韓 悅，王賁士

（1山東省立第三醫(yī)院胃腸外科，濟南 250031；2山東省腫瘤醫(yī)院胃腸外科，濟南 250106）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于所有惡性腫瘤的第3 位，死亡率位于第2位[1]。癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的重要原因之一，近年來CRC 的防治取得了長足的進步，但是晚期和轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅為15%[2]。因此尋找預(yù)測腫瘤病情進展的標(biāo)記物，探究影響預(yù)后的相關(guān)因素非常重要。微小RNA（miRNA）是單鏈非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平進行負(fù)性調(diào)控[3]。既往研究已證實，miRNA 與CRC 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-371-5p屬于基因間miRNA，miRNA-371-5p 可以抑制CRC LoVo 和SW620 細胞的增殖，對凋亡無明顯影響[6]。本研究檢測CRC 組織及細胞中miRNA-371-5p 的表達，分析miRNA-371-5p 與患者生存預(yù)后的關(guān)系，在體外研究中觀察上調(diào)miRNA-371-5p 對CRC 細胞增殖、侵襲和遷移的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2011 年1 月-2013 年1 月山東省立第三醫(yī)院胃腸外科收治的186 例CRC 患者為研究對象，回顧性分析患者的基本資料：男性112例，女性74例；年齡32～85歲，平均年齡（65.5±6.2）歲；腫瘤位于結(jié)腸88 例，直腸98 例；腫瘤直徑≥5 cm 96 例，<5 cm 90 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86 例，無轉(zhuǎn)移100 例；高分化10例，中分化145 例，低分化31 例；腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類（Tumor node metastasis classification，TNM）分期為Ⅰ期28 例，Ⅱ期58 例，Ⅲ期75 例，Ⅳ期25 例。本研究通過山東省立第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 細胞和試劑結(jié)腸癌細胞HT29、SW480、SW620和HCT116，正常人腸上皮細胞HIEC-6 購于中科院上海細胞庫。胎牛血清（上海浩洋生物科技有限公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海浩洋生物科技有限公司），LipofectAMINETM2000 轉(zhuǎn)染試劑（上海浩洋生物科技有限公司），miRNA-371-5p 模擬物和對照質(zhì)粒（深圳市默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海吉瑪公司），2×SYBR Green PCR Mas?termix 試劑盒（上海吉瑪公司），BCA 蛋白定量試劑盒（上海吉瑪公司），SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海吉瑪公司），Transwell 小室（武漢普諾賽生命科技有限公司），Ki67 抗體（美國Sigma 公司），增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（美國Sigma公司）。

1.3 CRC 組織中miRNA-371-5p 水平的測定取CRC 組織采用miRNA 提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37℃，60 min。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用定量PCR 試劑盒進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃15 min，94℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，共45 個循環(huán)。最后采用PCR 儀檢測，miRNA 相對表達量采用2-△△Ct方法，△Ct=CtmiRNA-CtsnRNA[7]。miRNA-371-5p 引物（上游：5'-tgagaactgaattccatgggtt-3'；下游：5'-ATCTACTCTC TCCAGGTCCTCA-3'）和內(nèi)參基因U6 small nuclear RNA（snRNA）引物（上游：5'-ctcgcttcggcagcagcaca-3'；下游：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'）。

1.4 miRNA-371-5p 模擬物的轉(zhuǎn)染取SW620 細胞，用LipofectAMINETM2000 試劑盒進行轉(zhuǎn)染，步驟如下：首先制備LipofectAMINETM2000 復(fù)合物和DNA 復(fù)合物（1 μg/μL 質(zhì)粒和246 μL 無血清培養(yǎng)基），溫室靜置20 min。將復(fù)合物加入96 孔板，6 h 后更換含血清培養(yǎng)基，溫室繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細胞分為miRNA-NC組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒）和miRNA-371-5p 組（轉(zhuǎn)染miR?NA-371-5p模擬物），轉(zhuǎn)染24 h后備用。

1.5 SW620細胞增殖情況克隆形成實驗：用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的SW620細胞，接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3周。當(dāng)出現(xiàn)菌落時停止培養(yǎng)。用4%多聚甲醛進行固定，30 min后用結(jié)晶紫染色，在低倍顯微鏡（×10）下計數(shù)大于10 個細胞的克隆數(shù)。CCK-8 法：用CCK-8 試劑盒檢測細胞活性，細胞培養(yǎng)24、48、72和96 h時，向每個培養(yǎng)孔中添加10 μLCCK-8試劑，最后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.6 SW620 細胞侵襲和遷移情況遷移實驗：在Transwell 遷移板上室加入5×104個SW620 細胞，下室中加入600 μL 完全培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。固定膜底細胞并進行0.1%結(jié)晶紫染色20 min，光學(xué)顯微鏡下對SW620 細胞數(shù)量進行定量。在侵襲實驗中，使用預(yù)先加入Matrigel 膠的小室，上室中加入5×104個SW620 細胞，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)48 h，其余步驟同遷移實驗。

1.7 蛋白印跡法檢測SW620 細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA 表達水平取用RAPI裂解液提取SW620細胞總蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ki67抗體（1∶1 000）、PCNA 抗體（1∶500），4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗，封閉1 h。ECL 發(fā)光儀進行蛋白成像，Image J 軟件分析灰度值。

1.8 隨訪以門診和電話相結(jié)合方法進行隨訪，隨訪截止時間為2018 年4 月。隨訪時間為54～93 個月。獲得有效隨訪135 例，隨訪率為72.6%。生存時間定義為術(shù)后至因CRC 復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間。分析生存預(yù)后與CRC 組織miRNA-371-5p 表達水平的關(guān)系。分析CRC患者5年生存率的影響因素。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；生存性分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗，采用COX回歸模型分析影響患者預(yù)后的相關(guān)因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織和CRC 細胞中miRNA-371-5p 表達量的比較CRC 組織中miRNA-371-5p的相對表達量為（3.8±1.0），癌旁組織中為（8.5±2.8），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.559，P<0.05）。正常人腸上皮細胞HIEC-6 和結(jié)腸癌細胞株HT29、SW480、SW620 和HCT116 中miRNA-371-5p 相對表達量分別為（4.35±1.01）、（3.04±0.31）、（1.23±0.13）、（2.56±0.49）、（2.10±0.36），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.067，P<0.01），結(jié)腸癌各細胞株miRNA-371-5p 相對表達量均低于正常人腸上皮細胞株HIEC，其中SW620表達量最低。

2.2 miRNA-371-5p 表達量與CRC 患者臨床病理特征的關(guān)系以miRNA-371-5p表達量的中位數(shù)為截點，將所有患者分為低表達量組和高表達量組。分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期高的患者，miR?NA-371-5p表達量越低（P<0.05），見表1。

2.3 miRNA-371-5p 表達量與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系有效隨訪的135 例CRC 患者5 年生存率為64.4%（87/135）。其中miRNA-371-5p高表達組5年生存率為83.8%（62/74），低表達組為41.0%（25/61），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.032，P=0.014）。miRNA-371-5p 高表達組生存時間為（82.6±5.0）個月，低表達組為（59.5±4.2）個月，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.011，P<0.01）,見圖1。

2.4 影響CRC 患者5 年生存率的相關(guān)因素單因素分析表明患者年齡（≥60 歲）、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miRNA-371-5p 低表達是影響CRC 患者5 年生存率的因素（P<0.05）。多因素分析表明患者年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miRNA-371-5p 表達量是影響患者生存率的獨立危險因素（P<0.05），見表2、3。

表3 影響CRC患者5年生存率的多因素Logistic分析

2.5 轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p 模擬物對SW620 細胞增殖、侵襲和遷移的影響對SW620 細胞轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p 模擬物后，SW620 細胞的增殖活力明顯受到抑制（P<0.05），見圖2、3。侵襲和遷移力明顯受到抑制（P<0.05），見圖4、5。Ki67 和PCNA 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），見圖6、7。

圖2 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p模擬物對SW620細胞增殖活力的影響

圖3 克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p模擬物對SW620細胞增殖活力的影響

圖4 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p模擬物對SW620細胞侵襲力的影響

圖5 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p模擬物對SW620細胞遷移的影響

圖6 蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-371-5p模擬物對SW620細胞增殖蛋白Ki67、PCNA表達水平的影響

3 討論

CRC 是我國常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已至中晚期，即使手術(shù)，5 年生存率也僅為25.0%左右[8]。因此，尋找CRC 特異性標(biāo)志物顯得非常重要。既往研究已證實，miRNA 在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[9]。miRNA 的異常表達與CRC 的發(fā)病和預(yù)后密切相關(guān)。miRNA-371-5p屬于基因間miRNA，具有獨立的啟動子區(qū)域。miRNA-371-5p 在不同腫瘤中發(fā)揮的作用也不盡相同。Wang 等[10]發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞中miR?NA-371-5p 的表達量增加，可抑制瘤細胞的增殖、促進凋亡。Li 等[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-371-5p 可靶向作用于SOX2 促進瘤細胞的增殖，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生和進展。miRNA-371-5p 在CRC 中的作用及機制既往報道較少，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-371-5p 在CRC 組織和細胞中低表達，上調(diào)miRNA-371-5p 后CRC 細胞增殖。侵襲和遷移能力受到抑制，與既往報道類似[12]，提示miRNA-371-5p在CRC中可能發(fā)揮抑癌作用。

本研究采用中位數(shù)將患者分為miRNA-371-5p高表達量組和低表達量組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低表達量組分化程度較低、淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移和TNM 分期越高。提示miRNA-371-5p 可能于CRC 的分化和遠處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本組研究中，135 例CRC 患者5 年生存率為64.4%（87/135），這與Miao 等研究一致[13]。影響CRC患者預(yù)后的因素有很多，而且非常復(fù)雜，但是公認(rèn)的有年齡、分化程度、腫瘤分期、遠處轉(zhuǎn)移、免疫狀態(tài)、復(fù)發(fā)等[14-17]。本研究采用Logistic 多因素模型進行分析，發(fā)現(xiàn)年齡（≥60 歲）、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響CRC 患者5 年生存的獨立危險因素，這與張衛(wèi)剛等[18]的研究結(jié)果一致。陳香瀏等[19]檢測了50 例結(jié)直腸癌患者血清中miRNA-21、miRNA-371-5p 和miR?NA-378 的表達水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-371-5p 和miR?NA-21 與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后明顯相關(guān)，本研究結(jié)果與之類似。本研究中，miRNA-371-5p 高表達組5 年生存率為83.8%（62/74），明顯高于低表達組為（41.0%），這就提示miRNA-371-5p 可能作為預(yù)后CRC患者術(shù)后生存時間的標(biāo)記物。

綜上所述miRNA-371-5p 在CRC 組織中低表達，與生存預(yù)后有關(guān)。上調(diào)miRNA-371-5p 可抑制CRC 細胞增殖、侵襲和遷移。本研究也存在一些局限性，例如未檢測外周血中miRNA-371-5p的表達水平，未檢測miRNA-371-5p下游靶基因的表達。未來需要進一步進行機制研究，深入分析miRNA-371-5p在CRC中的作用機制。