韋氏三聯(lián)九針對(duì)視神經(jīng)牽拉傷大鼠閃光視覺誘發(fā)電位的影響

李詩(shī)夢(mèng)，周 劍，韋企平，王 軍，孫 武，王 妍，王 杰，夏燕婷

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院眼科，北京 100078；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院針灸科，北京 100700）

外傷性視神經(jīng)病變（traumatic optic neuropathy，TON）被認(rèn)為是一種臨床治療困難的致盲性眼病。我科韋企平教授是韋氏眼科針灸療法的繼承和發(fā)揚(yáng)者，總結(jié)出臨床效果顯著的韋氏三聯(lián)九針療法，能有效提升視神經(jīng)損傷患者視功能［1?4］，然而，韋氏三聯(lián)九針作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用閃光視覺誘發(fā)電位（flash visual evoked potential，F(xiàn)VEP）觀察韋氏三聯(lián)九針對(duì)視神經(jīng)外傷模型大鼠的視神經(jīng)保護(hù)作用，初步揭示韋氏三聯(lián)九針治療視神經(jīng)損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36 只斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2019?0010］提供的健康成年雄性Wi?star 大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（259.11±11.77）g，于北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司動(dòng)物房飼養(yǎng)，所有大鼠在12 h 明（06∶00～17∶59）/12 h 暗（18∶00～05∶59）、溫度20～25℃、濕度40%～70%、背景噪聲<60 dB 的環(huán)境中喂養(yǎng)。納入標(biāo)準(zhǔn)：直接檢眼鏡查大鼠眼底視網(wǎng)膜及血管無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)動(dòng)物的處置已得到動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

羅蘭電生理動(dòng)物平臺(tái)、華佗牌一次性針灸針，規(guī)格：0.25 mm×13 mm，生產(chǎn)廠家：蘇州醫(yī)療用品有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：蘇食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012 第2270884 號(hào)。

1.3 分組及模型制備

我科前期研究［5?7］表明橫向定量牽拉法造成大鼠TON 模型可控性較強(qiáng)，故采用該法進(jìn)行造模。大鼠眼底直接檢眼鏡檢查未見異常者，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱重、編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表分為4 組，每組9 只。造模均采用大鼠的右眼，將其中18 只大鼠采用橫向定量牽拉法制作TON 模型后隨機(jī)分為韋氏三聯(lián)九針組和模型組，各9 只，腹腔注射10% 水合氯醛（10 mL/kg）麻醉，眼球涂卡波姆凝膠。從顳側(cè)剪開大鼠右眼眶上緣皮膚，鈍性分離至眶尖將視神經(jīng)充分暴露，必要時(shí)切除眶脂肪保證操作空間。在球后1～2 mm 處，取6?0 聚酯縫合線將視神經(jīng)扎緊?？p線另一端接壓力張力計(jì)并施加0.30 N 拉力將視神經(jīng)垂直牽拉，保持20 s。納入實(shí)驗(yàn)者需術(shù)眼出現(xiàn)瞳孔擴(kuò)張、直接對(duì)光反射消失、間接對(duì)光反射存在、眼底未見出血或血管阻塞、視網(wǎng)膜蒼白缺血未達(dá)5 min，否則剔除。9 只假手術(shù)組的大鼠完成術(shù)前檢查和常規(guī)麻醉后，依照上法分離出部分眶脂肪后暴露視神經(jīng)，不做牽拉處理。術(shù)后將各組大鼠皮膚縫合，涂紅霉素眼膏，回籠飼養(yǎng)。另有9只大鼠作為正常對(duì)照不處理。

1.4 干預(yù)方法

造模成功后次日，韋氏三聯(lián)九針組開始針刺干預(yù)，取韋氏三聯(lián)九針代表穴：一聯(lián)：“睛明”、“承泣”；二 聯(lián)：“絲 竹 空”透“太 陽(yáng)”；三 聯(lián)：“風(fēng) 池”、“太 沖”。其中一聯(lián)和二聯(lián)腧穴取患側(cè)，三聯(lián)腧穴取雙側(cè)。一聯(lián)腧穴不行針，余穴平補(bǔ)平瀉。每日針刺一次，留針20 min，治療14 d。按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］、《大鼠斷層解剖彩色圖譜》［9］定位取穴。（1）睛明：上下眼瞼與內(nèi)眼角交界處。刺法：將眼球向外推，向內(nèi)下方斜刺。（2）承泣：瞳孔直下當(dāng)眶下緣與眼球之間。刺法：上推眼球，沿眶下緣上方直刺。（3）絲竹空：頭側(cè)部，眼外上方眶骨凹陷處。（4）太陽(yáng)：目外眥后上方顳窩中。刺法：絲竹空向太陽(yáng)透刺。（5）風(fēng)池：項(xiàng)部，當(dāng)兩耳后角連線中點(diǎn)與耳后角外1/3 和內(nèi)2/3 處。刺法：向后下方斜刺0.5～0.8 cm，平補(bǔ)平瀉。（6）太沖：后肢足背第1、2 跖骨間凹陷。刺法：直刺1 mm，平補(bǔ)平瀉。

所有大鼠于干預(yù)后第1、7、14 天采用羅蘭電生理動(dòng)物平臺(tái)進(jìn)行FVEP 檢查，選取阻抗小于15 kΩ的銀針電極。枕骨隆凸上方3 mm 處置記錄電極，于雙眼連線中點(diǎn)處接參考電極，同側(cè)耳廓處連接地電極。閃爍刺激參數(shù)：閃光頻率2 Hz，閃爍次數(shù)80次，閃爍光亮度10 dB。每只眼連續(xù)測(cè)量至少3 次，每次間隔10 min。檢測(cè)1 只眼時(shí)，對(duì)側(cè)眼用不透光黑布完全遮蓋。每只眼記錄穩(wěn)定波形3 次。記錄波型的潛伏期和振幅。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0 軟件。若滿足正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，則進(jìn)行方差分析，運(yùn)用LSD?t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。若不符合正態(tài)分布、方差齊性，將應(yīng)用Kruskal Wallis 進(jìn)行組間檢驗(yàn)，多重比較則選用Bonferroni 秩和檢驗(yàn)校正P值。P<0.05 則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由于大鼠FVEP 圖譜中各組重復(fù)測(cè)量均具有較好的同質(zhì)性，對(duì)N2?P2 波的識(shí)別度較高，本研究以N2?P2 波為中心開展統(tǒng)計(jì)分析。參考國(guó)際視覺電生理標(biāo)準(zhǔn)，由起始至N2 波出現(xiàn)的時(shí)長(zhǎng)為N2 波潛伏期值，由起始至P2 波出現(xiàn)的時(shí)長(zhǎng)為P2 波潛伏期值，由N2 波谷至P2 波峰的起伏差為N2?P2 波振幅值，通過以上3 組指標(biāo)綜合評(píng)估大鼠視功能情況，結(jié)果見表1～3。1、7、14 d 各組代表波形見圖1～3。

圖1 1 d 各組代表波形Fig 1 Representative waveforms of each group on 1 d

表1 N2 波潛伏期（ms，n=9，±s）Tab 1 Latency of N2 waves（ms，n=9，±s）

表1 N2 波潛伏期（ms，n=9，±s）Tab 1 Latency of N2 waves（ms，n=9，±s）

注：與模型組相比，*P<0.05，#P<0.01;與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，▲P<0.01。

14 d 105.53±6.31 111.07±18.22▲92.17±9.17 96.47±14.46 4.148組別韋氏三聯(lián)九針組模型組假手術(shù)組正常對(duì)照組F 1 d 96.34±9.17*107.81±7.08▲85.27±4.61 89.65±11.84 9.947 7 d 96.03±12.41#113.76±12.80▲90.08±7.95 87.81±7.90 16.847

表2 P2 波潛伏期（ms，n=9，±s）Tab 2 Latency of P2 waves（ms，n=9，±s）

表2 P2 波潛伏期（ms，n=9，±s）Tab 2 Latency of P2 waves（ms，n=9，±s）

注：與模型組相比，*P<0.05，#P<0.01;與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，▲P<0.01。

組別韋氏三聯(lián)九針組模型組1 d 115.12±7.43*140.38±10.65▲7 d 133.48±16.09 141.22±8.58▲14 d 123.67±7.12#139.97±10.26▲113.03±11.01 116.83±17.07 7.388假手術(shù)組正常對(duì)照組F 107.82±13.13 111.65±12.18 16.353 111.77±12.01 110.29±11.52 20.270

表3 N2?P2 波振幅（μV，n=9，±s）Tab 3 Amplitude of N2?P2 waves（μV，n=9，±s）

表3 N2?P2 波振幅（μV，n=9，±s）Tab 3 Amplitude of N2?P2 waves（μV，n=9，±s）

注：與模型組相比，*P<0.05。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，#P<0.01，▲P<0.05。

14 d 8.18±4.16*4.26±1.38▲8.59±2.52 7.00±4.03 2.733組別韋氏三聯(lián)九針組模型組假手術(shù)組正常對(duì)照組F 1 d 8.08±3.73 8.40±7.07 9.51±7.79 7.65±5.30 7.972 7 d 7.97±2.73*4.83±1.08#10.22±3.61 9.16±3.05 6.483

圖2 7 d 各組代表波形Fig 2 Representative waveforms of each group on 7 d

圖3 14 d 各組代表波形Fig 3 Representative waveforms of each group on 14 d

2.1 模型組、假手術(shù)組與正常對(duì)照組比較

與正常對(duì)照組相比，假手術(shù)組在1、7、14 d 時(shí)，N2 波 峰 潛 伏 期、P2 波 峰 潛 伏 期 和N2?P2 波 振 幅 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而模型組與正常對(duì)照組及假手術(shù)組相比，1 d 時(shí)模型組N2 波峰潛伏期、P2 波峰潛伏期均較假手術(shù)組和正常對(duì)照組延長(zhǎng)（P<0.01），P2 振波幅無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。7 d 和14 d 時(shí)，模型組N2 波峰潛伏期、P2 波峰潛伏期均較假手術(shù)組和正常對(duì)照組延長(zhǎng)（P<0.01），N2?P2 波振幅均較假手術(shù)組和正常對(duì)照組降低（P<0.05）。見表1～3。

2.2 韋氏三聯(lián)九針組與模型組比較

與模型組相比，1 d 時(shí)韋氏三聯(lián)九針組N2 波潛伏期、P2 波潛伏期均縮短（P<0.05），N2?P2 波振幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。7 d 時(shí)，韋氏三聯(lián)九針組N2 波潛伏期較模型組縮短（P<0.01），N2?P2波振幅較模型組提高（P<0.05），此時(shí)P2 波潛伏期雖然也有縮減趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。14 d 時(shí)，韋氏三聯(lián)九針組P2 波潛伏期較模型組縮短（P<0.05），N2?P2 波振幅較模型組提高（P<0.05），此時(shí)N2 波潛伏期雖然也有縮減趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1～3。

2.3 組內(nèi)比較

假手術(shù)組1、7、14 d 的N2 波潛伏期、P2 波潛伏期與N2?P2 波振幅差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組振幅一直在降低，在14 d 與1 d 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組的N2 波潛伏期與P2 波潛伏期延遲的情況在1～14 d 一直未得到改善（P>0.05）。而韋氏三聯(lián)九針組N2 波潛伏期延遲在7～14 d 才出現(xiàn)明顯差異（P<0.05）；其P2 波峰雖然在1～7 d 明顯延遲（P<0.05），但到了14 d 其P2波峰延遲有所恢復(fù)，達(dá)到與1 d 和7 d 的水平（P>0.05）。韋氏三聯(lián)九針組N2?P2 波振幅在1～14 d 期間亦無(wú)明顯降低（P>0.05）。

3 討論

TON 臨床表現(xiàn)包括視功能障礙、眼底病變和相對(duì)性傳入性瞳孔阻滯等，由于直接或間接暴力作用于眼或顱眶區(qū)，造成視神經(jīng)損傷?；颊咭暳υ趽p傷出現(xiàn)后或可急劇減退至指數(shù)、光感甚至無(wú)光感。TON 已成為國(guó)內(nèi)重要的致盲眼病［10］。臨床多使用大劑量甲強(qiáng)龍沖擊的經(jīng)驗(yàn)式治療，或者聯(lián)合視神經(jīng)管減壓。但近年的多個(gè)研究表明無(wú)論單用或聯(lián)合手術(shù)均不能明顯改善TON 的預(yù)后［11，12］，多數(shù)重病患者預(yù)后不佳。

中醫(yī)認(rèn)為TON 所屬“撞擊暴盲”的范疇。撞擊直損目系之脈絡(luò)，不能統(tǒng)攝血液，血溢絡(luò)外，造成血瘀，抑或撞擊損傷眼之真氣，造成目系之脈絡(luò)不暢，氣血郁滯其中，皆可引起目系失于滋養(yǎng)，終致萎廢不用。故脈絡(luò)受損，氣血郁滯為主要病機(jī)。針刺治療本病的理論基礎(chǔ)誠(chéng)如《靈樞?口問》所云“目者，宗脈之所聚也”，眼視物辨色的生理功能需靠臟腑之氣血榮養(yǎng)，而這一作用的發(fā)揮離不開經(jīng)絡(luò)貫通并不斷運(yùn)輸氣血。有研究表明針刺干預(yù)非動(dòng)脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變兔眼模型療效確切，尤其是眶內(nèi)聯(lián)合眶外取穴［13］。

“韋氏三聯(lián)九針”是燕京韋氏眼科臨床實(shí)踐與學(xué)術(shù)傳承中的瑰寶，其針灸處方將深刺近眼三針作為第一聯(lián)，將透刺眼周腧穴作為第二聯(lián)，將辨證論治、全身取穴作為第三聯(lián)。本課題組既往臨床研究顯示，韋氏三聯(lián)九針療法可治療視神經(jīng)萎縮患者，包括外傷性視神經(jīng)萎縮患者，可提升視力，改善視野情況［1?4］，并且促使圖形視覺誘發(fā)電位（pattern vi?sual evoked potential，PVEP）出現(xiàn)易化效應(yīng)，縮減P100 波 潛伏期［14，15］。本研究旨在探 討韋氏三聯(lián)九針治療TON 的作用機(jī)制。

橫向定量牽拉法能夠?qū)⒁暽窠?jīng)直觀暴露后開展定量損傷操作，其產(chǎn)生的視神經(jīng)機(jī)械損傷和局部組織缺血與臨床中TON 引起的病理變化相似，用于本實(shí)驗(yàn)造模較為理想［5］。前期研究顯示，將大鼠視神經(jīng)以0.1 N 垂直牽拉20 s，即可建立視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞部分喪失的TON 模型［6，7］。

及時(shí)了解視功能變化在視神經(jīng)損傷后指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后方面至關(guān)重要，然而多方面因素均能對(duì)主觀視功能指標(biāo)產(chǎn)生影響，并且常存在伴隨顱腦外傷引起昏迷的TON 患者。因此，在無(wú)法開展主觀視功能檢查時(shí)，客觀而敏感的視覺電生理指標(biāo)極具價(jià)值，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中更是如此。FVEP 作為評(píng)價(jià)視神經(jīng)損傷的重要方法，可以通過觀察其波幅的降低趨勢(shì)和波峰的潛伏期來(lái)評(píng)價(jià)從視網(wǎng)膜到視皮層之間視路的功能。FVEP 的波形中P2 波最穩(wěn)定，且相當(dāng)于臨床中PVEP 的P100 波，能反映TON 大鼠視覺功能障礙水平［16］，被廣泛應(yīng)用于視神經(jīng)保護(hù)的基 礎(chǔ) 及 臨 床 研 究 中［17?19］，故 本 實(shí) 驗(yàn) 統(tǒng) 計(jì) 分 析 圍 繞N2?P2 波進(jìn)行。

本研究以橫向定量牽拉法造模，觀察韋氏三聯(lián)九針對(duì)視神經(jīng)損傷大鼠FVEP 的影響。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠造模眼在0.3 N 垂直牽拉20 s 后，24 h 內(nèi)的FVEP 波形與正常對(duì)照組相比有明顯的變化。在所有時(shí)間點(diǎn)上，模型組和正常對(duì)照組在波幅和峰值潛伏期上都有明顯的差異。既往研究證實(shí)，視神經(jīng)傳導(dǎo)能力下降FVEP 可表現(xiàn)出潛伏期延遲；其軸索數(shù)量下降可呈現(xiàn)為FVEP 振幅下降。

本實(shí)驗(yàn)一聯(lián)深刺，取穴睛明配合承泣泄熱明目，祛風(fēng)通絡(luò)。第二聯(lián)腧穴應(yīng)用橫透刺法，刺激面積較廣，因而刺激量較大，臨床中有助于增強(qiáng)行氣活血之療效，更可減少針刺破皮次數(shù)，減輕患者刺痛感。取眼周手少陽(yáng)經(jīng)之絲竹空透經(jīng)外奇穴之太陽(yáng)，以期將旺盛之足陽(yáng)經(jīng)氣血導(dǎo)入經(jīng)外奇穴。第三聯(lián)腧穴選用風(fēng)池疏風(fēng)解表、清利頭目；配合太沖，其為“四關(guān)穴”之一，具有行氣活血，疏通經(jīng)絡(luò)的功效，并且是肝之原穴，肝開竊于目，可疏調(diào)肝之原氣上達(dá)于目［20］。韋氏三聯(lián)九針療法通經(jīng)脈，調(diào)氣血，疏壅蔽，營(yíng)逆順出入之會(huì)，流暢氣血精津出入之路，方奏改善視神經(jīng)機(jī)能之功，保護(hù)視功能。在本研究中，建立實(shí)驗(yàn)大鼠TON 模型次日予以韋氏三聯(lián)九針治療，可顯著延緩視神經(jīng)損傷。我們發(fā)現(xiàn)，韋氏三聯(lián)九針組N2?P2 波振幅比模型組振幅下降得更平緩，其N2 和P2 波峰潛伏期較模型組縮減。同時(shí)，韋氏三聯(lián)九針組P2 波峰潛伏期在7～14 d 有所改善，而模型組的結(jié)果則完全相反，說(shuō)明模型組的視神經(jīng)損傷是不可逆轉(zhuǎn)的。

本研究采用橫向定向牽拉法造成大鼠TON 模型后，次日可見模型組FVEP 電生理信號(hào)N2?P2 波幅和N2、P2 波峰潛伏期異常，提示視神經(jīng)功能下降。此時(shí)，予以韋氏三聯(lián)九針治療，相較于未予干預(yù)而視覺電生理信號(hào)持續(xù)惡化的模型組而言，有助于改善TON 大鼠視神經(jīng)部分損傷后FVEP 電生理信號(hào)N2?P2 波振幅降低的情況，縮減其N2、P2 波峰延遲，延緩病情的進(jìn)展。因此可以認(rèn)為韋氏三聯(lián)九針對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)有一定的積極作用，可一定程度地恢復(fù)視神經(jīng)功能。本研究從功能學(xué)的角度論證了橫向定量牽拉法建立大鼠TON 模型的可行性，證明了韋氏三聯(lián)九針治療TON 有明顯的療效，可能與其具有改善視神經(jīng)傳導(dǎo)功能、保護(hù)尚未變性壞死的RGCs 作用有關(guān)，為臨床治療TON 提供了新的思路。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

李詩(shī)夢(mèng)、王軍、孫武、王妍、王杰：參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，指標(biāo)檢測(cè)，撰寫論文；周劍、韋企平：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；夏燕婷：論文指導(dǎo)，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人。

所有作者聲明無(wú)利益沖突。