen type I alpha 1，COL1A1)是原癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移[4]。Wei 等[5]研究發(fā)現(xiàn)LOXL2 在結(jié)腸惡性腫瘤呈高表達(dá)，可通過促進(jìn)膠原蛋白交聯(lián)和細(xì)胞外基質(zhì)硬化，使腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。但LOXL2 和COL1A1 在食管鱗癌中的表達(dá)及作用尚不完全明確。本研究采用qRT-PCR 檢測LOXL2和COL1A1在食管鱗癌中的表達(dá)水平，分析兩者表達(dá)相關(guān)性及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，初步探索兩者在食管鱗癌患者病情進(jìn)展中的作用，為食管鱗癌患者的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2019 年9 月-12 月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的45 例食管鱗癌患者為研究組，其中男性28例，女性17例，年齡45～71歲，中位年齡59歲。腫瘤直徑<5 cm 者33 例，腫瘤直徑≥5 cm 者12例；腫瘤組織高分化10 例，中分化23 例，低分化12例；有脈管瘤栓15 例，無脈管瘤栓30 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者32 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者13 例。腫瘤臨床分期：I 期5 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期23 例。選取同期3 例健康體檢者作為對照組，其中男性2 例，女性1 例，年齡58～75 歲，中位年齡67 歲。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號：K-2019053），患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)[6]納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次確診食管鱗癌患者，獲取血標(biāo)本及組織標(biāo)本前未行化療、放療等輔助治療；（2）術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌；（3）術(shù)后標(biāo)本切緣距癌組織>5 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性食管鱗癌；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）臨床資料和病理資料不完整。

1.3 樣本采集方法收集45 例食管鱗癌患者術(shù)后的新鮮腫瘤組織標(biāo)本及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距癌組織邊緣>5 cm處的組織），所有組織標(biāo)本術(shù)中離體30 min內(nèi)就地取材，生理鹽水清洗后液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存待檢。收集9 例食管鱗癌患者和3 例健康體檢者靜脈血8 mL，4°C 下，1 500 r/min 離心10 min，收集4 mL血漿，置于-80℃冰箱中保存待檢。

1.4 LOXL2和COL1A1的表達(dá)水平測定

1.4.1 LOXL2 mRNA 和COL1A1 mRNA 的測定 將食管鱗癌及癌旁組織標(biāo)本分別放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮包圍的狀態(tài)下研磨成粉，按照Trizol 試劑盒說明書操作提取組織RNA，用核酸蛋白定量儀檢測RNA 濃度和OD260/280 的比值，瓊脂糖電泳檢測RNA 完整性。經(jīng)檢測在電泳圖中，以28S 與18S 亮度較高，5S 最弱或無條帶，條帶單一、完整且RNA 的OD260/280 的比值在1.8～2.0 之間視為合格RNA 樣本。所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)、合成，以管家基因GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表1。所有樣本的反應(yīng)體系均為20 μL:Ran?dom Primer(0.1 mg/mL) 1 mL，2×TS Reaction Mix 10 mL，TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 mL，gDNA Re?mover 1 mL，用雙蒸餾水補(bǔ)足體系。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃2 min；變性95℃5 s；退火/延伸60℃30 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)均均設(shè)空白對照和標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。采用2-△△Ct 方法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)水平。以計(jì)算出的相對表達(dá)水平均值為界值，將食管鱗癌患者分為LOXL2和COL1A1高表達(dá)組和低表達(dá)組。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.4.2 血漿外泌體LOXL2 蛋白的測定按照外泌體提取試劑盒（凱杰試劑有限公司）說明書操作提取血漿外泌體，在4 mL 血漿中加入1 倍體積的XBP，顛倒混勻5 次。將混合物加入到exoEasy 自旋柱離心管中，500 r/min 離心3 min。加入10 mLXWP 后，2 800 r/min離心7 min，清除殘留緩沖液。將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的收集管上，加入400 μL 緩沖XE 到膜上，孵育3 min，500 r/min離心5 min收集洗脫液。將洗脫液回柱重新加入外易旋轉(zhuǎn)柱膜，孵育3 min，2 800 r/min 離心8 min 收集洗脫液。將分離獲得的外泌體使用1 mL PBS 重懸，密封置于冰上。選擇一次性干凈的樣品池，用無塵紙擦拭確保光路上無顆粒附著外管壁。緩慢注入外泌體溶液，避免產(chǎn)生氣泡，可適度傾斜樣品池，用蓋子封住樣品池。采用Western Blot 試劑盒測定外泌體表面蛋白標(biāo)志物ALIX 和CD63，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白含量。采用SDS-PAGE凝膠電泳法分離總蛋白，將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，PVDF 膜經(jīng)封閉后加入相應(yīng)的ALIX (1:1 000，ab186429;美國abcam) 、CD63 (1:1 000，ab134045;ab?cam)一抗孵育過夜，PBST 緩沖液洗膜后再加入二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1:5 000,ab205718;Abcam)孵育，經(jīng)顯色液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，通過紅外熒光掃描成像檢測蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0 輔助作圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)水平食管鱗癌組織中LOXL2 mRNA 的相對表達(dá)水平（1.719±0.521）高于癌旁組織（1.078±0.305），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.116，P<0.05)。食管鱗癌組織中COL1A1 mRNA 的相對表達(dá)水平（1.476±0.379）高于癌旁組織（1.045±0.306），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.935，P<0.05），見圖1。

圖1 LOXL2mRNA和COL1A1mRNA在食管鱗癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)水平

2.2 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系食管管鱗癌組織中LOXL2mRNA高表達(dá)與腫瘤分化程度（χ2=8.879，P=0.012）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=4.549，P=0.033）、TNM 分期（χ2=7.123，P=0.028）相關(guān)，LOXL2mRNA 表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤大小、脈管癌栓無相關(guān)性。COL1A1mRNA 高表達(dá)與低表達(dá)比較在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=4.874，P=0.047）、TNM 分期（χ2=8.186，P=0.017）上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、脈管癌栓等臨床特征比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 LOXL2mRNA和COL1A1mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鱗癌組織中的相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.728 9，P<0.05），見圖2。

圖2 食管鱗癌組織中LOXL2mRNA和COL1A1mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.4 血漿外泌體LOXL2 蛋白在食管鱗癌組和健康對照組中的表達(dá)水平血漿外泌體提取物呈典型的橢圓形囊泡，包膜完整，未見細(xì)胞碎片，Western Blot 檢測外泌體特異的蛋白標(biāo)志物ALIX 和CD63，結(jié)果顯示血漿外泌體中可見明顯的蛋白標(biāo)志物表達(dá)條帶，見圖3。Nanosight 檢測正常健康體檢者血漿外泌體濃度均值為1.25×109個(gè)/mL，直徑峰值為213.8 nm；食管鱗癌患者血漿外泌體濃度均值為1.86×109個(gè)/mL，直徑峰值為242.3 nm，見圖4。食管鱗癌組的血漿外泌體LOXL2 蛋白表達(dá)水平（0.490±0.097）高于健康對照組血漿外泌體LOXL2 蛋白表達(dá)水平（0.310±0.052），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.005，P<0.05)。

圖3 WesternBlot鑒定血漿外泌體標(biāo)志分子蛋白表達(dá)圖

圖4 NanoSight血漿外泌體粒徑分布圖

3 討論

新疆是食管鱗癌的高發(fā)地區(qū)，食管鱗癌早期癥狀輕微，多數(shù)患者就診時(shí)已存在局部浸潤或/和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良[7]，因此研究食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，延長患者生存時(shí)間、提高患者生存質(zhì)量有重要臨床意義。細(xì)胞外基質(zhì)是癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境，重塑細(xì)胞外基質(zhì)促使腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為改變[8]。

LOXL2 是由774 個(gè)氨基酸組成的87 kDa 的酶蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)膠原和彈性蛋白的交聯(lián)，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤更易發(fā)生局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果顯示LOXL2 在食管鱗癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，同時(shí)腫瘤組織分化程度低、存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期較晚的食管鱗癌患者中LOXL2 的表達(dá)水平相對增高，提示LOXL2 可能參與食管鱗癌的發(fā)生過程，這與陳陽靜等[10]報(bào)道結(jié)果一致。Ninomiya 等[11]研究發(fā)現(xiàn)LOXL2 在肝惡性腫瘤中的表達(dá)異常表達(dá)，并可通過激活Snail 信號通路誘導(dǎo)EMT，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的浸潤、侵襲能力，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。據(jù)以上研究結(jié)果推測LOXL2 在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要促進(jìn)作用，能成為判斷食管鱗癌浸潤、轉(zhuǎn)移的有效生物標(biāo)志物。

I 型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，由兩條COL1A1 和一條COL1A2 構(gòu)成，在一定程度上決定著細(xì)胞外基質(zhì)的最終結(jié)構(gòu)和完整性，為腫瘤細(xì)胞的生長提供依附和支架，在多種腫瘤的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。Chen 等[14]通過分析胃癌患者組織中膠原蛋白家族的差異性，發(fā)現(xiàn)COL1A1 在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，高表達(dá)的患者死亡率是低表達(dá)者2.33 倍，是胃癌預(yù)后不良的因素。Chao 等[15]研究發(fā)現(xiàn)COL1A1 過表達(dá)可激活TGF-β 信號通路促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株的增殖、遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，COL1A1 在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，其異常高表達(dá)與患者局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期晚密切相關(guān)；COL1A1 高表達(dá)在食管鱗癌中發(fā)揮促癌作用，參與食管鱗癌的病情進(jìn)展過程。

本研究通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織中LOXL2 和COL1A1 的表達(dá)水平呈正相關(guān)。Yu等[16]研究與本研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)LOX在口腔鱗癌中高表達(dá)并上調(diào)膠原含量，證實(shí)LOX 可調(diào)控膠原蛋白的表達(dá)。Dinca等[17]從細(xì)胞生物學(xué)方面解釋了LOXL2調(diào)控膠原蛋白I的表達(dá)及排列方式，LOXL2促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白I 纖維交聯(lián)重組和排列導(dǎo)致定向的腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

為進(jìn)一步探索LOXL2 與COL1A1 在食管鱗癌中的調(diào)控機(jī)制，本研究檢測食管鱗癌患者血漿外泌體中LOXL2 的含量。外泌體是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間隙的40～150 nm 的囊泡樣結(jié)構(gòu)，可從親本細(xì)胞中富集DNA、RNA 和蛋白質(zhì)[18]，為細(xì)胞間交互、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的信號傳遞發(fā)揮重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者的血漿外泌體體積明顯增大，富含的LOXL2 蛋白量明顯高于健康對照組。Zhu 等[19]在頭頸部惡性腫瘤的研究中同樣發(fā)現(xiàn)相較于健康組，惡性腫瘤患者的外泌體LOXL2 蛋白表達(dá)量明顯增多，并與不良預(yù)后相關(guān)。Olivier 等[20]研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤分泌的外泌體可介導(dǎo)LOXL2 催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的交聯(lián)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力。據(jù)以上研究結(jié)果推測食管鱗癌中LOXL2 和COL1A1 通過外泌體這一介質(zhì)發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。

綜上所述，LOXL2mRNA 和COL1A1mRNA 在食管鱗癌組織中表達(dá)水平增高，兩者高表達(dá)與腫瘤TNM 分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)兩者表達(dá)呈正相關(guān)，LOXL2和COL1A1可能通過外泌體協(xié)同調(diào)控食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究仍有不足，目前未證實(shí)食管鱗癌中LOXL2 通過外泌體上調(diào)COL1A1 的表達(dá)重塑細(xì)胞外基質(zhì)的直接關(guān)系，有待后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)深入探討明確LOXL2 對COL1A1 調(diào)控作用的具體機(jī)制。